色谱  2017, Vol. 35 Issue (8): 891-896   PDF    
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魏云计
冯民
朱臻怡
何健
沈金荣
何正和
秦娴
周利英
高效液相色谱-串联质谱法同时测定饲料中11种霉菌毒素
魏云计1 , 冯民1 , 朱臻怡1 , 何健1 , 沈金荣1 , 何正和1 , 秦娴1 , 周利英2     
1. 淮安出入境检验检疫局国家饲料安全检测重点实验室(淮安), 江苏 淮安 223001;
2. 昆山出入境检验检疫局, 江苏 昆山 215300
收稿日期：2017-03-30
基金项目：江苏检验检疫局科研项目（2016KJ35）
通讯联系人：魏云计, Tel:83336508, E-mail:jswyj_84@163.com
摘要：建立了高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时检测饲料中11种霉菌毒素的分析方法。样品经乙腈提取，MycoSep 228多功能净化柱填料和PRIME HLB固相萃取柱净化；采用Agilent Zorbax SB-C18色谱柱（150 mm×2.1 mm，3.5 μm）分离，以甲醇和5 mmol/L乙酸铵水溶液（含0.1%（v/v）甲酸）为流动相梯度洗脱；采用ESI源正、负离子同时扫描，多反应监测（MRM）模式测定，内标法定量。结果表明，11种目标物在各自的线性范围内线性关系良好，相关系数均大于0.99，定量限为2.0~50.0 μ g/kg。11种霉菌毒素在3个加标水平（1、2、5倍定量限）下的平均回收率为79.3%~101.6%，相对标准偏差（RSD）为5.9%~13.2%（n=5）。该法简单快速，净化效果好，灵敏度高，适用于饲料中11种霉菌毒素的分析。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    固相萃取    多功能净化柱填料    霉菌毒素    饲料    
Simultaneous determination of 11 mycotoxins in feeds by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
WEI Yunji1, FENG Min1, ZHU Zhenyi1, HE Jian1, SHEN Jinrong1, HE Zhenghe1, QIN Xian1, ZHOU Liying2     
1. State Key Laboratory of Feed Safety Testing(Huai'an), Huai'an Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Huai'an 223001, China;
2. Kunshan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Kunshan 215300, China
Foundation item: Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Science and Technology Project (No. 2016KJ35)
Abstract: A high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) method was developed for the simultaneous determination of 11 mycotoxins in feeds. The samples were extracted with acetonitrile, then cleaned up by multifunctional purification column filler and PRIME HLB solid phase extraction column. The 11 mycotoxins were separated on an Agilent Zorbax SB-C18 column (150 mm×2.1 mm, 3.5 μm) with gradient elution program, and methanol-5 mmol/L ammonium acetate solution containing 0.1%(v/v) formic acid were used as mobile phases. The target compounds were detected under electrospray ionization (ESI) both in positive and negative modes with multiple reaction monitoring mode, and quantified by internal standard method. The results indicated that the 11 mycotoxins showed good linear relationships in their respective linear ranges, and the correlation coefficients were greater than 0.99. The limits of quantification (LOQs) were between 2.0 and 50.0 μ g/kg. The average recoveries were between 79.3% and 101.6% at three spiked levels (1, 2 and 5 times LOQs) with relative standard deviations (RSDs) of 5.9%-13.2% (n=5). The method is simple, rapid, sensitive, and can be used for the analysis of the 11 mycotoxins in feeds.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     solid phase extraction (SPE)     multifunctional purification column filler     mycotoxins     feeds    

霉菌毒素(mycotoxins)又称真菌毒素, 是一类受霉菌污染的食品、饲料、农作物等植物源性产品产生的有毒次级代谢产物。目前在自然界中发现并确定化学结构的霉菌毒素有400多种[1-3], 其中毒性较强、倍受关注的霉菌毒素主要有黄曲霉毒素(AFs)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、伏马毒素(FBs)、赭曲霉毒素A(OTA)、T-2毒素(T-2) 等。研究表明, 霉菌毒素不仅影响食品和饲料的品质, 还可以通过食物链进入人和动物体内, 引起人和动物急性或慢性中毒, 并损害机体的肝脏、肾脏、神经组织、造血组织及皮肤组织等, 对人类和动物的健康造成极大危害。如AFs除了具有较强的致癌性, 还具有致畸、致突变性; ZEN主要危害生殖系统, 造成不孕或流产。国际癌症研究机构将黄曲霉毒素B1(AFB1) 划为Ⅰ类致癌物[4], 霉菌毒素已被世界卫生组织纳入食品安全体系重点监测内容, 多个国家和组织都制定了严格的限量标准, 我国对食品和饲料中霉菌毒素的含量也制定了最高限量标准[5, 6]。

