色谱  2017, Vol. 35 Issue (6): 587-593   PDF    
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董浩
于洋
晏嘉泽
靳艳
利用高效液相色谱-串联质谱追踪酸奶发酵过程中的酪蛋白磷酸肽
董浩1,2 , 于洋1 , 晏嘉泽1 , 靳艳1     
1. 中国科学院大连化学物理研究所, 中国科学院分离分析化学重点实验室, 国家色谱研究分析中心, 辽宁 大连 116023;
2. 中国科学院大学, 北京 100049
收稿日期：2017-03-09
基金项目：中国科学院分离分析化学重点实验室开放基金（KL-1602）
通讯联系人：靳艳, Tel:(0411)84379576, E-mail:yanjin@dicp.ac.cn
摘要：酪蛋白磷酸肽（CPPs）是酪蛋白被磷酸化的片段，具有促进矿物元素吸收、抗氧化、预防龋齿等多种生物功能。该文利用高效液相色谱-串联质谱研究牛奶经嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）和保加利亚乳杆菌（Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus）发酵后CPPs的释放规律。结果表明，在内源性蛋白酶的作用下牛奶含内源性CPPs，内源性CPPs主要来源于高丰度酪蛋白αs1-CN和β-CN。经乳酸菌发酵后，在乳酸菌蛋白酶的作用下更多酪蛋白的磷酸化位点暴露而产生大量CPPs，其中含SpSpSpEE特征结构的CPPs也在酸奶中检测到，CPPs的释放与酪蛋白结构密切相关。研究结果表明，牛奶经乳酸菌发酵后释放大量含特征结构SpSpSpEE的CPPs，可提高结合矿物元素的能力，从而增强其促进人体健康的生物功能。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    酪蛋白磷酸肽    乳酸菌    酸奶    
Tracking casein phosphopeptides during fermentation by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
DONG Hao1,2, YU Yang1, YAN Jiaze1, JIN Yan1     
1. Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, National Chromatographic R & A Center, Dalian Institute of Chemical Physics, Chinese Academy of Sciences, Dalian 116023, China;
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
Foundation item: Financial Support by Key Laboratory of Separation Sciences for Analytical Chemistry, Chinese Academy of Sciences (No. KL-1602)
Abstract: Casein phosphopeptides (CPPs) are phosphorylated fragments of casein, which have a variety of biological functions such as promotion of mineral absorption, antioxidation and prevention of dental caries. This study investigated CPPs in milk and yogurt fermented by Lb. bulgaricus (Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus) and S. thermophilus (Streptococcus thermophilus) with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry. The results showed that milk contained endogenous CPPs, which were mainly derived from high abundance of caseins αs1-CN and β-CN, in the role of endogenous protease. After milk fermented with Lb. bulgaricus and S. thermophilus, more CPPs and phosphorylation sites were released in the action of lactic acid bacteria proteases. The CPPs with the character of SpSpSpEE were identified in yogurt. The structure of caseins played an important role in CPPs releasing in the process of fermentation. In conclusion, fermentation by lactic acid bacteria is helpful to release CPPs containing SpSpSpEE, which can promote mineral absorption.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     casein phosphopeptides (CPPs)     lactic acid bacteria     yogurt    

酪蛋白磷酸肽(casein phosphopeptides, CPPs)是酪蛋白被磷酸化的片段。CPPs不仅具有抗氧化功能, CPPs上的磷酸根还可与钙、锌等离子结合, 提高这些矿物元素在人体消化系统中的溶解性, 因此CPPs具有促进人体所需矿物元素吸收的作用[1]。CPPs还可为牙釉质补充矿物质, 从而达到预防龋齿、保持口腔健康的目的[2, 3], CPPs已在食品、口腔制品中得到应用[4, 5]。酸奶是传统的健康食品, 酸奶的制备过程就是肽的生成过程, 乳蛋白在乳酸菌蛋白酶的作用下降解产生CPPs。研究乳酸菌发酵过程中CPPs的变化规律, 对于制备富含CPPs的乳制品具有重要的意义。

