高效液相色谱法同时测定妊娠合并乙型肝炎患者血浆中的吲哚与3-甲基吲哚


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	邓琳琳

	甄乾娜

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	胥飚

邓琳琳¹, 甄乾娜², 高洁莹³, 金明超¹, 丁敏¹, 胥飚⁴

1. 重庆医科大学检验医学院, 临床检验诊断学教育部重点实验室, 重庆 400016;
2. 重庆医科大学附属第一医院内分泌科, 重庆 400016;
3. 重庆医科大学公共卫生与管理学院, 重庆 400016;
4. 重庆医科大学附属第一医院检验科, 重庆 400016

收稿日期：2017-03-21

基金项目：国家自然科学基金青-基金（81200294）

通讯联系人：胥飚, Tel:(023)89012744, E-mail:xubiao1969@sina.com

摘要：建立了一种高效液相色谱-荧光检测法用于同时测定血浆中的吲哚与3-甲基吲哚。样本经液液萃取法提取，采用Shim-Pack VP-ODS柱（150 mm×4. 6 mm，4.6 μm），以15 mmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇（40：60，v/v）为流动相，甲奈酚为内标，荧光激发和发射波长分别为274 nm和340 nm。吲哚和3-甲基吲哚的线性范围分别为2.22~88.89 μg/L和1.11~44.44 μg/L；检出限分别为0.11 μg/L（吲哚）和0.06 μg/L（3-甲基吲哚）；平均回收率为95.5%~112.3%，日内与日间相对标准偏差均小于6.8%。利用该方法对妊娠合并乙肝患者（n=29）和正常孕妇（n=46）的血浆进行了测定，结果表明妊娠合并乙肝患者血浆中吲哚和3-甲基吲哚水平均显著高于正常对照组，且与肝损伤指标转氨酶水平呈正相关。

关键词：高效液相色谱法吲哚 3-甲基吲哚妊娠合并乙肝肝功能

Simultaneous determination of plasma indole and skatole in pregnant women with hepatitis B virus infection by high performance liquid chromatography

DENG Linlin¹, ZHEN Qianna², GAO Jieying³, JIN Mingchao¹, DING Min¹, XU Biao⁴

1. Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics(Ministry of Education of China), College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
2. Department of Endocrinology, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
3. School of Public Health and Management, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China;
4. Department of Clinical Laboratory, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China

Foundation item: National Natural Science Foundation of China-Youth Foundation (No. 81200294)

Abstract: A high performance liquid chromatographic (HPLC) method with fluorescence detection (FD) was established to simultaneously determine plasma indole and skatole. Plasma samples were pretreated by liquid-liquid extraction. Chromatographic separation was accomplished on a Shim-Pack VP-ODS column (150 mm×4. 6 mm, 4.6 μm) using an isocratic mixture of 15 mmol/L sodium dihydrogen phosphate solution and methanol (40:60, v/v). The fluorescence excitation and emission wavelengths were 274 nm and 340 nm, respectively. The linear ranges were 2.22-88.89 μg/L for indole and 1.11-44.44 μg/L for skatole. The detection limits were 0.11 μg/L and 0.06 μg/L for indole and skatole, respectively. The recoveries were in the range of 95.5%-112.3% with the relative standard deviations less than 6.8%. The method was successfully applied to the analysis of plasma from healthy pregnant women (n=46) and pregnant women with hepatitis B virus (HBV) infection (n=29). The results showed that plasma indole and skatole levels were significantly different between two groups. In pregnant women with HBV infection, the concentrations of indolic compounds were positively associated with transaminase levels.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) indole skatole pregnant women with hepatitis B virus infection liver function

吲哚与3-甲基吲哚是色氨酸在肠道细菌作用下的代谢产物^{[1, 2]}。吲哚在人体内作为信号因子, 参与调节体内免疫代谢^{[3, 4]}。近年来, 大量研究显示吲哚类物质与肝病、糖尿病等多种代谢性疾病密切相关^[5-7]。有研究表明肠道细菌在乙肝的发病过程中起着关键的作用^{[8, 9]}, Rasmussen等^[10]提出3-甲基吲哚是部分芳香族化合物受体的激动剂, 诱导肝细胞中CYP1A1/2和CYP1B1异常表达, 进而影响肝脏功能, 但其在妊娠合并乙肝中的作用尚未阐明。