目前, 国内外关于食品和饲料中霉菌毒素检测方法的报道较多, 主要有薄层色谱法[7, 8]、酶联免疫吸附法[9-11]、液相色谱法[12, 13]、气相色谱法[14]、气相色谱-质谱法[15]、液相色谱-串联质谱法[16-29]等。薄层色谱法和酶联免疫吸附法操作简单、快速, 但灵敏度低和准确度较低, 容易受到基质的干扰, 出现假阳性结果; 液相色谱法一般采用柱前或柱后衍生的方法进行测定, 需要配备衍生装置, 成本较高, 检测周期长; 气相色谱法和气相色谱-质谱法需要对目标物进行衍生化反应处理, 方法的稳定性较差, 目前国内标准方法中暂未采用该种方法。由于霉菌毒素的化学性质和分子结构差异较大, 上述几种方法只能针对一种或一类霉菌毒素进行分析。液相色谱-串联质谱法的选择性好，抗干扰能力强，灵敏度高, 对样品的前处理要求相对较低, 可以准确定性、定量多种类的霉菌毒素, 已成为近几年来霉菌毒素测定的主要方法。

本文将PRIME HLB小柱与MycoSep 228多功能净化柱填料结合, 建立了液相色谱-串联质谱同时测定饲料中11种霉菌毒素的方法。该方法操作简单, 快速, 经济, 定量限满足国家对饲料中霉菌毒素的监控要求。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Scientific Accela液相色谱仪、TSQ Quantum Ultra EMR串联质谱仪(美国Thermo公司); Zorbax SB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm, 美国Agilent公司); 3K15低温冷冻离心机(美国Sigma公司); SB-5200DTD超声仪(宁波新芝生物科技股份有限公司); Oasis PRIME HLB小柱(60 mg/3 mL, 美国Waters公司); Mycosep 228多功能净化柱填料(美国Romer公司)。

甲醇(色谱纯, 德国Merck公司); 乙腈、正己烷(分析纯, 南京化学试剂股份有限公司)。实验用水均为Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备。AFB1、黄曲霉毒素B2(AFB2)、黄曲霉毒素G1(AFG1)、黄曲霉毒素G2(AFG2)、黄曲霉毒素M1(AFM1)、黄曲霉毒素M2(AFM2)、ZEN、伏马毒素B1(FB1)、T-2、HT-2毒素(HT-2)、脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)和13C17-黄曲霉毒素B1(13C17-AFB1) 标准品均购自美国Sigma公司。

1.2 标准溶液的配制

分别称取10 mg各标准品于10 mL容量瓶中, 用甲醇溶解定容, 得到质量浓度为1.0 g/L的单标准储备液, 于-18 ℃冰箱中避光保存; 取上述各单标准储备液, 用甲醇稀释成质量浓度为1.0 mg/L的标准工作液, 于4 ℃冰箱中避光保存。

1.3 样品前处理

称取(5.00±0.05) g饲料于50 mL具塞离心管中, 依次加入100 μL质量浓度为1.0 mg/L的内标标准工作液和20 mL乙腈, 在涡旋混合器上混匀30 s后, 超声提取15 min, 以8 000 r/min离心5 min, 取4 mL上清液, 备用。

在PRIME HLB小柱中装填0.2 g MycoSep 228多功能净化柱填料, 压好筛板, 制成固相萃取柱。取4 mL上述提取液上样至固相萃取柱中, 使其在重力作用下自然流出, 收集上样液, 待流干后, 加入2 mL乙腈洗脱, 收集洗脱液, 合并后, 于45 ℃水浴中氮吹至干, 用1 mL甲醇-水(4：6, v/v)溶解残渣, 混匀后经0.22 μm滤膜过滤, 供仪器测定。