生物质谱技术的不断进步和高效富集磷酸肽方法的发展, 实现了蛋白质磷酸化位点的高通量鉴定与筛选[6-8]。固定金属离子亲和色谱法(ion metal affinity chromatography, IMAC)是目前广泛应用的磷酸化肽段富集方法, 其原理为带正电的金属离子与带负电的磷酸根基团通过静电相互作用结合[9]。固定化钛离子亲和色谱法(Ti4+-IMAC)在磷酸肽富集方面表现出高的特异性和富集灵敏度[10]。本文利用制备酸奶的常用菌株嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus, S. thermophilus)和保加利亚乳杆菌(Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus, Lb. bulgaricus)发酵牛奶, 利用Ti4+-IMAC特异性富集牛奶及酸奶中的CPPs, 高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)分析CPPs, 研究在乳酸菌作用下CPPs的释放规律, 以期为制备富含CPPs的酸奶提供理论依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

纳升级高效液相色谱-串联质谱(nano-HPLC-MS/MS)由四元梯度泵、自动进样器和LTQ线性离子阱质谱/Orbitrap轨道肼回旋共振质谱仪组成, 购自美国Thermo Fisher公司。

乙腈(ACN, 色谱纯, 美国Thermo Fisher公司); 氨水(NH3·H2O, 质量分数为25%; Merck公司); 三氟乙酸(TFA, 色谱纯)、甲酸(FA, 色谱纯)、氯化钠(NaCl, 分析纯)购自Sigma公司; 硫酸钛(Ti(SO4)2, 北京国药集团); 脱脂奶粉(内蒙古伊利集团); S. thermophilus (CICC6038) 和Lb. bulgaricus (CICC6047) 购自国家菌种保藏中心(CICC); C18AQ色谱填料(5 μm, 120×10-10 m)购自日本DAISO Chemical公司; 内径为75 μm和200 μm的石英毛细管购自美国Polymicro Technologies公司; 实验用水由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制得。

1.2 乳酸菌发酵

将Lb. bulgaricus和S. thermophilus分别接种到42 ℃和45 ℃含质量体积分数为12%的脱脂奶粉溶液中培养24 h, 然后将相应菌种转接到新鲜的含质量体积分数为12%的脱脂奶粉溶液中, 在相同条件下培养24 h, 再次重复以上操作使菌株恢复活力。将已活化的菌种按1:1(v/v)接种到200 mL质量体积分数为12%的脱脂奶粉溶液中, 培养发酵12 h。每个样品设置2个平行对照。对发酵前后的牛奶样品发酵液进行取样。

1.3 磷酸肽富集

采用本实验室研制的Ti4+-IMAC单分散微球对磷酸肽进行富集[11]。首先, 将Ti4+-IMAC单分散微球分散于含体积分数为80%的ACN和体积分数为6%的TFA混合溶液中, 然后加入牛奶样品发酵液。控制Ti4+-IMAC微球与蛋白质质量比为1:10, 室温振荡30 min后, 以20 000 g的转速离心3 min除去上清液; 然后用含有200 mmol/L NaCl的体积分数为50%的ACN和体积分数为6%的TFA混合溶液洗涤小球, 室温振荡30 min, 以20 000 g的转速离心3 min去上清, 洗去非特异性吸附肽段; 再用含体积分数为30%的ACN和体积分数为0.1%的TFA混合溶液洗涤两次, 以20 000 g的转速离心3 min, 去上清, 达到除盐的目的; 最后用质量分数为10%的氨水将结合在Ti4+-IMAC微球上的磷酸肽洗脱下来, 以20 000 g的转速离心5 min, 取上清, 冻干后备用。

1.4 色谱条件

样品上样预柱为内径200 μm、长3 cm的C18填充毛细管柱, 所需C18 AQ填料粒径为5 μm。分析柱为自制带ESI喷针的毛细管柱(内径为75 μm), 即先用丁烷气体喷灯烧熔毛细管柱的一端后拉成内径小于3 μm的尖端, 然后利用气压法将粒径为3 μm的C18 AQ填料填充到毛细管柱中, 长度大约为12 cm。流动相A:体积分数为0.1%的甲酸水溶液; 流动相B:体积分数为0.1%的甲酸乙腈溶液。梯度洗脱程序:0~2 min, 0~5%B; 2~95 min, 5%B~35%B; 95~100 min, 35%B~80%B; 100~108 min, 80%B; 108~120 min, 100%A。

1.5 质谱条件

质谱采用正离子模式检测, 离子喷雾电压为1.8 kV, 离子传输加热毛细管温度为200 ℃, 扫描范围为m/z 400~2 000, 归一化碰撞能量为35%。所有谱图均在数据依赖模式(DDA)下进行采集, 一级质谱在Orbitrap检测器中采集, 二级质谱在LTQ线性离子阱中采集。动态排除设置为:重复次数为2, 重复持续时间为30 s, 动态排除时间为90 s。每个样品质谱检测两次, 筛选两次鉴定结果中重复的CPPs作为鉴定结果。

