罂粟壳(pericarpium papaveris)当中含有20多种生物碱, 其中主要成分为那可丁(narcotine)、罂粟碱(papaverine)、可待因(codeine)、吗啡(morphine)和蒂巴因(thebaine)5种^[1]。食用这些生物碱会使人嗜睡和性格改变, 并能造成食用者在心理、生理上产生强烈的依赖性(即成瘾), 而长期食用则会导致精神失常、出现幻觉, 更有甚者会因呼吸停止而死亡^[2]。因此, 常有不法商贩利用罂粟壳的成瘾特性, 在食品中尤其是火锅底料、肉汤、调味料中进行非法添加, 使消费者成瘾, 以此来增加客源、牟取暴利。为此, 国际相关条约及公安部、国家卫计委、国家药品监督管理局相关法规规定严禁在食品中添加罂粟壳, 并通过对那可丁、蒂巴因、可待因、吗啡、罂粟碱的检测来监测精神药物、麻醉品及罂粟壳的使用情况^[3]。因此, 建立火锅底料、肉汤、调味料中5种生物碱的检测方法变得尤为重要。

目前, 蒂巴因、吗啡、罂粟碱、那可丁、可待因的检测方法主要有定性鉴别^[3]、薄层色谱法^[3]、极谱法^[4]、免疫测定法^[4]、气相色谱法^[5]、气相色谱-质谱法^[6]、高效液相色谱法(HPLC)^[7]、高效液相色谱-串联四极杆质谱法(HPLC-MS/MS)^[8-11]。其中, 采用气相色谱法和气相色谱-质谱法进行检测时, 样品前处理需要衍生化, 操作繁琐; 酶联免疫吸附测定法(ELISA)的特异性较差且存在交叉反应; HPLC的灵敏度较低。而现有常用方法HPLC-MS/MS需要经过称样、提取、去油脂、固相萃取柱净化、浓缩、HPLC-MS/MS检测6个步骤^[12]。检测单个样品的耗时时长为2~3 h, 面临大批量样品时, 该项目的检测将成为实验室的负担, 成本较高, 溶剂消耗量较大, 且很难在短时间内完成大批量样品的检测。

实时直接分析(DART)是一种大气压环境下的新型软电离技术, 离子化过程不受溶剂、基质、盐类等的影响, 基本不产生加和离子峰。在对样品进行检测分析时不需要流动相且样品不需要处理或仅需要简单处理, 分析单个样品的时间只需几秒, 特别适用于样品的高通量筛查^[13-16]。

本研究运用DART-MS/MS对火锅底料、牛肉面汤、调味料中5种非法添加的罂粟壳生物碱进行快速定性, 与层析法、示波极谱法、分光光度法等只可对单一成分做定性的方法相比较, 具有能同时对多目标物进行定性的优点; 与液相色谱法和气相色谱法不能对目标化合物准确定性, 会产生一些假阳性结果的定性方法相比较, 具有更加准确可靠、能更好地避免假阳性的优点; 与液相色谱-串联质谱法的定性方法相比较, 具有不需要流动相分离、前处理简便、检测时间短、检测成本低的优点。该方法的建立大大简化了检验流程, 缩短了检验时间, 减少了化学溶剂对环境的污染, 提高了检测效率, 获得了满意的结果。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

DART离子源(美国Ion Sense公司); 6460C三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司); TE 124 S分析天平(感量:±0.1 mg, 德国Sartorius公司); MS3 Digital涡旋仪(德国Ikams公司); 3K30离心机(美国Sigma公司); SK8200H超声清洗仪(上海科导超声仪器有限公司); ZWF334振荡仪(上海智城分析仪器制造有限公司); 移液枪(德国Eppendorf公司)。

乙腈和甲醇(德国Merck公司)均为色谱纯; 磷酸可待因(批号:171203-201005, 含量:99.6%)、吗啡(批号:171201-200822, 含量:99.8%)、盐酸罂粟碱(批号:171214-200404, 含量:99.6%)、蒂巴因(批号:171216-200403, 含量:99.6%)、那可丁(批号:171224-200403, 含量:99.8%)均来自中国药品生物制品检定所; 其他试剂均为国产分析纯。

1.2 标准溶液配制

标准储备液:分别准确称取5种生物碱标准品各0.005 00 g, 用甲醇溶解并定容至50 mL, 得到100 mg/L的标准储备液, 于-18 ℃下保存。临用时用甲醇分别将上述标准储备液稀释为10 mg/L的吗啡、可待因、罂粟碱、那可丁及蒂巴因标准工作液或配制成10 mg/L的混合标准液。

