超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱法非靶向快速筛查进口粮谷中未知的农药残留


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周秀锦¹ , 陈宇¹ , 杨赛军¹ , 邵宏宏¹ , 沈飚¹ , 詹舜安²

1. 舟山出入境检验检疫局, 浙江舟山 316021;
2. 安捷伦科技中国有限公司, 北京 100102

收稿日期：2017-03-21

基金项目：国家质检总局科技计划项目（2015IK306）

通讯联系人：周秀锦, Tel:8129312, E-mail:zxj@zs.ziq.gov.cn

摘要：利用快速提取农药（fast pesticide extraction，FaPEx）方法前处理样品，并结合超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱（UPLC-Q-TOF）技术建立了非靶向快速筛查进口粮谷中未知的多种农药残留方法。采用1%（v/v）醋酸乙腈溶液提取粮谷中未知的农药残留，FaPEx固相萃取柱净化、浓缩，UPLC-Q-TOF检测。利用目标化合物特征离子的精确质量数、同位素匹配、二级碎片信息和保留时间进行数据库匹配，筛查可疑未知农药。结果表明，该方法无需对照标准品即可快速筛查进口粮谷中的农药残留，能够应用于进口粮谷样品的实际筛查。该方法快速、准确、分析通量高，可以为进口粮谷中农药残留的快速筛查和质量控制提供重要的方法依据。

关键词：快速提取农药方法超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱快速筛查农药残留粮谷

Rapid screening of pesticide residues in imported grains by ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry

ZHOU Xiujin¹, CHEN Yu¹, YANG Saijun¹, SHAO Honghong¹, SHEN Biao¹, ZHAN Shun'an²

1. Zhoushan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Zhoushan 316021, China;
2. Agilent Technology China Ltd, Beijing 100102, China

Foundation item: Science and Technology Plan Project of General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People's Republic of China (No. 2015IK306)

Abstract: A fast sample pretreatment method by fast pesticide extraction (FaPEx) method combined with ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry was developed for screening of unknown pesticide residues in imported grains. The samples were extracted with 1% (v/v) acetic acid acetonitrile solution, cleaned-up by solid phase extraction column with FaPEx cartridges, and determined by UPLC-Q-TOF. The data was compared with the library with the accurate mass, isotopic distribution, fragmentation information and retention time. The results showed that this method can be used for the rapid screening of pesticide residues in imported grains without the reference standards, and it was applied to the actual screening of imported grain samples. The method is high efficiency, sensitivity and accuracy, which can meet the requirement for the rapid screening of pesticide residues in imported grains.

Key words: fast pesticide extraction (FaPEx) method ultra-performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry (UPLC-Q-TOF) rapid screening pesticide residues grains

在国际贸易一体化的形势下, 粮谷类产品进口迅猛增加。2015年进口粮食已超过1.2亿吨, 成为进口食品、农产品中最大的种类, 反映了国内粮食的刚性需求。同时, 粮食质量安全也越来越受到人们的重视, 舆论也对进口粮食安全问题高度关注, 而农药残留是影响进口粮食质量安全的重要因素之一^{[1, 2]}。2010~2014年经青岛、深圳和秦皇岛口岸进口的粮谷, 多种农药(溴氰菊酯和杀螟硫磷等)残留检出率高达8.6%^[2]。随着气相色谱-质谱联用(GC-MS)^[3-7]、液相色谱-质谱联用(LC-MS)^[8-10]等技术的普遍应用, 农药多残留同时检测得到了迅速发展。以四极杆飞行时间质谱(Q-TOF)^[11-16]为代表的高分辨质谱具有出色的一级和二级质谱分析性能, 将灵敏度、扫描速度和高质量精确度都发挥至最佳, 能同时高通量地筛查大量农药, 可广泛应用于食品安全和土壤等多个领域^[17]。Q-TOF可根据化合物的精确质量数、保留时间、同位素强度、同位素分布和二级碎片等质谱信息匹配特定的数据库, 实现化合物的无标准品快速筛查, 因此高分辨数据库是实现非靶向筛查的基础, 通过采集样品的高分辨信号并与数据库比对, 可以快速进行筛查性质的判断。

本实验以进口粮谷为研究对象, 以快速提取农药(fast pesticide extraction, FaPEx)固相萃取为前处理方法, 采用UPLC-Q-TOF对进口粮谷中常用农药进行无标准品快速定性筛查。该方法分析速度快、通量高, 可以为进口粮谷中农残的快速筛查和质量控制提供重要的方法依据。将方法应用于2015年我国进口粮谷样品的实际筛查, 为我国进口粮谷的管理决策提供了重要的指导性依据。

