高效液相色谱-串联质谱法检测三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚


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张鹏¹, 赵楠楠², 苏杭¹, 金芬¹, 邵华¹, 金茂俊¹, 王珊珊¹, 佘永新¹, 郑鹭飞¹, 王静¹

1. 农业部农产品质量安全重点实验室, 中国农业科学院农业质量标准与检测技术研究所, 北京 100081;
2. 北京农学院, 北京 102206

收稿日期：2017-03-28

基金项目：科技基础性工作专项（2013FY110100）

通讯联系人：金芬, Tel:(010)82106570, E-mail:jinfenbj@163.com

摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱检测三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚（tristyrylphenol ethoxylates，TSPnEO）的分析方法，并对TSPnEO在反相色谱柱（XBridge C₁₈，150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、亲水相互作用色谱柱（XBridge HILIC，150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、氨基色谱柱（XBridge Amide，150 mm×2.1 mm，3.5 μm）、伪反相色谱柱（C₁₈柱（XBridge C₁₈，50 mm×2.1 mm，5 μm）与硅胶柱（Nova-Pak Silica，150 mm×2.1 mm，4 μm）串联）4种不同液相色谱分离模式下的分离效果进行了研究。实验比较了5 mmol/L乙酸铵水-乙腈、0.1%（v/v）甲酸水-乙腈、水-乙腈和水-甲醇4种流动相组成及3种梯度洗脱条件对分离效果和灵敏度的影响。探讨了TSPnEO在电喷雾离子（ESI）源内的离子化特征，结果表明，在ESI正离子模式下，TSPnEO在离子源内形成[M+NH₄]⁺离子，其聚合度的分布特征符合泊松分布。利用伪反相色谱柱，水-乙腈作为流动相，实现了不同聚合度（n=5~18）TSPnEO的分离。

关键词：高效液相色谱-串联质谱色谱保留农药助剂三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚

Determination of tristyrylphenol ethoxylates by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry

ZHANG Peng¹, ZHAO Nannan², SU Hang¹, JIN Fen¹, SHAO Hua¹, JIN Maojun¹, WANG Shanshan¹, SHE Yongxin¹, ZHENG Lufei¹, WANG Jing¹

1. Key Laboratory of Agro-products Quality and Safety, Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
2. Beijing University of Agriculture, Beijing 102206, China

Foundation item: Special Program for Basic Work of Ministry of Science and Technology (No. 2013FY110100)

Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the analysis of tristyrylphenol ethoxylates (TSPnEO) was established. The separation effects of TSPnEO in the four liquid chromatography modes, including reversed-phase liquid chromatography column (XBridge C₁₈, 150 mm×2.1 mm, 3.5 μm), hydrophilic interaction liquid chromatography column (XBridge HILIC, 150 mm×2.1 mm, 3.5 μm), amide column (XBridge Amide, 150 mm×2.1 mm, 3.5 μm) and C₁₈ column (XBridge C₁₈, 50 mm×2.1 mm, 5 μm) combined with silica column (Nova-Pak Silica, 150 mm×2.1 mm, 4 μm) were investigated. And the separation effects and sensitivity of TSPnEO in four mobile phases, such as 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution-acetonitrile, 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution-acetonitrile, water-acetonitrile and water-methanol, and three eluent gradient conditions were optimized too. The ionization behavior of TSPnEO in electrospray ionization (ESI) was also studied. The results showed that in the ESI positive ion mode, the identified adducts were[M+NH₄]⁺, and the distribution characterization was in Poisson-like distribution. The separation of TSPnEO (n=5-18) was achieved via C₁₈ column combined with the silica column and water-acetonitrile as mobile phases according to the degree of ethoxylation.

Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) chromatographic retention pesticide adjuvants tristyrylphenol ethoxylates (TSPnEO)

农药助剂(pesticide adjuvants)是指农药制剂加工和使用过程中除农药有效成分外的其他辅助物的总称^[1], 在农药制剂产品中所占比例为1%~99%^[2]。据统计, 2013年我国农药加工用的非离子型表面活性剂的需求量约3万吨, 产能为5万吨^[3], 而三苯乙烯基苯酚聚氧乙烯醚(TSPnEO)和烷基酚聚氧乙烯醚(APEO)是我国使用最多的两类非离子表面活性剂类的农药助剂。壬基酚聚氧乙烯醚(NPnEO)类农药助剂因其降解产物壬基酚(NP)具有内分泌干扰作用已被美国限制使用^[4], 2015年也被列入我国《农药助剂禁限用名单(征求意见稿)》中^[5]。已有研究表明, 非离子表面活性剂类农药助剂对蜜蜂具有危害^[6-8], 因此其对生态环境和人体健康的影响受到更多的关注。目前关于TSPnEO的毒性研究还很少, 刘迎等^[9]通过试验获得TSPnEO对斑马鱼的致死中浓度(LC₅₀)为84.46 mg/kg。美国已对TSPnEO在农药制剂中的使用量进行了规定^[10], 而我国尚未开展TSPnEO检测方法的研究。