1.3 样品处理

火锅底料、牛肉面汤:将样品(火锅底料中加入5 mL水)搅拌均匀后称取1 g试样(精确至0.01 g)于50 mL聚四氟乙烯具塞离心管中, 加入5 mL乙腈, 涡旋振荡1 min, 加入1.2 g无水硫酸镁和0.3 g无水醋酸钠, 迅速振摇, 涡旋振荡1 min, 以4 000 r/min离心5 min, 取上清液, 氮吹至近干, 残渣以1 mL乙腈复溶后供DART-MS/MS检测。

调味料:称取0.1 g试样(精确至0.01 g)于15 mL聚四氟乙烯具塞离心管中, 加入5 mL乙腈, 涡旋振荡1 min, 以4 000 r/min离心5 min, 取上清液, 氮吹至近干, 残渣以1 mL乙腈复溶后供DART-MS/MS检测。

1.4 DART离子源条件

离子化气为氦气, 流速为2 mL/min; 正离子模式; 进样模式为12Dip-it Samplers模式, 以移液枪吸取2 μL样品于DART离子源自带的玻璃棒尖端, 再将其放置于自动进样架上进样; 进样速率为0.8 mm/s; 离子化温度为300 ℃; 栅极电压为150 V; 离子源出口距离质谱进口2.4 cm。

1.5 MS/MS条件

毛细管电压4 000 V; 干燥气温度300 ℃; 干燥气流量1 L/min; 雾化气压力13.8 kPa; 正离子模式; 采集方式:多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)。经优化后的罂粟壳生物碱质谱检测参数设定见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 5种罂粟壳生物碱的质谱参数 Table 1 MS parameters for the five alkaloids Compound Parent ion (m/z) Product ion (m/z) Dwell time/ s Fragmentor voltage/ V Collision energy/ V Morphine 286.0 201.1 50 125 25 165.1 40 Codeine 300.1 215.0 50 125 30 199.1 30 Thebaine 312.0 221.1 50 145 25 248.9 20 Papaverine 340.0 202.2 50 100 30 323.9 35 Narcotine 414.0 220.0 50 130 25 353.0 25

表 1 5种罂粟壳生物碱的质谱参数 Table 1 MS parameters for the five alkaloids

2 结果与讨论

2.1 MS/MS条件的优化

采用DART离子源进样方式, 将质量浓度为100 μg/L的5种罂粟壳生物碱标准溶液分别进样, 对其进行一级质谱碎裂, 以各标准品准分子离子峰的响应强度来优化毛细管出口电压(fragmentor voltage), 完成优化后, 再对上述各标准液进行二级质谱碎裂, 以碎片离子峰的响应强度来优化碰撞电压(collision energy)。在MRM模式下分别考察了毛细管电压、干燥气流量、雾化气压力, 根据总离子流响应强度选定了最优参数(见1.5节)。

2.2 DART离子源条件的优化

2.2.1 离子化温度

DART利用高温激发态等离子体对样品表面被分析物进行解吸附离子化, 离子化温度对DART离子源来说是一个重要的参数, 温度过高或过低都会影响离子化效率和背景噪声干扰。本实验分别以50 ℃的增长梯度将DART离子源温度从100 ℃增加到400 ℃, 以10 mg/L混合标准液的总离子流响应强度来确定离子化的最优温度, 其总离子流响应强度与温度之间的关系如图 1a所示, 温度为300 ℃时, 总离子流响应强度最高。

图 1

Fig. 1

图 1 (a)气流温度、(b)栅极电压和(c)样品传输速度对响应强度的影响 Fig. 1 Effect of (a) gas flow temperature, (b) grid electrode voltage and (c) sample presentation speed on the response intensity

2.2.2 栅极电压

栅极由薄的圆形金属片组成, 位于DART离子源的绝缘陶瓷帽中。栅极电压能够防止由离子-离子复合而引起的信号损失, 其对消除大气试剂离子(如NO⁺)和降低“化学背景”起着重要的作用^[17]。该实验以10 mg/L混合标准液进样, 调节不同栅极电压, 建立了栅极电压与总离子流响应强度的关系, 如图 1b所示, 因此确定其最佳栅极电压为150 V。