1.6 数据库检索和数据处理

首先, 通过Proteome Discoverer (version 1.2.0) 软件将质谱采集的RAW文件转变为.mgf格式。然后通过Mascot (version 2.3.0) 软件进行数据库检索[12], 所用的数据库为牛源蛋白质数据库, 来自http:/ /www.uniprot.org。检索参数为:无酶酶切; 可变修饰设定甲硫氨酸(Met)氧化修饰(+15.995 Da); 丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)和酪氨酸(Tyr)磷酸化修饰(+79.966 Da); 母离子质量容忍度设为20 ppm(10-6); 碎片离子质量容忍度设为0.8 Da。导出肽筛选标准:得分值大于20, 鉴定结果的假阳性率小于1%。

2 结果与讨论
2.1 牛奶及酸奶中鉴定到的磷酸化肽

由αs1-CN、αs2-CN、β-CN和κ-CN组成的酪蛋白占牛奶总蛋白质含量的80%。利用HPLC-MS/MS对牛奶进行分析, 鉴定CPPs和磷酸化位点, 结果见图 1。牛奶中鉴定到108个CPPs, 其中源于αs1-CN的有30个、源于αs2-CN的有22个、源于β-CN的有43个、源于κ-CN的有13个。牛奶发酵前所鉴定到的CPPs, 是酪蛋白在纤溶酶、组织蛋白酶等内源性蛋白酶的作用产生的内源性肽[13]。酪蛋白所产生的内源性CPPs与其在乳蛋白中的含量密切相关, 酪蛋白中αs1-CN占34%、αs2-CN占8%、β-CN占25%、κ-CN占9%。可以看出, 丰度较高的αs1-CN和β-CN所产生的CPPs的数量也较多。

图 1 牛奶中的内源性酪蛋白磷酸肽肽谱 Fig. 1 Peptide spectra of endogenous casein phosphopeptides (CPPs) in milk

Lb. bulgaricus和S. thermophilus是常用来制备酸奶的菌种, 发酵过程中酪蛋白在乳酸菌的蛋白酶作用下被降解而释放出相对分子质量不同的肽, 关于Lb. bulgaricus和S. thermophilus的蛋白酶体系的研究已有很多文献报道[14, 15]。本研究对发酵后酸奶中的CPPs进行富集分析(见图 2), 共鉴定到176个CPPs, 其中源于αs1-CN的有58个、源于αs2-CN的有24个、源于β-CN的有61个、源于κ-CN的有33个。与牛奶中的内源性CPPs相比, 酸奶中所鉴定到的CPPs数量增多, 其中高丰度酪蛋白αs1-CN和β-CN释放CPPs的优势更加明显。图 3是牛奶及酸奶中鉴定到的CPPs的维恩图, 可以看出, 经过乳酸菌发酵后只有22个CPPs与内源性CPPs是相同的, 其中有11个是来源于β-CN f(27~57) 的区域。新产生的CPPs(154个)占绝大多数, 说明乳酸菌与牛奶内源性蛋白酶的特异性有较大差别。发酵前后的CPPs结果表明, 酸奶比牛奶拥有更加丰富多样的CPPs。

图 2 发酵后的CPPs肽谱 Fig. 2 Peptide spectra of CPPs after fermentation

图 3 牛奶及经保加利亚菌和嗜热链球菌发酵制备的酸奶中所鉴定到CPPs Fig. 3 CPPs identified in milk and yogurt fermented by Lactobacillus debrueckii subsp. bulgaricus and Streptococcus thermophilus

无论内源性蛋白酶降解还是乳酸菌蛋白酶体系降解, 产生CPPs的区域均与酪蛋白的结构密切相关。β-CN的结构疏松, 易与蛋白酶作用而被降解[16], 而易被降解的结构与其25%的高丰度使发酵前后β-CN所产生的CPPs的数量均最多。同样, 具有疏松结构的αs1-CN的N末端(30~60)、κ-CN的C末端(107~169)[17]均是产生CPPs的主要区域。

