焙烤食品种类多样、基质复杂、营养丰富, 是真菌的良好天然培养基, 而产毒真菌在适宜的条件下可产生真菌毒素, 常见的真菌毒素有黄曲霉毒素(aflatoxin)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol)、HT-2毒素、T-2毒素等。真菌毒素除了可使人体中毒和致死之外, 还可使机体免疫力下降、生长迟缓、生殖紊乱, 致癌、致畸、致突变等[1]。随着人们生活水平的提高和思想观念的转变, 近年来焙烤食品的消费量持续大幅增长, 因此, 加强对焙烤食品及其原料中真菌毒素检测技术的研究非常有意义。
真菌毒素提取净化的方法有固相萃取(SPE)法[2, 3]、超临界流体萃取(SFE)法[4]、免疫亲和萃取法[5]、凝胶渗透色谱(GPC)法[6]、加速溶剂萃取(ASE)法[7]和QuEChERS法[8]等, 其中SPE和SFE多用于单一或者同类毒素的提取净化; GPC和ASE针对不同类型的样品均需对仪器方法进行调试, 前处理步骤复杂, 不适于批量样品前处理; 免疫亲和萃取法虽净化效果较好, 但成本较高。QuEChERS样品前处理技术是由Anastassiades等[9]提出的一种快速、简便、安全、有效的样品提取净化技术, 被广泛应用于农药残留的检测分析[10, 11]。
检测食品中真菌毒素的方法主要有酶联免疫(ELISA)法[12]、薄层色谱(TLC)法[13]、气相色谱(GC)法[14]、液相色谱(LC)法[15]以及液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[3, 5, 16, 17]。ELISA法快速简便、灵敏度高、特异性强、成本低, 但对试剂的依赖性较大、不能同时分析多种组分、对一些结构类似物的检测会出现交叉反应, 从而影响检测结果的准确性等[18]。TLC法操作方便、成本较低、检测速度快, 但其灵敏度低, 精密度、重复性和抗干扰能力差[19]。GC法和LC法对样品的分离效果较好, 可用于真菌毒素的准确定量检测和分析, 但在定性检测方面有一定的局限性, 且受杂质干扰的影响较大。LC-MS/MS法具有抗干扰能力较强、选择性较高、灵敏度较高和离子传输效率较高等优点, 是目前用于毒素检测的确证方法。近几年, 有研究[20-22]报道了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱(UPLC-HRMS)已经应用于淀粉、鸡肉、饲料中农、兽药残留多组分的分析, 但尚未见其用于检测食品中的真菌毒素。本文建立了UPLC-HRMS测定焙烤食品及其原料中11种真菌毒素的分析方法, 该方法简单快速、准确度高、灵敏度强、精密度好, 可快速筛查焙烤食品及其原料中的11种真菌毒素。
Dionex UltiMate 3000 Q Exactive UPLC-HRMS、TraceFinder 3.3数据处理软件、3-16 PK高速冷冻离心机(美国Thermo公司); CORTECS C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.6μm, 美国Waters公司); C18粉(德国CNW公司); Turbo Vap LV氮吹仪(美国Biotage公司); 1875DAE超声波清洗器(美国CREST公司); EYELA MMW-1000W分液漏斗振荡器(日本RIKAKIKAI公司); GM200刀式捣磨仪(德国Retsch公司); CP2250天平(德国Sartorius公司); MS 3涡旋机(德国IKA公司); 0.22μm水相滤膜(上海安谱公司)。
标准品:黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2(AFB1、AFB2、AFG1、AFG2)混合标准溶液(AFB1和AFG1的质量浓度均为1 mg/L, AFB2和AFG2的质量浓度均为0.3 mg/L)购自美国SUPELCO公司; 黄曲霉毒素M1(AFM1)标准品溶液(质量浓度为10 mg/L)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON, 纯度为95.0%)均购自美国O2si公司; 黄曲霉毒素M2(AFM2, 纯度为99.5%)、雪腐镰刀菌烯醇(NIV)溶液(质量浓度为100 mg/L)均购自澳大利亚FERMENTEK Ltd.公司; 桔青霉素(CIT, 纯度为98.0%)、HT-2毒素(纯度为96.0%)、T-2毒素(纯度为97.0%)均购自美国TRC公司。实验用样品均购自当地市场。
