中国是世界最大的茶叶生产国, 也是主要的茶叶出口国。拟除虫菊酯(pyrethroid)类农药的杀虫范围广且价格较低, 在中国的茶叶生产中被普遍施用。此类农药对光、热稳定, 在自然条件下降解慢, 使用不当或安全间隔期不够即采茶, 容易导致其在茶叶中的残留量超标。拟除虫菊酯类农药可能对神经系统产生毒害作用, 有潜在的环境[1]、雌激素活性[2]和一定的生殖毒性[3, 4], 并对免疫和心血管系统存在毒副作用[5]。因此, 拟除虫菊酯类农药在茶叶中的残留一直是被关注的焦点问题。许多国家对茶叶中拟除虫菊酯类农药的最大残留限量(MRL)都做了严格的规定。欧盟[6]2016年规定茶叶中氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯氰菊酯的MRL分别是0.1、0.1和0.5 mg/kg; 2017年6月8日开始执行的中国国家标准[7]规定茶叶中氰戊菊酯、氟氯氰菊酯和氯氰菊酯的MRL分别为0.1、1.0和20 mg/kg。
茶叶中农药残留检测方法通常采用气相色谱(GC)法和高效液相色谱(HPLC)法, GC和HPLC可能产生假阳性误判, 因而需要质谱(MS)进一步确证[8-12]。近年来, GC-MS、HPLC-MS等色谱-质谱联用技术在农药残留检测中的应用使农药残留检测技术发展到一个新的高度, 可以一次分析几十至几百种农药。茶叶样品基质复杂, 含大量色素、生物碱、多酚类化合物, 样品的萃取净化和富集等前处理是实现准确分析的前提[13-15]。中国茶叶农药残留检测的国家标准[7]用乙腈作提取剂, 用乙腈-甲苯溶液(3：1, v/v)洗脱, 外标法定量。李晔等[16]选用丙酮-二氯甲烷(1：1, v/v)为洗脱剂, 色谱柱没有用农药残留检测常用的DB-5MS柱, 而是选用了中等极性的DB-17MS柱。Kuang等[17]先用丙酮从茶汤中提取农药残留, 再将丙酮提取液与NaCl水溶液混合后用己烷萃取, 之后用石油醚-乙醚(17：3, v/v)洗脱自组装的“三明治夹心”弗罗里硅土萃取柱上的农药残留。李军明等[18]、丁慧瑛等[19]和胡贝贞等[20]建立了GC-MS方法分析茶叶中的农药残留, 洗脱剂分别选用丙酮-环己烷(3：7, v/v)、正己烷-乙醚(8：2, v/v)和乙酸乙酯-环己烷(5：95, v/v), 均联用凝胶渗透色谱法清除共萃取物中的染料、脂类和蜡状物, 净化杂质。
本文建立了乙腈快速提取、石墨碳和氨丙基硅胶填充柱串联硅藻土硅胶混合填充柱的固相萃取柱净化方法, 采取4种溶剂混合洗脱, 用GC-MS/MS测定茶叶中非极性农药拟除虫菊酯残留, 使用基质匹配标准溶液制作基质匹配标准工作曲线进行定量分析, 克服了GC方法易受到茶叶基质背景干扰的缺点, 提高了方法的灵敏度。
GC-MS/MS仪(Trace 1300-ISQ)、自动进样器(Thermo AS 1310)(赛默飞世尔科技有限公司); 氮吹仪(MTN-5800A, 天津市八里台微电子园区); 在线浊度分析仪(TB500, 北京戴美克科技有限公司); 自动铂钴比色计(EC2000-162010, 英国罗威邦科技有限公司)。色谱柱:DB-5MS石英毛细管色谱柱(30 m×250 μm×0.25 μm, 安捷伦科技有限公司); 固相萃取柱:Carb/NH2柱和SLH柱(规格均为500 mg、6 mL, 美瑞泰克科技有限公司); 乙腈、二氯甲烷(色谱纯, 韩国MREDA公司); 丙酮(色谱纯, 德国DUKSAN公司); 正己烷(色谱纯, 天津市科密欧有限公司); 无水硫酸钠(分析纯, 河南焦作市化工厂三厂)。甲醇中氟氯氰菊酯标准溶液(GBW(E)082009, 100 mg/L)、甲醇中氯氰菊酯标准溶液(GBW(E)082018, 100 mg/L)、甲醇中氰戊菊酯标准溶液(GBW(E)082016, 100 mg/L)均购自中国计量科学研究院。空白茶叶样品(中国测试技术研究院生物研究所); 茶叶样品为日常送检样品。其他试剂均为国产分析纯。
混合标准工作液:取等体积的100 mg/L氟氯氰菊酯标准溶液、氯氰菊酯标准溶液、氰戊菊酯标准溶液混合, 于4 ℃避光保存, 保存期为一个月。经正己烷逐级稀释为0.10、0.20、0.50、1.00和2.00 mg/L的系列混合标准工作液。