2.2.3 样品传输速度

样品是通过由DART软件控制的线性轨道上的玻璃棒尖端而被引入质谱仪的, 样品通过电离区域的受控速度为0.2~10 mm/s。采样速度与总离子流的响应强度关系在0.2~1.0 mm/s范围进行测试, 结果见图 1c。由测试结果可知, 当进样速度较慢时, 有利于离子化气与样品充分接触, 提高离子化效率, 但峰宽太宽, 综合峰形、实验完成速度及离子响应强度, 最终确定以0.8 mm/s的速度进行样品传输。

2.3 定性过程

用10 μL移液枪分别移取2 μL吗啡、蒂巴因、可待因、罂粟碱、那可丁的标准溶液(1 mg/L), 点于DART离子源自动进样架上的玻璃棒尖端, 将进样架放置于DART离子源与三重四极杆质谱仪之间的线性轨道上进样。DART离子源与质谱仪都在正离子模式下操作, DART离子源条件和MS/MS条件见1.4和1.5节, 在MS/MS扫描方式为MS2 SCAN模式下进行一级质谱碎裂, 确定了吗啡(m/z 286.0)、蒂巴因(m/z 312.0)、可待因(m/z 300.1)、罂粟碱(m/z 340.0)、那可丁(m/z 414.0) 的准分子离子峰, 其全扫描质谱图见图 2。再对上述标准品在MS/MS子离子扫描模式下进行二级质谱碎裂, 确定了5种罂粟壳生物碱的碎片离子峰(碎片离子质量见表 1)。

图 2

Fig. 2

图 2 5种罂粟壳生物碱标准溶液的全扫描质谱图 Fig. 2 Full scan mass spectrum of a mixture solution of the five alkaloid standards

2.4 样品前处理条件的优化

本研究对提取液进行了不同的试验。分别选取甲醇-水(体积比为1:1) 溶液、乙腈溶液、乙腈-水(体积比为1:1) 溶液作为提取液进行样品前处理, 进样检测后发现以乙腈作为提取液时, 5种待测物的响应最高, 因此, 最后提取液确定为乙腈。

2.5 检出限、定量限和重复性

在所测样品中分别添加3个水平(50、100、200 μg/L)的5种罂粟壳生物碱混合标准溶液, 经前处理后进样检测。每个水平重复测定6次, 将标准溶液逐步稀释, 以3倍信噪比为检出限(LOD), 以10倍信噪比为定量限(LOQ), 确定了5种罂粟壳生物碱的检出限和定量限(见表 2)。对质量浓度为吗啡10 μg/L、可待因10 μg/L、蒂巴因5 μg/L、罂粟碱5 μg/L、那可丁5 μg/L的混合标准液在上述优化后的条件下进行6次重复性实验, 结果表明各化合物特征离子均能重现(见图 3)。

表 2 (Table 2)

表 2 5种生物碱的检出限和定量限 Table 2 LODs and LOQs of the five alkaloids Compound LOD/(μg/kg) LOQ/(μg/kg) Narcotine 5.0 25.0 Papaverine 5.0 25.0 Thebaine 5.0 25.0 Codeine 10.0 50.0 Morphine 10.0 50.0

表 2 5种生物碱的检出限和定量限 Table 2 LODs and LOQs of the five alkaloids

图 3

Fig. 3

图 3 5种罂粟壳生物碱混合标准液重复试验6次的MRM谱图 Fig. 3 MRM spectra of a mixture of the five alkaloid standards in six repetitive experiments TIC: total ion current chromatogram.

2.6 市售样品检测

利用本方法对调味料和牛肉面汤的阳性样品及市场上出售的火锅底料进行了检测, 每个样品在DART离子源自动进样架上重复3次进样, 检测结果见图 4。其中图 4a、b、c分别为阴性市售火锅底料样品、阳性调味料样品、阳性牛肉面汤样品的MRM谱图。其定性检测结果与高效液相色谱-串联质谱仪的检测结果见表 3, 可以看出定性结果一致。

图 4

Fig. 4

图 4 DART-MS/MS检测(a)阴性火锅底料样品、(b)阳性调味料样品和(c)阳性牛肉面汤样品的MRM谱图(n=3) Fig. 4 MRM spectra of (a) a negative hot pot condiment sample, (b) a positive seasoning sample and (c) a positive beef noodle soup sample using DART-MS/MS (n=3)

表 3 (Table 3)

表 3 以不同方法检测不同样品中5种生物碱的结果对比 Table 3 Comparison of the results for the five alkaloids tested with different methods Compound LC-MS/MS This method Hot pot condiment Seasoning/ (μg/kg) Beef noodle soup/ (μg/kg) Hot pot condiment Seasoning Beef noodle soup Narcotine - 48.4 60.5 - positive positive Papaverine - 182.1 220.2 - positive positive Thebaine - 142.3 188.2 - positive positive Codeine - 92.6 206.9 - positive positive Morphine - 381.5 324.3 - positive positive -: not detected.