TSPnEO是含有3个苯乙基和不同数目(n=5~27) 乙氧基链的非离子型聚合物(结构式见图 1), 其乙氧基的数目符合泊松分布。由于TSPnEO具有双亲性, 分离测定不同聚合度的单体非常困难。Glaubitz等^[11]系统比较了TSPnEO在3种离子源(大气压化学电离源(APCI)、大气压光电离源(APPI)和电喷雾离子源(ESI))下的离子化效果, 但缺乏色谱保留与其特性之间的相关研究; Gargano等^[12]采用全二维液相色谱法, 利用亲水相互作用色谱(HILIC)作为一维色谱、反相色谱(RPLC)作为二维色谱, 证明了HILIC和RPLC结合能够实现不同聚合度TSPnEO的分离, 但目前关于TSPnEO液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)检测方法的研究还未见报道。

图 1 TSPnEO的结构式 Fig. 1 Structural formula of tristyrylphenol ethoxylates (TSPnEO)

本研究采用LC-MS/MS研究了TSPnEO的二级碎片离子质谱裂解特征, 并采用反相C₁₈色谱柱与硅胶色谱柱串联, 实现了不同聚合度TSPnEO(n=5~18) 的色谱分离。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪(美国Agilent公司); XBridge C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm, 5 μm)、Nova-Pak Silica色谱柱(150 mm×2.1 mm, 4 μm)、Synapt G1四极杆飞行时间质谱仪和Mass-Lynx工作软件(美国Waters公司); API 5000三重四极杆质谱仪、Analysis工作软件(美国AB SCIEX公司); 十万分之一天平(瑞士Mettler Toledo公司); 涡旋混匀器(江苏海门其林贝尔仪器有限公司); Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)。

乙腈、甲醇均为色谱纯(美国Fisher公司); 乙酸铵为色谱纯(美国Sigma公司); TSPnEO技术级产品(纯度99%, 江苏南京钟山化工公司)。

称取10 mg TSPnEO标准品, 置于100 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至100 mL, 充分振荡混匀, 配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液, 再逐级稀释配制不同浓度的系列标准溶液。

1.2 分析条件

色谱柱:XBridge C₁₈色谱柱(50 mm×2.1 mm, 5 μm)和Nova-Pak Silica色谱柱(150 mm×2.1 mm, 4 μm)串联; 柱温:40 ℃; 进样体积:5 μL; 流动相:(A)水和(B)乙腈; 流速:0.2 mL/min。梯度洗脱程序:0~2 min, 100%B; 2~5 min, 100%B~90%B; 5~29 min, 90%B~65%B; 29~30 min, 65%B~100%B, 30~40 min, 100%B。

离子源:电喷雾离子源, 正离子模式; 离子源温度(TEM): 400 ℃; 电喷雾电压(ionspray voltage): 5 500 V; 雾化气压力(GS1): 207 kPa; 加热辅助气压力(GS2): 241 kPa; 气帘气压力(curtain gas, CUR): 207 kPa; 驻留时间:100 ms。不同聚合度的TSPnEO在多反应监测(MRM)模式的定量分析监测离子对、碰撞能量(collision energy, CE)、去簇电压(declustering potential, DP)、碰撞室入口电压(entrance potential, EP)和碰撞室出口电压(collision cell exit potential, CXP)见表 1。

表 1 不同聚合度的TSPnEO在多反应监测模式下的质谱参数 Table 1 MS parameters of TSPnEO with different ethylene oxide units under MRM mode