乙腈、甲醇、乙酸乙酯均为色谱纯, 购自德国默克公司; 实验用水为Milli-Q纯水机(美国Millipore公司)制备的超纯水。其他试剂均为国产分析纯。
用乙腈将AFM2、CIT、HT-2毒素、T-2毒素配制成质量浓度均为100 mg/L的储备液; 用甲醇将DON配制成质量浓度为250 mg/L的储备液。根据需要, 用含体积分数(下同)为0.1%甲酸的甲醇-水(1:9, v/v)溶液稀释成适当浓度的混合标准工作液, 于-18 ℃保存, 有效期为3个月。
准确称取(4.00±0.01) g面包, 置于50 mL聚丙烯离心管中, 加入20 mL含1%甲酸的乙腈-水(90:9, v/v)溶液, 涡旋30 s, 振荡5 min, 于30 ℃超声提取45 min, 冷却至室温。加入2 g MgSO4和0.5 g NaCl, 涡旋30 s, 振荡5 min, 以4 500 r/min的速度离心5 min, 取10 mL上清液于50 mL聚丙烯离心管中。加入300 mg C18粉, 涡旋30 s, 振荡5 min, 以4 500 r/min的速度离心5 min, 取5 mL上清液于35 ℃水浴中氮吹至干。用含0.1%甲酸的甲醇-水(1:9, v/v)溶液定容至1 mL, 过0.22μm水相滤膜, 待测。
色谱柱:CORTECS C18柱; 柱温:40 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样量:5 μL; 流动相A:含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液; 流动相B:含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵甲醇。梯度洗脱程序:0~2.0 min, 0~10%B; 2.0~3.0 min, 10%B~20%B; 3.0~4.0 min, 20%B ~21%B; 4.0~7.0 min, 21%B~26%B; 7.0~13.5min, 26%B~60%B; 13.5~17.5 min, 60%B~95%B; 17.5~21.0 min, 95%B~10%B。
离子源:可加热电喷雾离子(HESI)源; 扫描方式:正负模式分开扫描; 采集方式:全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/ddMS2), TopN=3(前3强); 离子传输管温度:325 ℃; 正离子模式下毛细管电压:3.0 kV; 负离子模式下毛细管电压:2.8 kV; 鞘气(N2)流速:40 arb; 辅助气流速:10 arb; 一级扫描分辨率:70 000;二级扫描分辨率:17 500;自动增益控制做Full Mass进入C-Trap(C形阱)中的目标离子数目:1×106; 自动增益控制做MS2进入C-Trap中的目标离子数目(AGC target): 2×105; 做二级质谱时所用的碰撞能为归一化碰撞能(stepped NCE): 20%、40%、60%;动态排除:6 s; 顶点激发:2~6 s。11种真菌毒素的质谱参数见表 1。
本研究对比了Thermo C18柱(100 mm×2.1 mm, 3μm)与Waters CORTECS C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.6μm)的分离效果, 发现Waters CORTECS C18柱分离效果、峰形等均优于Thermo C18柱。
