茶作为我国的国饮, 已有千年历史。茶叶有丰富多样的营养成分, 又兼具保健及预防疾病的功效, 受到越来越多人的青睐^[1]。然而, 茶叶在其生长过程中极易富集土壤中的重金属^[2]。在这些重金属中, 铅因为自身的高毒性和生物积蓄性, 严重危害着人们的健康^[3]。因此, 对茶叶中铅含量的监测与控制显得尤为重要。

目前, 针对茶叶中铅含量的检测, 常用的方法主要有石墨炉原子吸收光谱法^[4-6]、原子荧光光谱法^[7]、电感耦合等离子发射光谱法^[8]、电化学法^[9]等。与上述方法相比, 高效液相色谱(HPLC)法具有较高的稳定性和通用性, 也被证明可以用于无机离子检测的领域^{[10, 11]}。该方法通过衍生化反应, 使金属离子与衍生剂络合, 生成稳定的衍生物, 使其能被紫外/可见光检测器检测, 进而实现对重金属离子的定性定量分析。

目前色谱法常用的金属检测方法主要有柱前衍生法和柱上衍生法, 其中, 柱前衍生法常用杂环偶氮类试剂^[12]、卟啉类试剂^[13]、硫代氨基甲酸盐类试剂^[14]作为衍生剂, 如张秀晶等^[15]建立了2-巯基-6-羟基-4, 5-二氨基嘧啶螯合浊点萃取-高效液相色谱法, 对3种金属离子进行了研究。希夫碱(Schiff base), 主要是指含有亚胺或甲亚胺特性基团的一类有机化合物, 因其能与金属离子稳定地络合, 被证明可以作为衍生化试剂应用于金属离子的检测中^{[15, 16]}。为更好地实现对茶叶中铅离子的检测, 同时丰富现有色谱检测方法, 本文应用合成的双水杨醛邻苯二胺希夫碱(SALOPHEN)作为衍生剂, 结合反相高效液相色谱法, 建立了测定茶叶样品中的Pb²⁺含量的方法。相较于现有柱前衍生-高效液相色谱法, 该方法检出限低, 重现性好, 有较强的分析检测能力。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Waters 1525型液相色谱仪, 配备Waters 2487紫外检测器、Breeze色谱工作站(美国Waters公司); 色谱柱为Hypersil ODS2 C₁₈反相色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm, 大连依利特分析仪器有限公司)。

Pb(NO₃)₂标准品(纯度为99.9%)购自上海晶纯生化科技股份有限公司; 邻苯二胺(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 水杨醛(分析纯)购自天津市光复精细化工研究所; 四硼酸钠(分析纯)购自天津市致远化学试剂有限公司; 氢氧化钠(分析纯)购自天津市巴斯夫化工有限公司; 甲醇(色谱纯)购自上海星可高纯溶剂有限公司; 乙醇(色谱纯)购自天津科密欧化学试剂有限公司; 水为Pall Cascada^TM Lab超纯水(美国颇尔公司)。3种茶叶样品购自山东潍坊。

1.2 标准品与样品的制备

准确称取适量Pb(NO₃)₂标准品, 用超纯水溶解, 配制成1.0 g/L标准储备液。稀释后用于实验。

SALOPHEN的合成^[17]:取1.80 mL(2.10 g)水杨醛和0.90 g邻苯二胺, 溶解于10 mL甲醇中, 在冷水浴中搅拌10 min, 静置15 min。再将混合物倒入40 mL乙醇中, 静置、过滤, 沉淀在40 ℃下真空干燥12 h, 得2.70 g黄色固体, 取出后再用240 mL乙醇重结晶提纯两次。在40 ℃下真空干燥4 h, 最终得到1.76 g黄色针状晶体, 冷却后放置在称量瓶中备用。

准确称取0.316 2g SALOPHEN, 在100 mL棕色容量瓶中用甲醇定容, 稀释为1×10^-4mol/L, 用于实验。

分别准确称取2.0 g茶叶样品, 经干燥研磨后过70目(212μm)筛, 取0.5 g放置于瓷坩埚中, 于马弗炉中(500 ℃)灰化。向灰烬中加入5 mL高纯硝酸, 加热消解至溶液澄清透明, 定量转移至10 mL容量瓶中, 用超纯水定容, 作为茶叶样品储备液, 检测前用0.45μm水相微孔滤膜过滤。