Degree of ethoxylation	Precursor ion (m/z)	Product ion (m/z)	Declustering potential/V	Entrance potential/V	Collision energy/V	Collision cell exit potential/V
5	644.5	105.1^*	99.57	8	78.56	16.09
		89.0	99.57	8	47.50	17.68
6	688.4	105.2^*	92.23	9	78.08	20.64
		89.1	92.23	9	49.35	18.65
7	732.4	105.2^*	85.29	7	84.47	20.63
		133.0	85.29	7	43.41	16.94
8	776.5	133.1^*	101.74	7	42.46	17.28
		105.3	101.74	7	92.53	20.54
9	820.4	133.1^*	96.82	4	44.29	17.42
		699.7	96.82	4	30.61	22.00
10	864.4	133.0^*	96.53	4	44.53	17.38
		177.3	96.53	4	39.72	16.92
11	908.4	133.2^*	118.21	3	46.30	17.01
		177.2	118.21	3	41.48	23.48
12	952.5	133.1^*	118.14	3	47.75	17.70
		177.2	118.14	3	43.20	17.69
13	996.4	133.1^*	100.21	4	49.71	17.68
		177.3	100.21	4	44.79	18.37
14	1040.5	133.1^*	104.77	7	51.15	17.44
		177.4	104.77	7	46.23	16.01
15	1084.5	133.1^*	106.04	8	52.13	17.49
		329.5	106.04	8	51.38	32.34
16	1128.5	133.1^*	107.83	8	54.71	17.05
		177.5	107.83	8	49.54	23.04
17	1172.5	133.0^*	89.86	5	55.57	17.34
		329.7	89.86	5	56.68	18.96
18	1216.5	133.1^*	90.46	10	58.24	16.93
		329.7	90.46	10	58.75	33.98
* Quantitative ion.

表 1 不同聚合度的TSPnEO在多反应监测模式下的质谱参数 Table 1 MS parameters of TSPnEO with different ethylene oxide units under MRM mode

2 结果与讨论

2.1 液相色谱分离模式

本研究比较了采用不同色谱柱时TSPnEO的分离效果。采用XBridge HILIC柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)时，TSPnEO的保留较弱, 不同聚合度的TSPnEO以单峰形式在2 min左右共流出, 无法达到有效分离, 且随着流动相中有机相比例的增加, TSPnEO的保留没有得到改善(见图 2a); 采用XBridge C₁₈反相色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)时，TSPnEO有一定的保留, 保留时间为12.85 min, 对于不同碳数的TSPnEO能够分离, 但并未实现不同聚合度TSPnEO的分离(见图 2b); 采用XBridge Amide色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm)时，TSPnEO的保留也较弱, 未能实现不同乙氧基聚合度TSPnEO的有效分离(见图 2c)。

图 2 采用不同色谱柱时TSPnEO(1 mg/L)的TIC Fig. 2 TIC of TSPnEO (1 mg/L) by different chromatographic columns a. column: XBridge HILIC column (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution program: 0-1 min, 50%B; 1-5 min, 50%B-70%B; 5-8 min, 70%B-95%B; 8-16 min, 95%B, 16-18 min, 95%B-50%B; 18-30 min, 50%B; b. column: XBridge C₁₈ column (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); mobile phases: (A) water and (B) methanol; gradient elution program: 0-0.5 min, 20%B; 0.5-5.0 min, 20%B-45%B; 5.0-8.0 min, 45%B-70%B; 8.0-16.0 min, 70%B; 16-18 min, 70%B-20%B; 18.0-30.0 min, 20%B; c. XBridge Amide column (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-2 min, 98%B; 2-10 min, 98%B-55%B; 10-19 min, 55%B; 19-20 min, 55%B-98%B; 20-30 min, 98%B; d. column: XBridge C₁₈ column (50 mm×2.1 mm, 5 μm) combined with Nova-Pak Silica column (150 mm×2.1 mm, 4 μm); mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution program: 0-2 min, 100%B; 2-5 min, 100%B-90%B; 5-29 min, 90%B-65%B; 29-30 min, 65%B-100%B, 30-40 min, 100%B.
TIC: total ion chromatograms.

考虑到TSPnEO亲水基团的存在, 本研究将XBridge C₁₈反相色谱柱(50 mm×2.1 mm, 5 μm)与Nova-Pak Silica正相色谱柱(150 mm×2.1 mm, 4 μm)串联, 形成伪反相, 采用水-乙腈作为流动相体系, 实现了不同聚合度(n=5~18) TSPnEO的色谱分离(见图 2d)。由于正相色谱柱固定相硅胶上裸露的硅羟基可能对流动相中的羟基形成活性吸附位点, 本研究通过优化, 确定在每次进样前采用10 min的乙腈冲洗色谱柱, 以降低硅胶色谱柱对水中羟基的强吸附, 保证方法的稳定性。通过研究, 采用反相-正相液相色谱柱串联的方式, 可实现对同时具有疏水基团和亲水基团的双亲聚合物的有效分离, 这与Gargano等^[12]的结论一致。