对流动相进行了优化。比较了流动相A(水相)分别为含0.1%甲酸的1 mmol/L乙酸铵溶液、含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液、含0.5%甲酸的5 mmol/L乙酸铵溶液和流动相B(有机相)分别为含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵甲醇溶液、含0.5%甲酸的5 mmol/L乙酸铵甲醇溶液时的分离效果。结果表明, 在流动相A为含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液、流动相B为含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵甲醇溶液的条件下, 各目标物的分离效果和峰形较好。在HESI+电离模式下, 加入甲酸有利于提高正离子目标物的离子化效率、灵敏度、响应值和改善峰形, 但对负离子目标物有一定的抑制作用。在流动相A和流动相B中加入0.5%甲酸时, 负离子模式扫描下的雪腐镰刀菌烯醇(NIV)峰形较差, 响应强度降低；而加入0.1%甲酸时, 正负离子目标物峰形和响应值均较好。因此, 在流动相A和流动相B中各加入0.1%甲酸。在流动相中加入乙酸铵, 有助于改善目标物的峰形和保持流动相梯度洗脱中pH值的稳定性, 从而提高对目标峰积分的准确性。对比了流动相A分别为含0.1%甲酸的1 mmol/L乙酸铵溶液、2 mmol/L乙酸铵溶液和5 mmol/L乙酸铵溶液时的峰形, 结果发现, 使用含0.1%甲酸1 mmol/L乙酸铵溶液和5 mmol/L乙酸铵溶液时, 个别目标物出现拖尾峰；而使用含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液时, 各目标物峰形较好, 因此, 最后采用含0.1%甲酸的2 mmol/L乙酸铵溶液。11种真菌毒素混合标准溶液的提取离子流色谱图见图 1。
首先在分辨率(R)为70 000下对11种目标物进行高分辨质谱全扫描, 确定准分子离子[M+H]+、[M-H]-、[M+HCOO]-, 将理论精确质量数与实际测量质量数的误差控制在5 ppm(10-6)范围内。在二级扫描分辨率为17 500下, 调整动态排除、顶点激发、TopN、归一化碰撞能等参数来获得较好的碎片离子信息。当归一化碰撞能为20%、40%、60%, 顶点激发为2~6 s, TopN为3时, 可获得满意的二级碎片离子信息。
以面包为基质, 考察了甲醇、乙腈、乙酸乙酯的提取效果, 结果发现乙腈的提取效果最好。乙腈有较好的溶解性, 可以提取大多数非极性和部分极性真菌毒素, 通过盐析作用与水相分离, 极易从水相中萃取极性较弱的毒素。乙酸乙酯极性低于乙腈, 水溶性差, 对目标物的提取效率偏低, 尤其是CIT和DON(回收率低于5%)。用甲醇提取时, 氮吹浓缩后出现沉淀物质, 目标物提取的回收率普遍较低。使用含1%甲酸的甲醇-水(84:15, v/v)溶液提取时, AFs、CIT和T-2毒素回收率很低, HT-2回收率高于120%, 超出正常的回收率范围(60%~120%)。受面包中的淀粉和蛋白质影响, 这些组分在提取和净化过程中极易发生交联作用和形成网络结构, 使毒素难以从样品中分离出来[23]。加入一定比例的水可以提高有机溶剂对非水溶性物质的渗透性, 从而提高提取效率[24]。因此, 对比了含1%甲酸的乙腈、含1%甲酸的乙腈-水(90:10, v/v)溶液、含1%甲酸的乙腈-水(80:19, v/v)溶液、含1%甲酸的乙腈-水(70:30, v/v)溶液的提取效果。当乙腈体积分数为90%时, 提取效果最好; 当乙腈体积分数为80%和70%时, 部分目标物的回收率高于120%;当乙腈体积分数低于70%时, 氮吹困难, 不易吹干, 导致结果误差较大。有文献[24, 25]报道, 在提取溶剂中加入酸, 可以增强提取的效果。因此, 对比了在提取溶剂中加入1%甲酸和不加甲酸的提取效果, 结果表明, 加1%(v/v)甲酸的提取效果明显比不加甲酸的提取效果好, 详见图 2。