吲哚类代谢物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)^{[11, 12]}、高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)^[13-15]和气相色谱-质谱法(GC-MS)^{[16, 17]}等。其中HPLC是吲哚类物质检测中使用最广泛的方法。吲哚和3-甲基吲哚在人体内含量低。Suyama等^[18]采用色谱法同时测定人体血浆中吲哚与3-甲基吲哚的含量, 但需要梯度洗脱, 且分析时间长(28 min), 灵敏度低, 不能对大部分样本中的3-甲基吲哚进行检测, 不适用于临床常规分析。本研究建立了HPLC-荧光检测法(FD)用于同时测定血浆中的吲哚和3-甲基吲哚, 该方法操作简便、快速、灵敏, 成功地应用于人血浆中吲哚与3-甲基吲哚含量的测定, 发现其浓度在妊娠合并乙肝中显著升高, 与患者肝损伤指标有关。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1100型高效液相色谱仪(配有G132A型荧光检测器), Shim-Pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm)及Phenomenex-C18保护柱(4 mm×3 mm, 5 μm)。Millipore超纯水过滤装置及Millipore真空泵(美国Millipore公司); HIMAC-cf 15低温台式离心机(日立工机株式会社); ZWY-100H恒温培养振荡器(上海智城分析仪器制造有限公司)。

吲哚和3-甲基吲哚标准品(纯度分别为99.9%和≥99.0%, 美国Sigma公司); 甲奈酚标准品(纯度99%, 北京百灵威科技有限公司); 甲醇(色谱纯, 美国Tedia公司); 其他试剂均为国产分析纯。

标准溶液的配制:分别称取一定量的吲哚、3-甲基吲哚和甲奈酚标准品, 用流动相溶液(15 mmol/L磷酸二氢钠溶液-甲醇(40:60, v/v))配成10 g/L吲哚、3-甲基吲哚和甲奈酚标准储备液, 分装保存于-20 ℃。使用前取标准储备液稀释至所需浓度，配制成标准工作液。

1.2 样本采集及预处理

妊娠合并乙型肝炎的患者29例, 所有患者均经过乙肝五项定性检测(酶联免疫吸附测定方法, ELISA)确定为妊娠合并乙肝患者, 无高血压、肾病等疾病病史。同时选择同期正常妊娠妇女46例作为正常对照组, 两组样本均来自重庆医科大学第一附属医院。本研究获得重庆医科大学第一附属医院伦理委员会的批准和受试者的知情同意。抽取受检者空腹静脉血2 mL于EDTA抗凝管中, 低速离心, 留取血浆于-20 ℃保存。

取血浆300 μL, 加入10 μL内标(IS)溶液(甲奈酚, 5 mg/L)和600 μL乙醚, 涡旋混匀后, 在250 r/min摇速下振摇18 min, 于4 ℃下13 300 g离心5 min。取上清液, 在30 ℃下N₂吹干后用90 μL流动相复溶, 涡旋5 min, 13 300 g下4 ℃离心5 min, 取上清液50 μL进样分析。

1.3 HPLC条件

Shim-Pack VP-ODS色谱柱(150 mm×4.6 mm, 4.6 μm); 流动相:15 mmol/L NaH₂PO₄-甲醇(40:60, v/v); 柱温:30 ℃; 流速:0.8 mL/min; 荧光激发波长(λ_ex)和发射波长(λ_em)分别为274 nm和340 nm; 进样量:50 μL; 分析时间:10.5 min。

1.4 生化指标

测定研究对象的肝功能生化检测项目, 指标包括丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase, AST)、白蛋白(albumin, ALB)及总胆红素(total bilirubin, TBIL)等。

1.5 统计学分析

采用SPSS20软件进行统计学分析, 符合正态分布的计量资料用X±SD描述, 不符合正态分布的用中位数(四分间距)描述, 两组间均数比较用t检验或秩和检验, 相关性分析用简单性分析, p＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与讨论

2.1 液液萃取法

血浆样品成分复杂, 在液相色谱分析中会产生基质干扰。实验发现, 液液萃取法比蛋白沉淀法^[18]获得的色谱图背景更加干净, 内源性物质干扰小, 故采用液液萃取法对血浆中的目标物进行净化与富集。本研究依据吲哚类代谢物易溶于乙醚的特性, 结合文献^[13]报道, 选择乙醚作为萃取剂。为了获得最优的萃取条件, 本研究分别考察了乙醚的体积、摇床速度和时间。

2.1.1 乙醚体积的确定

在萃取过程中, 固定其他萃取条件不变, 考察不同乙醚体积对分析物萃取量的影响, 结果如图 1所示。吲哚与IS的峰面积比值随着乙醚体积的增加而增加, 在乙醚体积为600 μL时达到最大; 由于3-甲基吲哚含量低, 3-甲基吲哚与IS的峰面积比值随着乙醚体积的增加变化不大, 在乙醚体积为600 μL时相对较高, 相对标准偏差(RSD)小于5%, 故本实验乙醚体积选择为600 μL。

图 1 乙醚体积对吲哚和3-甲基吲哚萃取的影响(n=3) Fig. 1 Effect of the volume of diethyl ether on the extraction of indole and skatole (n=3)

