镇静剂是有效的抗焦虑药物, 直接作用于中枢神经系统, 能减弱机能活动, 防止狂躁, 治疗抑郁, 利于镇定和安眠。临床上常见包括吩噻嗪类的氯丙嗪(chlorpromazine)、苯二氮卓类的地西泮(diazepam)和喹唑酮类的安眠酮(metolazone)等。近年来, 不法商人在畜禽甚至渔业饲养过程中添加此类药物限制动物运动, 以达到镇静催眠、促进生长和增重催肥的目的。随着镇静剂不可避免地在动物组织中残留, 对人体产生的间接毒副作用(如对中枢神经系统的不良影响)开始引起人们的广泛关注, 因此镇静剂类药物被许多国家列为禁用药物。国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、澳大利亚等国家和组织均对畜肉中镇静剂的检出限和最高限量值做出了相关规定。2002年我国农业部235号公告已明确规定地西泮和氯丙嗪允许作治疗用但不得在动物性食品中检出; 安眠酮禁止使用[1]。农业部176号公告也规定精神药物严禁在饲料和动物饮用水中使用[2]。
目前, 检测镇静剂的方法有酶联免疫法(ELISA)[3, 4]、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)[5-8]、液相色谱法(LC)[9, 10]和液相色谱-串联质谱法等(LC-MS/MS)[11-14]。其中, ELISA稳定性和重复性较差, 容易出现假阳性, 结果需其他方法确证; LC干扰大, 定性能力差, 灵敏度低; GC-MS虽有较好的灵敏度, 但需要进行衍生化, 耗时较长且操作繁琐, 不适合大批量样品操作。LC-MS/MS作为目前报道较多的方法, 具有更好的灵敏性和更高的特异性, 可以提供待测物的结构信息, 是对镇静剂类药物准确定性和精确定量的理想方法。国内外文献报道关于此类药物的检测以尿液[15]、血样[8]或单一基质为主, 以多种动物组织为对象的分析研究还比较少, 其中使用分散固相萃取作为净化方式更是鲜少报道。本研究选取3大类镇静剂中最具代表性的3种药物作为目标物, 采用改良的QuEChERS前处理方法, 结合高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)技术, 实现了4种动物组织镇静剂类药物的检测。与现有国标方法[16]和行标方法[17]相比, 本方法不仅简化了操作步骤、缩短了检测时间、节约了实验成本, 而且目标物受基质干扰更少、适应范围更广、灵敏度和回收率更高, 适用于大批量样品的快速分析, 能够满足我国相关监管部门的技术要求。
QTRAP 4000三重四极杆串联质谱仪, 带电喷雾离子源(ESI)、Analyst仪器控制及数据处理软件(AB SCIEX公司); UFLC-XR液相色谱仪, 包括输液泵LC-20AD、自动进样器SIL-20AC和柱温箱CTO-20AC(岛津公司); BT223S型电子天平(Sartorius公司); 3-30K高速离心机(SIGMA公司); Biotage Turbo Vap氮吹仪(Biotage公司); T25 digital均质仪和MS 3 basic涡旋混合器(IKA公司); 200 μL和1 mL可调微量移液器(吉尔森公司)。
氯丙嗪、氯丙嗪-D6, 纯度均大于98%(Dr. Ehrenstorfer公司), 地西泮(100 μg/mL, Cerilliant公司), 地西泮-D5(1.0 mg/mL, Cerilliant公司), 安眠酮(0.1 mg/mL, LGC公司); 乙腈、甲醇(HPLC级, Fisher公司), 甲酸(色谱纯, Merck公司); N-丙基乙二胺(PSA) (40~63μm, 6 nm, CNW公司)、C18(LC-C18 40~63μm, CNW公司)、NH2填料(BESTOWN-振翔公司); 其他未作特殊说明的试剂均为分析纯。
准确称取各标准品适量, 均用甲醇溶解并定容, 配成100 mg/L的单标准储备液, 于-18 ℃下避光保存。分别移取各单标准储备液, 用甲醇稀释成5.0 mg/L的混合标准中间溶液, 于-18 ℃下避光保存, 有效期6个月。根据需要用甲醇逐级稀释配成适当浓度的混合标准工作液, 现用现配。
准确称取各内标适量, 均用甲醇溶解并定容, 配成100 mg/L的内标储备液, 于-18 ℃下避光保存。分别移取各内标储备液, 用甲醇稀释成5.0 mg/L的混合内标中间溶液, 于-18 ℃下避光保存, 有效期6个月。再用甲醇稀释成0.1 mg/L的混合内标工作液, 有效期3个月。