样品经提取后, 少量的蛋白质、油脂、色素等会与真菌毒素共同萃取出来, 影响结果的准确性, 污染分析检测的仪器。QuEChERS前处理技术常用乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨化炭黑(GCB)、C18(或十八烷基硅烷键合相吸附剂(ODS))、胺丙基键合硅胶(-NH2)、硅藻土等作为净化剂, 这些净化剂可通过极性或非极性作用使目标物和杂质相互分离[25]。对比了C18、GCB、-NH2和PSA的净化效果。用GCB净化时, AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2基本没有提取到, CIT的回收率低于40%, 可能是因为AFs为平面分子结构, 而GCB对平面分子结构或不完全平面分子结构的真菌毒素有较强的吸附作用, 从而影响这类真菌毒素的回收效果。有文献[6]报道, GCB可全部吸附饲料中的AFs。用-NH2净化时, 对CIT的影响较大, 其回收率为39.93%。用PSA净化时, AFB1和CIT回收率偏低, 分别为45.20%和30.60%(见图 3)。Desmarchelier等[7]认为PSA上的氨基容易与酸性毒素(如CIT等)上的羧基发生反应, 一般不适用于净化这类毒素。用C18作为净化剂时, 通过吸附非极性物质, 可除去样品中的淀粉、糖类和脂肪等, 起到很好的净化效果, 破坏淀粉分子和蛋白质分子的交联作用和打破其网络结构, 提高对目标物的回收率, 提取效率最好。因此最终选择C18作为净化剂。
对比了不同剂量(300、400、500、600和700 mg)的C18对11种真菌毒素的提取效果。结果发现, 当C18的量为400 mg时, AFM1、AFM2、T-2、HT-2和DON的回收率均高于120%;当C18的量为500 mg时, CIT、T-2、HT-2和DON的回收率高于120%;当C18的量为600 mg时, HT-2和DON的回收率高于120%(见图 4)。当C18的量为300和700 mg时, 所有目标化合物的回收率均较好, 都在正常的回收率范围内(60%~120%)。综合考虑, 选择加入300 mg的C18。
在优化的条件下, 以各目标化合物在质谱中的峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标进行线性拟合, 得到11种真菌毒素的线性方程和相关系数(r2)。各化合物的r2均不低于0.996 0。由于高分辨质谱仪信号很强, 噪声相对较低, 信噪比结果在很多情况下为无穷大, 所以3倍信噪比和10倍信噪比不再适用于使用高分辨质谱来确定检出限和定量限[18]。因此, 本研究确定的定量限为各目标物在线性范围中满足回收率值在60%~120%区间内的最低质量浓度(见表 2)。结果能够满足不同国家和地区的限量要求。
对阴性面包进行3个不同浓度水平的加标回收率和精密度试验, 每个添加水平重复测定6次, 结果见表 3。3个添加水平的平均回收率为64.38%~122.61%, RSD为1.52%~12.99%(n=6), 表明该方法具有良好的准确度和精密度。
从市场随机购买23批饼干、面包、蛋糕、蛋糕粉、面包粉和花生油等焙烤食品及其原料, 在最优条件下进行处理和分析。结果显示:烤奶风味饼干、结酥饼干、巧克力味饼干、卡布奇诺味饼干、全麦饼干和葡萄饼干6批样品均检出了AFB2, 含量分别为0.27、0.37、0.27、0.21、0.20和0.54 μg/kg; 花生油检出了AFG2, 含量为0.99 μg/kg; 蝴蝶酥饼干、蛋浆千层酥、玛利亚饼干、迪乐斯饼干(原味)、迪乐斯饼干(蔬菜味)、香脆饼干(芝麻味)、全麦饼干、葡萄饼干、香芋面包和蛋糕10批样品均检出了DON, 含量分别为16.96、24.17、12.64、29.47、31.96、31.72、28.93、25.36、44.97和62.29 μg/kg。典型阳性样品的提取离子流色谱图见图 5。
本研究建立了UPLC-HRMS测定焙烤食品及其原料中11种真菌毒素的检测分析方法。该方法简单、快速、高效, 准确度和精密度好, 能满足日常检测要求, 适用于对批量焙烤食品及其原料中11种真菌毒素进行定性和定量筛查。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 808-815
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