2.1.2 摇床速度和振摇时间的确定

考察了摇床速度和振摇时间对萃取的影响。从图 2a中可以看出, 分析物与内标的峰面积比值随着摇床速度的增加而增加, 当摇床速度为250 r/min时, 其峰面积比值达到最大。固定其他条件不变, 考察不同振摇时间(10、15、18、20、22 min)对分析物峰面积比值的影响, 结果表明, 随着振摇时间的延长, 吲哚和3-甲基吲哚的萃取量增加, 振摇时间在18 min时, 吲哚与IS的峰面积比值达到稳定, 3-甲基吲哚与IS的峰面积比值达到最大(见图 2b)。因血浆中3-甲基吲哚浓度较吲哚低, 响应信号较弱, 故本实验选择摇床速度为250 r/min, 摇床时间为18 min。

图 2 (a)摇床速度和(b)摇床时间对吲哚和3-甲基吲哚萃取的影响(n=3) Fig. 2 Effect of (a) shaking speed and (b) shaking time on the extraction of indole and skatole (n=3)

2.2 复溶剂和复溶体积

将残余物分别用甲醇和流动相溶解, 考察溶解的效果。结果显示, 以流动相溶解时, 分析物的色谱峰对称性好。加入不同体积流动相溶解残余物, 结果表明, 当复溶体积为90 μL时, 能完全溶解残余物, RSD小于3.4%(n=3)。为了获得较高的灵敏度, 实现血中分析物的检测, 本实验以90 μL流动相复溶。

2.3 内标的选择

本研究发现文献^[13]采用的内标2-甲基吲哚与血浆内源性物质未能完全分离(分离度(R)＜1.5), 而甲奈酚保留时间适中, 且与内源性物质完全分离, 故本实验选择甲奈酚作内标。

2.4 HPLC条件优化

根据吲哚类代谢物具有自然荧光的特点, 通过Agilent LC-1100色谱化学工作站对分析物进行荧光光谱扫描, 确定最佳激发波长为274 nm, 检测波长为340 nm。

以甲醇与磷酸二氢钠溶液作为流动相, 分别对流动相的组成与流速进行了考察。在甲醇的体积分数为45%~65%时, 随着甲醇含量的增大, 各分析物的保留时间间隔缩短, 同时分离度降低。当甲醇体积分数为60%时, 分析物、IS与血浆内源性物质能彼此较好分离(R＞2.0), 且保留时间较短。固定流动相的比例, 调整磷酸盐溶液的浓度，结果表明，随着磷酸盐溶液浓度的增加, 分析物与IS的峰面积比值基本不变, 分离度逐渐增加。当磷酸二氢钠浓度为15 mmol/L时, R大于1.5, 满足分析要求。由于磷酸盐浓度过高易形成结晶堵塞色谱仪和色谱柱, 故本文选择磷酸二氢钠浓度为15 mmol/L。在流速为0.6~1.0 mL/min时, 随着流速的增大, 分析物的保留时间间隔缩短, 峰面积减少, 分离度降低。但流速过低使分析时间延长。综合考虑, 本实验选择流动相为15 mmol/L NaH₂PO₄溶液-甲醇(40:60, v/v), 流速为0.8 mL/min。

2.5 方法学评价

2.5.1 标准曲线及检出限

配制系列质量浓度的吲哚(2.22、5.56、11.11、22.22、44.44、88.89 μg/L)和3-甲基吲哚(1.11、2.22、5.56、11.11、22.22、44.44 μg/L)混合标准溶液, 各取20 μL加入280 μL正常孕妇混合血浆中, 按1. 2节进行操作。以血浆中加入待测物的质量浓度(μg/L)为横坐标, 血浆中待测物与内标的峰面积比值减去血浆基质中待测物与内标的峰面积比值为纵坐标, 绘制标准曲线, 以信噪比(S/N)=3计算检出限, 结果如下：吲哚的线性方程和线性范围分别为Y=0.017 3X+0.111 3(相关系数为0.999 7) 和2.22~88.89 μg/L; 3-甲基吲哚的线性方程和线性范围分别为Y=0.023 4X+0.072(相关系数为0.999 4) 和1.11~44.44 μg/L。检出限分别为:吲哚, 0.11 μg/L; 3-甲基吲哚, 0.06 μg/L。

2.5.2 精密度和回收率

在280 μL健康人混合血浆中分别加入20 μL高、中、低不同浓度的标准品混合液, 按1. 2节方法操作。日内重复测定5次, 连续测定5天。对高、中、低不同浓度的血浆样品进行加标回收试验, 结果见表 1。日内RSD在1.6%~6.2%之间, 日间RSD在1.5%~6.7%之间。各分析物在不同浓度下均获得满意的回收率, 回收率在95.5%~112.3%之间, 表明本方法准确可靠。

表 1 吲哚及3-甲基吲哚的回收率和精密度(n=5) Table 1 Recoveries and precisions of indole and skatole (n=5)