准确称取匀质后样品5.00 g(精确至0.01 g)置于50 mL具塞离心管中, 添加100 μL同位素内标混合工作液, 加入5 g无水Na2SO4粉末和10 mL乙酸乙酯均质提取1 min; 再用15 mL乙酸乙酯清洗均质刀头上的残渣10 s, 洗涤液保留备用。均质后充分振荡提取, 以4 000 r/min的速度离心5 min, 收集上清液。残余物用洗涤液再振荡提取一次, 合并两次上清液, 混合均匀, 待净化。
精密移取上清液5 mL至装有10 mg PSA、100 mg C18和400 mg NH2填料的15 mL离心管中, 涡旋振荡2 min, 以10 000 r/min的速度离心5 min。
取上清液转移至试管, 40 ℃氮吹至干, 用1 mL乙腈-5 mmol/L甲酸(30:70, v/v)溶解残渣, 过0.22μm有机滤膜, 滤液供HPLC-MS/MS测定。
液相色谱条件:Atlantis T3色谱柱(100 mm×4.6 mm, 3μm); 柱温:40 ℃; 流速:0.35 mL/min; 进样量:5 μL; 流动相:A为5 mmol/L甲酸溶液, B为乙腈溶液; 洗脱梯度见表 1。
质谱条件:电喷雾离子源, 多反应监测(MRM), 正离子模式; 喷雾电压(IS): 4 500 kV; 气帘气压力(CUR): 20 MPa; 碰撞气压力:10 MPa; 离子源温度:550 ℃; 离子源GS1(喷雾气): 70 MPa; GS2(辅助气): 65 MPa。其他参数见表 2。
酰胺结构的精神类药物偏碱性且极性较大[8], 而此类药物的基质干扰组分主要为脂肪等非极性物质, 因此选择极性柱会有利于药物杂质的分离。Atlantis T3色谱柱对极性化合物的保留强, 色谱峰形尖锐对称, 分离效果好, 且耐用, 柱压小, 较好地改善了普通C18柱对碱性化合物分离不佳、柱寿命短以及因碱性分析物与柱填料上残留硅醇基所发生的次级作用而导致峰形恶化的状况。用Atlantis T3柱建立的方法目标化合物的保留时间接近, 有效地提高了仪器的使用效率。3种镇静剂类药物及其内标的总离子流色谱图和提取离子色谱图见图 1。
根据目标物的化学结构(见图 2), 配制质量浓度为500 μg/L的镇静剂类标准溶液, 选择ESI+的电离模式, 对目标物进行一级质谱扫描, 均可获得较高响应的母离子[M+H]+。对去簇电压进行优化后, 再进一步对碰撞能进行优化, 使选定的特征碎片离子强度达到最大。选取2个丰度强且稳定的碎片离子作为定性与定量离子, 以满足欧盟657/2002/EC号指令[18]对于禁用药物液相色谱-质谱方法定性监测的规定, 即满足1个母离子、至少2个子离子共4个识别点数的要求。最后, 对方法的喷雾电压、气帘气压力、离子源温度等参数进行了优化。3种镇静剂类药物优化后的质谱条件见表 2。
本研究中的几种化合物性质各异。现有标准与文献的方法中一般用甲醇[19]、乙腈[20]、正己烷[21]、乙酸乙酯[22]和碱性二氯甲烷[23]。甲醇作为提取溶剂时, 由于极性极强, 提取出来较多杂质, 色谱出峰前后杂峰太多, 给分析带来干扰; 乙腈作为提取溶剂时对于脂溶性吩噻嗪类的氯丙嗪提取效率较低, 且因氮吹时间较长, 整体回收率不理想; 正己烷作为提取溶剂时, 对地西泮和安眠酮吸附作用较大, 且提取出来的油脂杂质较多, 后续较难净化; 碱性二氯甲烷与乙酸乙酯作为提取溶剂的提取效率并无明显差异, 但考虑到乙酸乙酯毒性较低且提取液在上层利于后续操作, 最后选择乙酸乙酯作为提取溶剂。
镇静类药物的分析方法中, 大多使用固相萃取柱如HLB[14, 22, 24]、混合型阳离子交换固相萃取小柱(MCX)[11, 20, 25, 26]、C18[5-7]甚至冷冻除脂[27, 28]进行净化, 鲜少采用QuEChERS[29]作为净化方式。
本文比较了常用脱水剂无水硫酸镁和无水硫酸钠对萃取回收率的影响。发现无水硫酸镁中的镁离子可能会与胺类发生配位作用[30], 且溶于水后产生较大的热量从而导致热不稳定的氯丙嗪和地西泮损失较大; 而加入无水硫酸钠既可以除去基质中的水分, 又有盐析作用可以除去部分蛋白质, 也不至于大量放热导致目标物损失, 故更利于药物的提取。