1.4 分析条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5 μm); 柱温:30 ℃; 流动相:A为甲醇, B为5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸); 流速:250 μL/min; 进样量:25 μL。梯度洗脱程序:0~3.0 min, 25%A; 3.0~4.0 min, 25%A~60%A; 4.0~9.0 min, 60%A~90%A; 9.0~9.5 min, 90%A~25%A; 9.5~12.0 min, 25%A。

离子源:电喷雾离子(ESI)源；扫描模式：正、负离子同时扫描; 离子源温度:400 ℃; 离子传输管温度:350 ℃; 喷雾电压:3 000 V(ESI+), 2 500 V(ESI-); 鞘气压力:4.5 MPa; 辅助气压力:1 MPa; 检测方式：多反应监测(MRM)模式。其他质谱条件见表 1。

表 1 MRM监测模式下11种霉菌毒素的质谱参数 Table 1 MS parameters of the 11 mycotoxins in multiple reaction monitoring (MRM) mode
2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

本文采用流动相注射分析的方法对质谱条件进行了优化, 通过三通阀将注射泵、蠕动泵和质谱仪连接起来, 以甲醇-水(80：20, v/v)为流动相, 通过蠕动泵注入混合标准溶液, 采用六通阀控制流动相的切入和切出。分别在正、负离子模式下对目标物进行扫描, 结果发现, 除ZEN在负离子模式下获得最佳响应信号形成[M-H]-离子峰外, 其他目标物在正离子模式下的响应值均高于在负离子模式下的响应值。AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、DON及FB1形成[M+H]+离子峰; HT-2和T-2形成[M+NH4]+和[M+Na]+离子峰, 但[M+Na]+离子峰的响应强度和稳定性均优于[M+NH4]+离子峰, 因此选取[M+Na]+作为HT-2和T-2的准分子离子峰。对每种物质的准分子离子峰进行二级质谱分析, 得到其相应的碎片离子信息, 然后对碰撞能量、碰撞气、辅助气、喷雾电压、透镜补偿电压等二级质谱参数进行优化, 使每种物质的分子离子与特征碎片离子产生的离子对的响应强度达到最佳, 优化后的参数见表 1。选择相对丰度最强, 色谱峰无干扰的碎片离子作为定量离子, 其他离子作为定性离子。

2.2 色谱条件的优化

本文考察了在甲醇-水、乙腈-水、甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液、甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)、乙腈-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸) 8种流动相体系下目标物的分离效果、响应强度及峰形。实验结果表明, 乙腈对目标物的离子化存在抑制现象, 目标物的离子化效率较甲醇作有机相时低; 在水相中加入0.1%(v/v)甲酸有利于增强正离子监测模式下分析物的离子化效率, 增强信号响应, 提高检测灵敏度; 加入乙酸铵不仅改善了峰形, 还使方法的稳定性更好, 提高了霉菌毒素的响应强度。因此本实验选择甲醇-5 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)作为流动相。

2.3 前处理条件的优化
2.3.1 提取溶剂的优化

根据文献[25, 27]报道, 样品中霉菌毒素的提取溶剂主要为乙腈水溶液或甲醇水溶液。本文在已有文献的基础上结合目标物的性质和饲料样品的特性, 在空白饲料样品中添加5.0 μg/kg AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2, 20.0 μg/kg ZEN、T-2、HT-2, 50.0 μg/kg FB1和100.0 μg/kg的DON标准品, 比较甲醇、甲醇-水(84：16, v/v)、甲醇-水(80：20, v/v)、乙腈-水(84：16, v/v)、乙腈-水(80：20, v/v)、乙腈作为提取溶剂时目标物的回收率(见图 1)。结果表明, 随着体系中有机溶剂比例的提高, 目标物的回收率逐渐增加, 同比例的乙腈-水体系的提取效率高于甲醇-水体系, 当采用乙腈时, 目标物的回收率最高, 因此选为实验所用。

图 1 不同提取溶剂对目标物回收率的影响 Fig. 1 Effect of different extraction solvents on recoveries of the target compounds
2.3.2 净化方法的优化