1 实验部分

1.1 试剂和药品

农药标准物质(纯度≥95%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司)。单标储备溶液(1 g/L)由甲醇、乙腈或丙酮配制, 所有标准溶液均在4 ℃下避光保存。乙腈(色谱纯, 美国Fisher公司); 乙酸(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)。FaPEx柱(30 mg, 6 mL, 巨研科技股份有限公司)

1.2 样品

进口粮谷样品为高粱、大麦、小麦、大豆、玉米和油菜籽, 2015年度收集于我国广州、上海、舟山、张家港、苏州、太仓等粮谷进口口岸。进口国包括美国、法国、澳大利亚、加拿大、乌克兰、巴西、阿根廷和乌拉圭。

1.3 仪器设备

Agilent 6550 iFunnelQ-TOF质谱仪, 配有双喷射流电喷雾离子化(Dual AJS ESI)源(美国Agilent公司); ST-16R高速离心机(美国Thermo公司); 超纯水仪(德国Millipore系统)。

1.4 样品前处理

称取1.0 g进口粮谷样品于50 mL的具塞离心管中, 加入5 mL的1%(v/v)乙酸乙腈溶液, 剧烈振荡30 s, 在5 000 r/min下离心5 min, 上清液倒入FaPEx柱, 以每秒1滴流速加压(约30 s), 收集滤出液, 过0.22μm有机滤膜, 供UPLC-Q-TOF检测。

1.5 UPLC-Q-TOF条件

液相色谱系统配有反相色谱柱(Agilent Poreshell EC-18, 150 mm×3 mm, 2.7μm); 流动相A为5 mmol/L乙酸铵水溶液; 流动相B为5 mmol/L乙酸铵甲醇溶液。梯度洗脱程序和流速见表 1。柱温:40 ℃; 进样量:10 μL。

表 1 色谱梯度洗脱程序和流速 Table 1 Chromatographic gradient elution procedures and flow rates

电喷雾电离正离子(ESI⁺)模式; 毛细管电压:4 000 V:干燥气温度:270 ℃, 干燥气流量:16 L/min; 鞘流气温度:300 ℃, 鞘流气流速:8 L/min; 雾化气压力:276 kPa; 锥孔电压:60 V:碎裂电压:380 V; 扫模方式:全息离子扫描, 其原理是在飞行时间质谱全扫描过程中, 碰撞室的能量由低到高进行快速切换, 保证同时得到母离子和子离子, 比起传统的采集模式, 该方式能够在一次采集的过程中, 快速得到样品中所有化合物的一级、二级质谱信息。全扫描范围:m/z 50~1 700, 母离子和子离子的采集时间比例在0.5~2 min。采用Agilent MassHunter定性软件进行数据采集与处理。

1.6 筛查方法

通过全息离子扫描模式和Agilent MassHunter软件对实际样品中采集到的数据进行农药残留筛查分析, 检索参数为:保留时间限定范围±0.5 min, 精确质量偏差±1×10^-5。通过分子离子的精确质量偏差、同位素分布、同位素比例、二级碎片和保留时间等参数分析, 结合相应的检索匹配得分值, 判断筛查出的农药残留。本实验将检索结果得分值≥70的化合物确认为检出。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理方法的优化和评价

粮谷样品富含蛋白质和脂肪等物质, 可能干扰农药的分析并污染色谱和质谱系统, 所以样品前处理方法对农药筛查尤其重要。本实验采用1%(v/v)乙酸乙腈溶液作为提取液, 比较了常用于农残检测的Envi-Carb(500 mg, 6 mL, Supelclean)和FaPEx固相萃取小柱及QuEChERS方法^[4]。结果表明, FaPEx固相萃取小柱的净化效果优于Envi-Carb柱和QuEChERS方法。Envi-Carb柱虽能去除大部分极性干扰基质, 但去除其他干扰物的能力一般, 净化效果较差。样品经QuEChERS方法处理后, 粮谷中的非极性、酸性和极性基质干扰物去除较好, 但是质谱总离子流图中0~5 min的基线较高, 说明还存在少量的极性干扰物质。FaPEx固相萃取小柱采用了氧化铝、无水硫酸镁、N-丙基乙二胺等填料通过特定比例和顺序混合填装, 对提取液进行一步式通过法净化, 实验结果表明它的净化效果最好, 前处理时间最短且操作简单。因此采用FaPEx方法对进口粮谷进行样品前处理, 并对该方法的准确性和重复性进行了评价。在5.0、10.0和20.0 μg/kg添加水平下, 2种代表性进口粮谷(大豆和大麦)中, 90%以上的农药化合物回收率达到75%~115%, RSD≤18%(n=5)(见表 2)。以喹禾灵为例, 全息离子扫描模式下出峰时间为19.089 min, 质谱图符合[M+H]⁺和[M+Na]⁺模式, 质量数分别为373.095 0和395.076 6, 具体见图 1和图 2。实验结果表明前处理方法的准确性和重复性良好, 可应用于进口粮谷中农药多残留的筛查与检测。