1.3 衍生方法

移取1.0 mL试样于10 mL容量瓶中, 依次加入1.0 mL 1×10^-4mol/L SALOPHEN溶液、1.0 mL pH 10.0硼砂-氢氧化钠缓冲溶液, 用超纯水定容至刻度线, 静置反应10 min, 用0.45μm水相微孔滤膜过滤后置于样品瓶中待测。

1.4 色谱条件

检测波长为226 nm; 流动相为甲醇-水(80:20, v/v); 流动相流速为1.0 mL/min; 进样量为20 μL; 反应体系pH为10.0。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的选择

用紫外分光光度计分别对SALOPHEN和Pb²⁺与SALOPHEN的衍生物(Pb-SALOPHEN)进行扫描, 紫外吸收光谱图见图 1。从图中可以看出, SALOPHEN和铅离子衍生物的最大吸收波长分别为230 nm和226 nm。分别在226 nm和230 nm检测波长下对Pb-SALOPHEN进行检测, 结果表明, 在226 nm检测波长处峰形最佳。因此, 选择226 nm作为检测波长。

图 1

Fig. 1

图 1 衍生剂与铅离子衍生物的紫外吸收光谱图 Fig. 1 UV absorption spectra of derivatization reagent and Pb2+ derivative SALOPHEN: bis(salicylaldehyde)-o-phenylenediamine.

2.2 流动相比例的选择

依次调节甲醇与水的体积比为85:15、80:20和75:25, 测定铅离子衍生物, 色谱图如图 2所示。由图中可以看出, 随着甲醇在流动相中比例的增大, 铅离子衍生物的保留时间逐渐缩短。当甲醇与水的体积比为75:25时, 铅离子衍生物检测时间过长且峰出现拖尾。当甲醇与水的体积比为85:15时, 铅离子衍生物虽检测时间短, 但峰形不佳。综合考虑, 为使铅离子衍生物能被快速准确地检测, 选择甲醇与水的体积比为80:20。

图 2

Fig. 2

图 2 不同流动相(甲醇-水)比例下铅离子衍生物的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of Pb2+ derivative with different rates of mobile phase (methanol-water) LC conditions: C18 reversed-phase column (250 mm×4.6 mm, 5μm); flow rate: 1.0 mL/min; detection wavelength: 226 nm; injection volume: 20 μL.

2.3 反应体系pH值的选择

考察了pH值为1.0~11.0时对衍生反应体系的影响。结果表明, 当pH=10.0时, 色谱峰稳定且峰面积最大。因此, 衍生反应体系的pH值选为10。

2.4 干扰实验

在铅金属离子标准液(1.0 mg/L)中加入Fe³⁺、Co²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Cr³⁺, 按优化好的色谱条件进行检测, 结果见图 3。各干扰离子的最大允许量为:Cu²⁺2.0 mg/L; Ni²⁺、Co²⁺各7.5 mg/L; Fe³⁺、Zn²⁺各5.0 mg/L; Cr³⁺5.5 mg/L。因为检测时间本身较短, 若干扰离子质量浓度超过最大允许量, 不同离子衍生物的色谱峰容易重叠。其次, 干扰离子过多势必影响与Pb²⁺进行衍生化反应的SALOPHEN的量, 造成铅离子衍生物的色谱峰峰面积变小。

图 3

Fig. 3

图 3 干扰离子(1.0 mg/L)与铅离子衍生物的色谱图 Fig. 3 Chromatogram of interfering ions (1.0 mg/L) and Pb2+derivative LC conditions are the same as those in Fig. 2.

2.5 方法的验证

2.5.1 线性关系、检出限与定量限

用超纯水配制不同质量浓度(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg/L)的Pb²⁺标准溶液, 分别在pH=10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲溶液体系中与SALOPHEN进行衍生化反应, 在最优色谱条件下从低质量浓度到高质量浓度进行测定。以峰面积Y对质量浓度X(单位:mg/L)绘制标准曲线, 衍生物的线性回归方程为Y=12.4×10⁴X+7.99×10⁴, 线性相关系数(r²)为0.998 8。检出限(LOD)与定量限(LOQ)分别为S/N=3和S/N=10时对应的质量浓度。检出限为0.01 mg/L, 定量限为0.03 mg/L。