由于饲料成分复杂, 提取的基质干扰物较多, 严重影响了目标物的分析测定, 同时过多的杂质也可导致色谱柱和质谱系统使用寿命的缩短, 因此需要对样品进行净化处理。文献[4, 20]报道的霉菌毒素的净化方法大多采用免疫亲和柱、多功能净化柱进行净化处理, 但上述两种净化柱价格较高, 且免疫亲和柱具有高度特异性, 对于多种毒素的同时净化难度较大。实验考察了采用自制固相萃取柱、MycoSep 228多功能净化柱、Oasis PRIME HLB柱、Oasis HLB柱时的净化效果。实验发现, MycoSep 228填料是由极性、非极性及离子交换等基团组成的填充剂, 可选择吸附样液中的脂类、蛋白质等杂质, 采用MycoSep 228多功能净化柱时, AFs、ZEN、T-2的净化效果最好, 回收率为62.7%~76.4%, 但FB1的回收率较低, 且受干扰较大; Oasis PRIME HLB是一种新型的反相固相萃取剂, 能够有效去除基质中的蛋白质、磷脂干扰物, 降低基质效应, 采用Oasis PRIME HLB柱时, FB1的净化效果最佳, 回收率为72.1%, 对其他几种物质的净化效果均低于MycoSep 228多功能净化柱; Oasis HLB柱对AFs净化效果较好, 回收率为50.2%~65.3%, 对ZEN和FB1的净化效果较差, 回收率低于10%。采用自制固相萃取柱获得了最佳的净化效果, 回收率为68.1%~82.5%, 自制固相萃取柱对目标物无吸附, 对蛋白质、磷脂等基质干扰物有较好的吸附作用, 能够有效去除干扰, 保证回收率的稳定性。

2.4 线性范围与定量限

实验已通过净化柱去除大部分基质的干扰, 但饲料基质较为复杂, 依然存在基质抑制效应, 且各目标物缺少一一对应的同位素内标物进行定量, 而无法消除基质效应。因此本文采用基质标准曲线定量以降低基质效应的影响, 提高回收率。

取适量的标准储备液, 用空白基质溶液配制成基质混合标准工作液, 在优化的实验条件下测定, 以分析物峰面积与内标峰面积的比值为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, μg/L)绘制标准曲线。11种目标物在其线性范围内线性关系良好, 相关系数(r2)均大于0.99(见表 2)。在空白饲料基质中添加适量的混合标准品, 以信噪比(S/N)≥10时的响应计算方法的定量限(LOQ), 为2.0~50.0 μg/kg。添加定量限浓度时饲料中目标物的MRM色谱图见图 2。

表 2 11种霉菌毒素的线性范围、回归方程、相关系数和定量限 Table 2 Linear ranges, linear equations, correlation coefficients (r2) and limits of quantification (LOQs) of the 11 mycotoxins

图 2 加标饲料中11种霉菌毒素及内标的MRM色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the 11 mycotoxins and internal standard spiked in feed samples in MRM mode
2.5 回收率和精密度

在空白饲料样品中添加1、2、5倍定量限水平的霉菌毒素混合标准品溶液, 每个添加水平重复5次, 用内标法定量, 得到方法的回收率及精密度, 结果见表 3。目标物的平均回收率为79.3%~101.6%, 相对标准偏差(RSD)为5.9%~13.2%(n=5)。

表 3 饲料中11种霉菌毒素的加标回收率和相对标准偏差（n=5) Table 3 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 11 mycotoxins spiked in feed samples (n=5)
2.6 实际样品检测

采用本方法对78份饲料样品进行测定, 其中8份样品检测出AFB1, 含量为3.4~9.5 μg/kg; 16份样品检测出DON, 含量为62.7~193.5 μg/kg; 11份样品检测出ZEN, 含量为18.3~49.5 μg/kg; 9份样品检测出T-2, 含量为14.5~38.9 μg/kg; 23份样品检测出FB1, 含量为29.4~90.5 μg/kg; 其他几种物质均未检出。

3 结论

本文建立了高效液相色谱-串联质谱测定饲料中11种霉菌毒素的分析方法, 以乙腈作为提取溶剂, MycoSep 228多功能净化柱填料和PRIME HLB固相萃取柱作为净化手段。本方法前处理操作简单, 稳定性好, 回收率和灵敏度高, 检测成本低, 定量限满足国内外标准的要求, 适用于饲料中11种霉菌毒素的定性定量分析。

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