2.5.3 稳定性

样本:将血浆样品储存于-20 ℃, 放置0、14 d、60 d和6个月后在常温下解冻, 经样本预处理后测定, 分析物含量的RSD均小于3.6%, 表明血浆样本在-20 ℃下至少可放置6个月。

预处理后的样本:血浆样品经样本前处理后, 在常温下分别放置0、2、7和14 d后测定, 结果显示, 分析物含量的RSD均小于4.0%, 表明萃取后的血浆样本在常温下至少稳定14 d。

2.5.4 干扰实验

根据美国国家临床实验室标准委员会(NCCLS)制订的关于干扰试验的评价方案考察了胆红素和溶血对吲哚和3-甲基吲哚测定的影响。

用甲醇将胆红素标准品冻干粉溶解, 配成标准液。取健康人混合血浆280 μL, 加入20 μL不同浓度的胆红素标准液, 按照1.2节所述方法操作。分别测定未加(X₀)和加入(X)胆红素标准液时血浆吲哚和3-甲基吲哚的浓度, 干扰值为X-X₀, 其值在对照组±1.96S(95%可信限, S为健康人混合血浆重复测定3次的标准偏差)范围内为无显著干扰。结果表明, 血浆中胆红素的质量浓度达到50 mg/L时对测定结果无显著影响(见表 2)。

表 2 胆红素对血浆中吲哚和3-甲基吲哚测定的影响(n=3) Table 2 Effect of bilirubin on the determination of indole and skatole in plasma (n=3)

取正常人EDTA抗凝全血分成两份, 一份在4 ℃、2 000 g离心力下离心, 分离血浆; 另一份在-20 ℃间反复冻融直至全部溶血。用血浆配制成不同程度的溶血标本, 一部分样本用于血红蛋白的检测, 另一部分样本按照1.2节操作, 每一浓度样品重复测定3次。结果显示, 7.2 mg/mL溶血即对这2种物质的测定有影响(见表 3), 故在测定实际样本时应避免溶血。

表 3 溶血对血浆中吲哚和3-甲基吲哚测定的影响(n=3) Table 3 Effect of hemoglobin on the determination of indole and skatole in plasma (n=3)

2.6 临床应用

2.6.1 吲哚与3-甲基吲哚含量测定

用所建立的方法分别测定正常对照组(n=46) 和妊娠合并乙肝组(n=29) 血浆中吲哚和3-甲基吲哚的浓度, 色谱图见图 3。结果显示:与对照组比较, 妊娠合并乙肝患者血浆中吲哚和3-甲基吲哚的水平分别升高1.0倍和0.75倍, 差异具有统计学意义(p＜0.005)(见图 4)。

图 3 (a)添加吲哚和3-甲基吲哚标准品的混合健康孕妇血浆、(b)健康孕妇血浆和(c)妊娠合并乙肝患者血浆的典型色谱图 Fig. 3 Typical chromatograms of (a) mixed plasma of healthy pregnant women spiked with indole and skatole standards, (b) plasma of a woman with a healthy pregnancy and (c) plasma of a pregnant woman with hepatitis B virus (HBV)

图 4 妊娠合并乙肝组(n=29) 及正常对照组(n=46) 血浆中的吲哚及3-甲基吲哚含量比较 Fig. 4 Comparison of plasma indole, skatole levels between HBV group (n=29) and control group (n=46)

2.6.2 妊娠合并乙肝组血浆中吲哚、3-甲基吲哚与转氨酶的相关性分析

根据文献^[19]对数据进行简单相关性分析, 血浆中吲哚的浓度与AST (r=0.665, p＜0.001)、ALT (r=0.620, p＜0.001) 呈现显著正相关, 与ALB呈现较强的正相关(r=0.561, p=0.002);3-甲基吲哚与AST(r=0.744, p＜0.001)、ALT(r=0.704, p＜0.001) 呈强相关, 提示吲哚类物质与肝损伤指标有关(见图 5)。

图 5 乙肝组吲哚、3-甲基吲哚与转氨酶的相关性 Fig. 5 Relationship between transaminase values and the concentrations of indole, skatole in HBV group AST: aspartate aminotransferase; ALT: alanine aminotransferase.

3 结论

本研究建立了同时测定血浆中吲哚和3-甲基吲哚的高效液相色谱-荧光检测法。本方法采用等度洗脱, 分析时间短, 灵敏度高, 样本用量小, 适用于临床与科研。该方法成功地用于分析妊娠合并乙肝患者及健康对照组血浆中吲哚和3-甲基吲哚的浓度, 结果发现妊娠合并乙肝患者体内吲哚和3-甲基吲哚浓度明显增加, 与肝损伤指标存在明显正相关, 提示细菌代谢物吲哚类物质与妊娠合并乙肝存在密切相关。

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