2.2 牛奶及酸奶中所鉴定到的磷酸化位点

未经乳酸菌发酵的牛奶中共鉴定到30个磷酸化位点, 包括20个丝氨酸磷酸化位点(S)和10个苏氨酸磷酸化位点(T)。牛奶经Lb. bulgaricus和S. thermophilus发酵后的酸奶中鉴定到37个磷酸化位点, 包括27个丝氨酸磷酸化位点和10个苏氨酸磷酸化位点。真核生物中, 蛋白质磷酸化主要发生在丝氨酸、苏氨酸的羟基上, 酪氨酸磷酸化的机率远远小于前两者, 三者的丰度比一般认为是1 800:200:1[18]。目前酪蛋白中只鉴定到了丝氨酸和苏氨酸的磷酸化位点, 本研究中鉴定到磷酸化位点共42个, 包括29个丝氨酸磷酸化位点和13个苏氨酸磷酸化位点, 其中αs1-CN有12个、αs2-CN有15个、β-CN有8个、κ-CN有7个。一个磷酸化位点可产生多个CPPs, 如图 2中αs1-CN磷酸化位点S115共产生9个CPPs。因此42个磷酸化位点数明显少于牛奶和酸奶中鉴定到的262个CPPs。表 1列出了牛奶及酸奶特有的磷酸化位点。可以看出, 经过乳酸菌发酵后的酸奶除了β-CN外, 其余3个酪蛋白均暴露出更多新的磷酸化位点。由于β-CN的结构疏松在内源性蛋白酶的作用下就可使其磷酸化位点均被暴露, 因此发酵前后磷酸化位点没有变化。而其他3个酪蛋白则在乳酸菌蛋白酶的作用暴露出更多的磷酸化位点, 因此发酵后产生更多的CPPs。

表 1 牛奶及酸奶中特有的磷酸化位点 Table 1 Unique phosphorylation sites identified in milk and yogurt
2.3 CPPs的特征区域SpSpSpEE

SpSpSpEE是CPPs的特征片段, SpSpSpEE与二价矿物离子形成可溶性有机磷酸盐, 促进多种矿物元素在人体内的吸收, 因此SpSpSpEE的含量与CPPs的功能特性直接相关[19]。表 2是牛奶及酸奶中鉴定到的CPPs的构成, 牛奶中的108条内源性CPPs绝大部分以单磷酸化形式(phosphorylation, P)存在, 只有5个2P CPPs和2个3P CPPs, 没有鉴定到具有SpSpSpEE结构的CPPs。经过乳酸菌发酵之后, 大量酪蛋白被乳酸菌蛋白酶酶解, 鉴定到的多磷酸化CPPs显著增加。

表 2 牛奶及酸奶中特有的磷酸化位点 Table 2 Unique phosphorylation sites identified in milk and yogurt

酸奶中鉴定到的2个5P CPPs为αs1-CN(61~83) 和(62~84), 10个4P CPPs为αs1-CN(62~79)、αs2-CN(1~17)、αs2-CN(6~23)、β-CN(7~25)、β-CN(6~29)、β-CN(5~28)、β-CN(7~31)、β-CN(1~27)、β-CN(1~30) 和β-CN(1~31)。以上5P和4P的CPPs均含SpSpSpEE, 来自αs1-CN(61~84)、αs2-CN(1~23) 和β-CN(1~31)。说明乳酸菌的蛋白酶系统可释放内源性蛋白酶无法降解的含有SpSpSpEE序列的CPPs。因此乳酸菌发酵制备酸奶可显著提高含SpSpSpEE的CPPs, 从而提高其结合矿物元素的能力。

3 结论

本文利用HPLC-MS/MS研究了牛奶内源性及经Lb. bulgaricus和S. thermophilus发酵后的酸奶中CPPs和磷酸化位点的变化。牛奶中存在大量内源性的CPPs, CPPs数量与其母体蛋白质的丰度密切相关, 在乳酸菌蛋白酶的作用下, 大量的CPPs被释放, 母体蛋白质的结构直接影响CPPs的数量。乳酸菌发酵后使更多隐藏在酪蛋白中的磷酸化位点暴露, 特别是隐藏在αs1-CN的丝氨酸磷酸化位点暴露最多。SpSpSpEE是CPPs的特征结构, 内源性蛋白酶无法产生含有SpSpSpEE的CPPs, 乳酸菌蛋白酶促使含SpSpSpEE的CPPs被释放。综上所述, 乳酸菌发酵可生成大量含SpSpSpEE的CPPs, 从而提高CPPs促进矿物元素在人体吸收的功能。

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