表 2 不同前处理方法的加标回收率 Table 2 Spiked recoveries of different pretreatment methods

图 1 喹禾灵的全息离子模式特征离子提取质谱图 Fig. 1 All ions MS/MS extracted ion chromatogram of quizalofop-ethyl

图 2 喹禾灵[M+H]⁺和[M+Na]⁺峰自动关联以及同位素匹配质谱图 Fig. 2 Automatic association of [M+H]⁺ and [M+Na]⁺ peaks, and isotope matching mass spectra of quizalofop-ethyl

2.2 定性分析

高分辨数据库是实现非靶向筛查的基础, PCDL(Personal Compound Database & Library)是进行化合物信息数据存储以及归类的专业软件。将待筛查领域项目中所涉及的所有化合物信息导入PCDL, 就构成一个专属性强的项目数据库。PCDL具有如下特点:(1) 包含化合物的基本信息, 例如名称、结构式、分子式、精确质量数、美国化学文摘登记号(Chemical Abstracts Service)号、国际纯粹与应用化学联合会(IUPAC)命名等; (2) 有保留时间检索功能; (3) 有MS/MS谱图储存功能, 可储存化合物在不同碰撞能下的高分辨质谱图, 用于化合物结构解析中的碎片离子比对等; (4) 有相似度检索功能, 支持MS/MS谱图相似度检索, 即不同化合物二级质谱图的相似度比对, 为结构确证提供更多线索。数据库的建立是筛查分析的重要环节, 直接影响结果的准确性, 因此要同时满足上述4个特点。

目前的数据库有两种类型:一级质谱扫描数据库和二级质谱扫描数据库^{[18, 19]}。一级质谱扫描数据库包含化合物的精确质量数和分子式。其优点是建立的过程方便快速, 缺点为出现假阳性的概率较大。而二级质谱扫描数据库是目前主流的数据库形式, 除了包含一级数据库的信息外, 同时包含了MS/MS的信息。该类数据库的优点为准确度高、结果匹配好, 缺点是建立数据库时间较长。

二级质谱扫描数据库还分两种, 一种是二级碎片特征数据库, 另一种是二级碎片谱图库。

二级碎片特征数据库是用化合物某些特定的碎片离子信息所建立的数据库, 数据量较小, 方便建立, 在筛查匹配的时候只根据特定的几个离子进行匹配, 速度快。但缺点是匹配信息比较片面, 有一定的假阳性概率, 且受其他因素影响比较大, 如基质和样品差异产生的干扰会影响匹配结果。

二级碎片谱图库是用化合物整个二级碎片的质谱图建立的谱图库, 通过相似度比对匹配, 比较所有二级质谱的信息和丰度。和特征数据库相比, 匹配更全面完整, 更有实用性, 可以大大减少假阳性情况, 即使在同分异构体存在的情况下也非常有效。但缺点在于谱图库的数据量较大, 建立过程比特征数据库复杂, 而且对电脑硬件要求较高。

本研究在原有商品化高分辨二级碎片谱图库的基础上, 结合各国对粮谷类农产品不同农药限量的实际情况, 建立高分辨质谱的1 600种农药高分辨二级碎片谱图数据库, 为非靶向农药筛查打下重要基础。采用农药高分辨二级碎片谱图数据库对农药残留进行筛查, 优化精确质量数偏差、保留时间限定范围和离子化形式等检索参数以避免假阳性结果的产生, 提高筛查的准确性。考虑到基质中干扰物质影响的存在, 本方法将质量偏差设置为±1×10^-5; 保留时间的限定范围为±0.5 min; 并使用数据库中的[M+H]⁺、[M+Na]⁺同位素分布和信号强度比值、二级碎片、目标物保留时间等参数信息对采集得到的数据进行匹配分析, 结合相应的检索匹配得分值判断目标化合物是否检出。

以嘧菌酯为例, 建立非靶向筛查农药的分析质控方法, 嘧菌酯的出峰时间为12.492 min, 母离子与子离子的保留时间比在0.5~2之间, 见图 3; 嘧菌酯Q-TOF一级质谱图中[M+H]⁺、[M+Na]⁺同位素分布和同位素比例如图 4所示, 完全满足方法学要求。

图 3 (a)嘧菌酯全息离子模式特征离子提取质谱图和(b)母离子与子离子的保留时间比值图 Fig. 3 (a) All ions MS/MS extracted ion chromatogram and (b) retention time clouting plot of azoxystrobin's parent ion and product ions

图 4 嘧菌酯[M+H]⁺和[M+Na]⁺峰自动关联以及同位素匹配质谱图 Fig. 4 Automatic association of [M+H]⁺ and [M+Na]⁺ peaks and isotope matching mass spectra of azoxystrobin