在净化吸附剂的选择上, 考虑到动物肌肉存在大量蛋白质、碳水化合物和水分, 肾脏和肝脏中存在色素、脂肪和甾醇等杂质。在常用的净化吸附剂中, 石墨化炭黑(GCB)对平面结构分子有很强的亲和性, 能有效地去除色素和甾醇, 但同时也吸附具有平面结构的兽药[31], 所以不予考虑。PSA吸附蛋白质、糖类和极性较高的酸性物质, C18吸附脂肪等非极性干扰物, 而NH2填料可除去有机酸, 且与C18协同净化效果较好[32]。本研究比较了C18、PSA和NH2填料3种吸附剂的净化效果，结果表明, 3种吸附剂对净化结果各有不同程度的影响。单独使用某一种吸附剂的结果如下:在5 mL提取液中加入一般用量的C18，安眠酮两对离子均出现干扰峰, 且基线噪声大, 但消除了其余两个组分的干扰; PSA对地西泮的定性离子对m/z 285.1＞193干扰较严重, 而安眠酮定性离子对m/z 251.2＞91.1的杂峰则基本除净; NH2填料仅对安眠酮定性离子对的基线影响较大。3种吸附剂各有优缺点, 可以尝试按不同比例搭配使用。分别组合C18(100 mg、200 mg、300 mg)和NH2填料(200 mg、400 mg), 发现C18 100 mg+NH2填料400 mg组合的协同净化作用最佳, 但安眠酮定性离子对的杂峰依然很多, 因此在此基础上搭配PSA(10 mg, 20 mg, 30 mg, 40 mg)再进行试验, 最终得到C18 100 mg+NH2填料400 mg+PSA 10 mg组合的净化作用最为理想(见图 3)。
本研究在建立HPLC-MS/MS检测方法时, 考虑到不同基质中必然存在的基质效应(matrix effect, ME), 根据实际情况及可操作性, 按Matuszewski等[33]提出的提取后添加法评价基质效应。以阴性空白基质提取液作为溶剂, 配制0.5 μg/L的混合标准溶液, 测定其峰面积为A; 以定容液为溶剂配制0.5 μg/L的混合标准溶液, 测定其峰面积为B。基质效应ME=A/B×100%, 结果见表 3。其中, ME＞100%为基质增强效应, ME＜100%为基质抑制效应, ME=100%可以当作基质效应不存在, 这是最为理想的一种情况, 也是建立检测方法时所追求的最高目标。但实际操作中, 理想情况很难得到, 所以一般相对比值在85%~115%之间则认为基质效应不明显[34]。
可以看出, 经QuEChERS方法优化的前处理技术提取所得的样液基质效应不明显, 且本实验采用了能够有效补偿基质效应的同位素内标法[35], 虽然安眠酮没有与之对应的内标, 但由于其性质与地西泮相似(见图 2), 可以认为补偿结果有效, 因此无须使用基质匹配的标准曲线进行测定, 从而提高了本方法在日常同一批次多样化样品中的检测效率。
在猪肉、鱼肉、肾脏和肝脏空白样品中, 添加一定浓度的标准溶液, 以信噪比(S/N)≥3计算检出限(LOD), S/N≥10确定定量限(LOQ), 结果见表 4, 可以看出, 检出限和定量限均能满足相关监管部门的要求。
根据GB/T 27404-2008 《实验室质量控制规范食品理化检测》中回收率的相关规定, 被测组分含量小于0.1 mg/kg时, 回收率范围在60%~120%内实验结果可信, 故制作标准曲线时, 最低浓度点应比方法的LOQ值略低。取质量浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/L的标准溶液作标准曲线, 以各组分和内标物的峰面积比值为纵坐标, 质量浓度为横坐标, 进行线性回归分析, 结果(见表 4)表明, 3种镇静剂在0.2~5.0 μg/kg范围内线性关系良好。
用空白样品加标方法进行准确度和精密度实验。分别对猪肉、鱼肉、肾脏和肝脏进行3个水平(LOQ、2倍LOQ和10倍LOQ)的加标试验, 每个水平平行测定6次, 计算平均回收率及其RSD。结果(见表 5)表明, 3种镇静剂在4种基质中的回收率为92.5%~117.8%, RSD为0.7%~11.6%(n=6)。
本实验对仪器检测参数和样品前处理条件进行了优化, 采用同位素内标法定量, 建立了QuEChERS-HPLC-MS/MS同时测定猪肉、鱼肉、肾脏和肝脏中3种镇静剂残留量的分析方法。方法简单、快捷、灵敏度高、准确度好, 溶剂毒性低、消耗量少, 且有效克服了基质干扰问题, 可广泛用于动物类样品中镇静剂类药物的测定。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 801-807
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