基质匹配标准工作液:取2.5 g空白茶叶样品, 经提取、净化和氮气吹干后, 分别加入5 mL不同质量浓度的混合标准工作液, 摇匀后过0. 22 μm有机滤膜, 得到相应质量浓度的基质匹配标准工作液。
采用“全茶法”[7], 粉碎研磨干茶样本, 过20目筛备用。选择乙腈作提取剂。称取混匀磨碎的2.5 g茶叶于具塞锥形瓶中, 加入20 mL乙腈, 超声提取10 min, 以8 000 r/min的速度离心5 min, 取上层清液过无水硫酸钠于50 mL平底烧瓶中, 残渣加入10 mL乙腈重复提取, 合并两次提取液, 于45 ℃水浴减压浓缩, 氮气吹干。按照相同程序处理空白茶叶样品。
Carb/NH2柱事先经丙酮和二氯甲烷混合液(1：1, v/v)活化, SLH柱事先经丙酮活化。取5 mL洗脱液分多次溶解、淋洗平底烧瓶残留物。保证残留物全部溶解在5 mL洗脱液内, 之后准确移取其中2 mL洗脱液于已活化的Carb/NH2柱上。经洗脱液淋洗, 转移至串联的SLH固相萃取柱进行二次净化。
将Carb/NH2柱和SLH柱串联, 洗脱时以自然下滴控制其流速。液面达到SPE柱筛板表面后洗脱, 洗脱液收集于10 mL具塞试管中, 45 ℃水浴中减压浓缩近干, 氮气吹干, 最后用1 mL正己烷准确定容, 过膜后待GC-MS分析。
色谱柱:DB-5MS石英毛细管色谱柱。升温程序:温度80 ℃, 保持1 min, 以15 ℃/min的速度上升至180 ℃, 保持2 min, 以8 ℃/min的速度上升至300 ℃, 保持7 min。载气:氦气(纯度≥99.999%); 恒流模式; 流速:1.0 mL/min; 进样口温度:280 ℃, 进样量:1 μL; 进样方式:不分流进样。
碰撞气(氦气)流速:2.25 mL/min; 离子源温度:230 ℃; 电子轰击源:EI源; 电力电压:70 eV; 电子倍增器电压:1 400 V; 碰撞室温度:40 ℃; 扫描方式:全扫描结合单离子检测扫描(SIM)。质谱全扫描模式测定, 可以同时获得化合物全部碎片离子信息, 1个离子计为2个定性点, 使化合物确证更加准确。根据全扫描结果, 选择离子条件, 生成SIM的定量离子和保留时间, 并根据每个分析物的保留时间进行SIM片段采集。驻留时间:100 μs; 溶剂延迟:3.5 min。每种农药分别选择1个定量离子, 2个定性离子, 按照出峰顺序分别检测。
茶叶样品含大量色素、生物碱、多酚类化合物等干扰物质, 而所要检测的3种亲酯性农药残留分子极性弱、在有机溶剂中溶解度好, 加之水会阻止有机溶剂与茶叶中待测成分的直接接触, 不利于拟除虫菊酯类农药残留的提取, 提取时选用非水溶剂较好。
表 1为2008年以来部分GC-MS方法测定拟除虫菊酯类农药残留常用的提取液和洗脱方法。考虑到提取液应尽量与SPE小柱润洗剂、洗脱剂组分一致, 本文选择乙腈[7]、正己烷-丙酮(2：1, v/v)[9]、丙酮-二氯甲烷(1：1, v/v)[20]作为提取液进行空白基质加标回收率对比试验, 以选择合适的提取液。预实验显示3种提取液的加标回收率均大于95%(结果未列出)。
未经SPE双柱串联萃取步骤时, 乙腈提取液颜色最浅, 正己烷-丙酮提取液次之, 丙酮-二氯甲烷的提取液颜色最深; 经过所有的提取净化检测步骤后, 乙腈提取液的色谱图干扰最少。正己烷利于提取高沸点组分, 丙酮提取物中低沸点组分偏多, 但文献[8, 9]中使用正己烷-丙酮提取液时, 需有复杂的羟基化多壁碳纳米管、N-丙基乙二胺键合固相吸附剂和MgSO4作为吸附剂的改进的QuEChERS净化步骤。而丙酮-二氯甲烷提取液[20]需有后续的凝胶渗透色谱净化步骤, 以除去色素、脂类、蜡质等大分子杂质。为使后续净化步骤简单、快捷, 选择乙腈作提取液。
中国国家标准[7]选用的Cleanert TPT柱为柱填料与Carb/NH2近似的大容量SPE柱, 可除去色素和极性杂质。本试验采用双柱串联法对茶叶样品进行分析前的净化富集, 选择以石墨碳与氨丙基硅胶为填充材料的Carb/NH2柱和以硅藻土硅胶混合填充的SLH柱串联萃取农药残留。表 2为20种茶叶样品经Carb/NH2柱和SLH柱双柱串联与Carb/NH2单柱萃取的色度和浊度测定结果。单柱萃取后, 无色试样为11种; 而双柱萃取后, 无色试样为18种。本文使用双柱串联去除色素、杂质的操作简单、快速、高效, 有利于保护色谱柱和电离源。