2.3 非靶向快速筛查农药残留的质控方法

为保证样品前处理过程、整个色谱保留时间和高分辨质量数的精确度和准确度, 实现筛查结果的准确性, 挑选12种农药进行质控实验。选择依据是极性跨度大(可覆盖多种类农药残留的极性)和出峰时间分散, 能够有效监控非靶向筛查过程中整体实验条件的稳定性, 确保筛查结果稳定可靠。12种质控农药分别在1.5节条件下进行实验, 根据每种标准物阳性实验结果([M+H]⁺和[M+Na]⁺)的精确质量数和保留时间值，分别设定其二级质谱的实验条件(如质荷比检测范围和碰撞电压), 并分别进行二级质谱实验。12种质控农残信息及总离子流图见图 5, 质谱信息见表 3。

图 5 12种质控农药标准物质的总离子流图 Fig. 5 Total ion chromatogram of the 12 pesticide standards 1. propamocarb; 2. dicrotophos; 3. phosphamidon; 4. thiodicarb; 5. mefenoxam; 6. chloranteaniliprole; 7. azoxystrobin; 8. spirotetramat; 9. pyraclostrobin; 10. quizalofop-ethyl; 11. fenpyroximate (E) and fenpyroximate (Z).

表 3 12种质控农药的保留时间和质谱信息 Table 3 Retention times and MS information of the 12 quality control compounds

2.4 非靶向快速筛查在进口粮谷质量检验中的应用

对大麦、小麦、玉米和油菜籽5类18个进口粮谷样品进行测定, 从来自加拿大、巴西、美国和阿根廷5个国家的7个样品中检出了甲基乙拌磷、噻恩菊酯、宁南霉素、尼古丁和鄰苯二甲酸二甲酯5种农药残留, 共计7个检出结果, 其中甲基乙拌磷检出率较高(检出样品分别来自加拿大、巴西和美国), 占阳性样品的42.85%左右, 占所有筛查样品的16.70%。采用超高效液相色谱-四极杆串联飞行时间质谱进行样品分析, 利用其高分辨碎片全息离子扫描模式进行数据采集, 然后通过比对样品中采集到的化合物色谱、质谱信息与已经建立的农药数据库进行比较, 对农药进行定性确证。碎片离子的匹配得分在83.0~99.3之间, 保留时间误差在0.005~0.037 min之间, 这说明现实验室所采用的UPLC-Q-TOF系统以及相关农药数据库、筛选软件、保留时间校正等技术能准确可靠地实现农药残留的快速筛选。具体结果见表 4。

表 4 进口粮谷中农药残留的筛查结果和毒性 Table 4 Screening results and toxicity of the pesticide residues in cereals

世界卫生组织推荐的农药危害分级标准^[20]将农药毒性分为剧毒、高毒、中毒和低毒4类。从表 4可以看出, 5种农药分别为高毒、中毒和无毒农药。

以加拿大大麦的结果分析为例, 样品中甲基乙拌磷的出峰保留时间为2.172 min, 保留时间偏差为0.005 min, 质量数偏差为-0.09 ppm(-0.09×10^-6), 谱库匹配得分值为83.0, 全息离子模式特征离子提取质谱图、同位素分布和比例及碎片离子质谱图分别见图 6、图 7和图 8。

图 6 加拿大大麦样品中甲基乙拌磷的全息离子模式特征离子提取质谱图 Fig. 6 All ions MS/MS extracted ion chromatogram of thiometon in the barley sample of Canada

图 7 加拿大大麦样品中甲基乙拌磷[M+H]⁺自动关联以及同位素匹配质谱图 Fig. 7 Automatic association of [M+H]⁺ peaks and isotope matching mass spectra of thiometon in the barley sample of Canada

图 8 加拿大大麦样品中甲基乙拌磷全息离子扫描模式得到的碎片离子质谱图 Fig. 8 All ions MS/MS fragment ion mass spectra of thiometon in the barley sample of Canada

3 结论

本实验利用液相色谱-四极杆飞行时间质谱建立了1 600种农药高分辨二级碎片谱图数据库, 添加12种农药作为质控内标, 采用FaPEx方法对粮谷样品进行前处理, 建立了非靶向快速筛查进口粮谷中农药的方法。通过数据处理软件, 比对目标化合物特征离子的精确质量数、保留时间、同位素比例等信息, 结合二级碎片谱图数据库的检索, 无需对照标准品即可同时筛查和确认进口粮谷中的多种农药残留。对2015年舟山口岸抽查的18个进口粮谷样品进行农残筛查, 在7个样品中检出了5种农药残留。该方法快速、准确、分析通量高, 为进口粮谷中农残快速筛查和质量控制提供了一种技术依据。

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