2.2 流动相条件的优化

本研究比较了不同配比、不同梯度的流动相对TSPnEO分离效果的影响。TSPnEO在5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈3种流动相条件下的色谱图见图 3。在水-乙腈流动相中加入适量乙酸铵或甲酸, TSPnEO的保留时间和分离度没有明显差异, 但灵敏度在水-乙腈流动相体系下最高。此外, 本研究还比较了水-乙腈和水-甲醇作为流动相体系时的色谱分离性能和灵敏度, 发现当采用水-甲醇作为流动相时, 系统压力较大, 在连续6次进样后, 色谱柱的柱效明显降低, 对TSPnEO已经没有保留, 用乙腈平衡2 h以上, 才能恢复部分柱效。因此, 本实验采用水-乙腈作为流动相进行梯度洗脱。

图 3 TSPnEO标准溶液(1 mg/L)在不同流动相体系下的TIC Fig. 3 TIC of TSPnEO standard solutions (1 mg/L) with different mobile phases Mobile phases: a. 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution-acetonitrile; b. 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution-acetonitrile; c. water-acetonitrile.

本实验对流动相的梯度洗脱程序进行了优化。如图 4所示, 在3种梯度洗脱程序下, 色谱峰都已实现基线分离。但是以TSP12EO的色谱峰为例, 3种梯度洗脱程序下其响应值分别为4.6×10⁴、7.2×10³和5.7×10⁴ cps。考虑到方法的灵敏度, 本研究采用梯度洗脱程序3(详见1.2节)对TSPnEO进行分离。

图 4 不同梯度洗脱程序下TSPnEO标准溶液(100 μg/L)的TIC Fig. 4 TIC of TSPnEO standard solutions (100 μg/L) under different gradient elution programs Mobile phases: (A) water and (B) acetonitrile; gradient elution programs: a. 0-2 min, 100%B; 2-20 min, 100%B-65%B; 20-23 min, 65%B-100%B; 23-30 min, 100%B; b. 0-2 min, 100%B; 2-30 min, 100%B-73%B; 30-32 min, 73%B-100%B; 32-40 min, 100%B; c. 0-2 min, 100%B; 2-5 min, 100%B-90%B; 5-29 min, 90%B-65%B; 29-30 min, 65%B-100%B, 30-40 min, 100%B.

2.3 离子化特征

根据文献^[11]可知, 采用APCI源时, TSPnEO在离子源内发生降解, 无法确定不同乙氧链TSPnEO的分布; 采用APPI源时, TSPnEO在APPI源内的降解相比APCI源时较少, 不同离子峰呈t分布, 但由于其易形成[M+Na]⁺离子峰, 难以获得二级质谱信息; 采用ESI源时, TSPnEO在ESI源内不易发生降解, 产生[M+NH₄]⁺和[M+2NH₄]²⁺离子簇, 最大程度上保留了目标物的分布特征。因此, 本研究采用ESI源, 并依据TSPnEO的结构特征, 选择在正离子模式下进行全扫描, 以[M+NH₄]⁺作为母离子; 在碎片离子扫描模式下, 通过优化电离电压及碰撞电压等参数, 确定每种物质的特征碎片离子峰。

ESI源是用于分析极性化合物的一种常用的软电离技术, 在一定电压下能产生多电荷离子。TSPnEO在ESI⁺模式下, 易形成单电荷[M+NH₄]⁺、[M+Na]⁺、[M+H]⁺和双电荷[M+2NH₄]²⁺的准分子离子峰。如图 5所示, [M+NH₄]⁺和[M+2NH₄]²⁺的相对离子丰度最高, 对于聚合度较低的TSPnEO更易形成[M+NH₄]⁺, 其中[TSP12EO+NH₄]⁺的相对丰度最高, 且聚合度n为5~18的单电荷[TSPnEO+NH₄]⁺的相对离子丰度呈泊松分布; 对于聚合度较大的TSPnEO, 在ESI正离子模式下, 更易形成[TSPnEO+2NH₄]²⁺的双电荷离子峰，其相对离子丰度也呈泊松分布。

图 5 TSPnEO在ESI源下的全扫描质谱图 Fig. 5 Full scan mass spectrum of the TSPnEO in ESI mode M: TSPnEO.

3 结论

本文采用水-乙腈作为流动相, 利用反相C₁₈柱和正相硅胶色谱柱串联, 成功分离了不同聚合度的TSPnEO(n=5~18), 利用多反应监测模式(MRM)建立了LC-ESI-MS/MS检测TSPnEO(n=5~18) 的方法。

参考文献

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