丙酮[17]是茶叶检测工作中常用的良好溶剂, 极性较强, 增加丙酮的比例会提高杂质的提取量, 给净化带来一定困难。若丙酮加入量超过50%(体积分数), 会导致茶叶中色素提取太多, 影响样品净化效果。中国国家标准[7]中洗脱液选择乙腈和甲苯(3：1, v/v)的混合液, 文献[22]报道甲苯加入量超过50%(体积分数), 会在最终的样品中引入更多的杂质, 并且对于某些原来分析结果较好的农药会引起负效应。因3种拟除虫菊酯农药分子均为中等偏弱极性, 洗脱液也应选择极性较弱的有机溶剂。采用控制变量法对4种混合溶剂进行不同体积配比的优化, 以基质效应值(见表 3)和回收率(见表 4)为优化标准。基质效应值在80%~120%之间为弱基质效应, 低于80%、高于120%均为强基质效应[25]。选择文献[26]报道基质效应影响最大的氰戊菊酯做空白基质效应测定。由表 3可知, 由5 mL乙腈、5 mL丙酮-二氯甲烷(1：1, v/v)混合液、2.5 mL丙酮、5 mL正己烷-二氯甲烷(1：1, v/v)混合液组合的洗脱液, 基质效应为98.3%, 是弱基质效应。用此比例的洗脱液进行洗脱，在0.50 mg/L的加标水平下, 氰戊菊酯的回收率为93.5%, 洗脱效果最优。因此选用此比例洗脱液进行洗脱。
拟除虫菊酯农药的分子极性较弱, 选择极性小的固定相色谱柱有利于分离。DB-5MS石英毛细管色谱柱由非极性的含5%(质量分数)苯基的聚甲基硅氧烷填充。气相色谱检测前用介电常数小的正己烷润洗色谱柱。所有试样均用1 mL正己烷定容, 过膜待测。
在上述最优条件下, 3种拟除虫菊酯混合标准工作液的气相色谱-质谱图见图 1, 小图为3种农药标准品全扫描图谱的放大。图 2为3种农药残留的质谱图和SIM提取离子色谱图, 3种农药在色谱图中的保留时间、定量离子和定性离子见表 5。
采用基质混合标准工作液绘制标准曲线, 以目标化合物的质量浓度(单位:mg/L)为横坐标, 相对应的峰面积为纵坐标, 得到线性方程及相关系数。以S/N=3时的质量浓度作为LOD值; 以S/N=10时的质量浓度作为LOQ值。若茶叶样品与基质匹配混合标准溶液的色谱图在相同保留时间有峰出现, 则根据离子种类及其丰度对比进行阳性确证。由表 5可知, 3种农药相对应的共10种异构体在0.05~2.0 mg/kg范围内质量浓度与对应的峰面积线性关系良好。3种农药残留的检出限为0.3~1.0 μg/kg。
在最优实验条件下, 向空白茶叶样品中添加低、中、高3个水平(0.10、0.50、2.00 mg/L)的混合标准溶液, 进行回收率测定, 每个水平分别测试6份平行样品。表 4显示3种拟除虫菊酯类农药的加标回收率为80.6%~116.3%, 相对标准偏差为5.3%~11.4%。回收率和精密度数据均符合农药残留检测要求。
用本方法测定了花茶、绿茶、红茶、黑茶等4类共20份不同加工工艺的茶制品中拟除虫菊酯的含量(见表 6), 每个样品日内连续测量3次, 连续测量6天, 日内RSD为1.3%~12.6%, 日间RSD为2.7% ~12.1%, 重复性良好。回收率和精密度数据均符合农药残留检测要求[7]。中国国家标准[7]中氰戊菊酯MRL为0.1 mg/kg, 氰戊菊酯农药残留检出值介于0.002~0.015 mg/kg之间, 未检出超标样品; 氯氰菊酯的MRL为20.0 mg/kg, 未检出超标样品; 氟氯氰菊酯的MRL为1.0 mg/kg, 未检出超标样品。按照中国国家标准[7]的限量要求, 受检的20种茶叶样品全部合格。按照欧盟标准[6], 氟氯氰菊酯MRL为0.1 mg/kg, 所测样品全部超标; 氯氰菊酯MRL为0.5 mg/kg, 测出一份超标样品, 超标率为5%;氰戊菊酯MRL为0.1 mg/kg, 未检出超标样品。
本文建立了茶叶中3种拟除虫菊酯的串联双柱固相萃取GC-MS测定方法, 基本解决了质谱测定茶叶基质干扰和最终进样液色素干扰的问题, 为后续茶叶中多类农药残留快速检出工作奠定了基础、为相关茶叶标准的修订提供了基础数据, 对指导农业生产和市场监管提供了理论依据。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 860-866
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