2.5.2 日内精密度与日间精密度

在最优色谱条件下, 连续5天对Pb²⁺样品进行处理并检测, 日内、日间各检测5次, 计算衍生物的保留时间与峰面积的相对标准偏差(RSD), 其计算结果分别作为日内精密度与日间精密度。对于日间精密度, 保留时间的RSD为0.61%, 峰面积的RSD为2.90%;对于日内精密度, 保留时间的RSD为0.27%, 峰面积的RSD为1.33%。结果表明此方法能够满足分析检测的要求。

2.5.3 实际样品的测定

按照本方法对3种茶叶样品(1号红茶、2号绿茶、3号茉莉花茶)进行前处理, 在最优色谱条件下分别测定其中Pb²⁺的含量, 每种样品连续进样3次, 结果取平均值。将超纯水按照衍生方法处理后作为空白样品。空白样品、标准品及实际样品的色谱图见图 4。2号样品(绿茶)中Pb²⁺的含量(2.88 μg/g)略高于其他两组样品(1号样品1.52 μg/g、3号样品0.37 μg/g)。3组茶叶样品中铅离子的含量均低于国家标准(≤5.0 μg/g)^[18], 能安全饮用。

图 4

Fig. 4

图 4 (a)空白样品、(b)标准品及(c~e)实际样品的色谱图 Fig. 4 Chromatograms of the (a) blank sample, (b) standard and (c-e) real samples LC conditions are the same as those in Fig. 2.

2.5.4 加标回收率

选择1号样品进行加标回收率测定, 以验证该方法的准确性。分别向其中加入1.00、1.50和2.00mg/L 3个水平的Pb²⁺标准溶液, 在最优色谱条件下测定其含量, 计算加标回收率, 结果如表 1所示。Pb²⁺的加标回收率为91.87%~96.96%, 能满足定量检测要求。

表 1 (Table 1)

表 1 Pb2+的加标回收率(n=3) Table 1 Spiked recoveries of Pb2+ (n=3) Background/(mg/L) Added/(mg/L) Found/(mg/L) Recovery/% RSD/% 1.52 1.00 2.44 91.87 2.22 1.50 2.96 95.70 0.64 2.00 3.46 96.96 1.58

表 1 Pb2+的加标回收率(n=3) Table 1 Spiked recoveries of Pb2+ (n=3)

2.5.5 方法对照试验

取2.0 g茶叶样品(1号), 分别使用本文研究方法和电感耦合等离子体原子发射光谱(ICP-AES)法^[8]进行测定, 结果见表 2。结果表明, 两种检测方法测得的结果基本一致, 说明该方法能满足快速检测和痕量检测的要求。虽然ICP-AES法的检测时间短于HPLC法, 但在检出限、自身的造价及通用性方面, HPLC法有着较大优势。

表 2 (Table 2)

表 2 HPLC法与电感耦合等离子体原子发射光谱法的比较 Table 2 Comparison of HPLC method with inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES) method Method Detection result of Pb2+/(mg/L) LOD of Pb2+/(mg/L) Detection time/min Sample pre-processing time/h HPLC 1.52 0.01 6.5 2 ICP-AES 1.50 0.03 1.0 2

表 2 HPLC法与电感耦合等离子体原子发射光谱法的比较 Table 2 Comparison of HPLC method with inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry (ICP-AES) method

国家标准^[18](食品中铅的测定)中列举的5种检测方法检出限分别如下:石墨炉原子吸收光谱法为0.005 μg/g; 氢化物原子荧光光谱法检测固体试样为0.005 μg/g, 检测液体试样为0.001 μg/g; 火焰原子吸收光谱法为0.1 μg/g; 比色法为0.25 μg/g; 单扫描极谱法为0.085 μg/g。从以上数据可以看出, 本方法检出限低于国标中的3种方法(火焰原子吸收光谱法、比色法、单扫描极谱法)。

3 结论

本文以双水杨醛邻苯二胺希夫碱作为衍生试剂, 在pH=10.0的硼砂-氢氧化钠缓冲体系中与Pb²⁺形成络合物, 应用高效液相色谱法对其进行检测, 铅离子络合物在7 min内能被完全分离。该方法前处理简单, 检出限低, 具有良好的准确性和稳定性, 是一种有效的检测茶叶中铅离子含量的方法。

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