表 3 以不同方法检测不同样品中5种生物碱的结果对比 Table 3 Comparison of the results for the five alkaloids tested with different methods

3 结论

本文建立了一种快速筛查非法添加罂粟壳生物碱的DART-MS/MS方法, 该方法样品预处理简单快速, 操作方便、省时。能对火锅底料、牛肉面汤、调味料中5种非法添加的罂粟壳生物碱同时进行高通量筛查, 为食品中非法添加罂粟壳生物碱的监管提供有力的技术支持。此外, 由于DART离子源离子化过程是敞开在大气环境中的, 其离子化易受环境背景的影响, 所以在本实验环境下未能进行准确定量, 但已有文献报道DART-MS/MS方法可以用于定量分析检测, 相信通过改善实验室背景环境, DART-MS/MS方法将会有更广阔的应用前景。

参考文献

[1]	Chen W, Qiao Y S, Dong G J. Science and Technology of Cereals, Oils and Foods, 2015, 23(6): 89. 陈伟, 乔勇升, 董贵军. 粮油食品科技, 2015, 23(6): 89.
[2]	Yang W Q, Yin Y, Zhang R, et al. Environmental Chemistry, 2016, 35(6): 1321. 杨雯筌, 殷耀, 张睿, 等. 环境化学, 2016, 35(6): 1321.
[3]	Di Y M, Zhang K, Ma H. Forensic Science and Technology, 2012(5): 58. 邸玉敏, 张凯, 马华. 刑事技术, 2012(5): 58.
[4]	Lin D Q, Wang T T, Wan C B, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2017, 38(2): 239. 林黛琴, 王婷婷, 万承波, 等. 质谱学报, 2017, 38(2): 239. doi: 10.7538/zpxb.youxian.2016.0041
[5]	Fan X, Feng J L, Chen D Y, et al. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2015, 25(14): 2296. 范翔, 冯家力, 陈东洋, 等. 中国卫生检验杂志, 2015, 25(14): 2296.
[6]	Li F Z, Ou W K, Mo J Y. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2010, 20(11): 2784. 李凤贞, 区文凯, 莫嘉延. 中国卫生检验杂志, 2010, 20(11): 2784.
[7]	Pi L, Hu F Z, Shi Z X. Chinese Journal of Chromatography, 2005, 23(6): 639. 皮立, 胡凤祖, 师治贤. 色谱, 2005, 23(6): 639.
[8]	Kim J, Ji D, Kang S, et al. J Pharm Biomed Anal, 2014, 89(1): 99.
[9]	Liu M M, Zhang C Z, Li Y Z, et al. Food Research and Development, 2012, 33(12): 91. 刘敏敏, 张朝正, 李延志, 等. 食品研究与开发, 2012, 33(12): 91.
[10]	Wang L Q, Li M H, Li J Q, et al. Food and Fermentation Industries, 2012, 38(8): 168. 王力清, 郦明浩, 李锦清, 等. 食品与发酵工业, 2012, 38(8): 168.
[11]	Li H, He Y L, Chen X Q, et al. Food and Drug, 2014, 16(4): 284. 李航, 贺亚玲, 陈小泉, 等. 食品与药品, 2014, 16(4): 284.
[12]	Gu W J, Zhou C Y, Tang X Q, et al. Chinese Journal of Health Laboratory Technology, 2014, 24(17): 2481. 顾万江, 周春艳, 唐晓琴, 等. 中国卫生检验杂志, 2014, 24(17): 2481.
[13]	Zhang J L, Zhang W, Zhou Z G, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2011, 29(7): 681. 张佳玲, 张伟, 周志贵, 等. 色谱, 2011, 29(7): 681.
[14]	Gross J H. Anal Bioanal Chem, 2014, 406(1): 63. doi: 10.1007/s00216-013-7316-0
[15]	Guo Y L, Li L L, Dai Y L, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2015, 35(1): 47. 郭云龙, 李乐乐, 戴雨霖, 等. 分析试验室, 2015, 35(1): 47.
[16]	Xu B, Zhang D Y, Liu Z Y, et al. J Pharmaceut Biomed, 2015, 114: 447. doi: 10.1016/j.jpba.2015.06.010
[17]	Borges D L G, Sturgeon R E, Welz B, et al. Anal Chem, 2009, 81(23): 9834. doi: 10.1021/ac901778n