超高效液相色谱-串联质谱法测定水华样品中微囊藻毒素及其基质效应的消除


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	沈斐

	许燕娟

	姜晟

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	石浚哲

	陈静

沈斐^1,2, 许燕娟¹, 姜晟³, 赵斌¹, 石浚哲¹, 陈静¹

1. 无锡市环境监测中心站, 江苏无锡 214121;
2. 江南大学环境与土木工程学院, 江苏无锡 214122;
3. 江苏省环境监测中心, 江苏南京 210036

收稿日期：2017-03-31

基金项目：江苏省环境监测科研基金项目（1621）；江苏省普通高校学术学位研究生创新计划项目（KYLX16_0813）；城市河道环境监测技术系统集成研究和示范（WX03-04B0205-051600-07）

通讯联系人：沈斐, E-mail:feirenlei911@aliyun.com

摘要：超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）由于其快速、简便的特点，目前广泛应用于水中微囊藻毒素的测定。由于蓝藻水华样品基质比较复杂，UPLC-MS/MS在复杂基质的分析过程中容易发生基质效应问题，严重影响其定量分析结果的准确性。通过稀释样品、优化梯度洗脱程序、减少进样量等方法有效地降低或消除了基质干扰及基质效应问题。7种目标物在各自线性范围内线性关系良好，相关系数（r²）≥0.99；检出限和定量限分别为0.064~0.103 μg/L和0.213~0.343 μg/L。通过稀释样品、减少进样量等措施，成功测定了水华爆发时实际样品中的微囊藻毒素，并有效降低了基质效应的干扰。该法为微囊藻毒素的准确测定提供一定的参考，对保障饮用水源地的安全具有十分重要的意义。

关键词：超高效液相色谱-串联质谱基质效应微囊藻毒素水华样品

Determination of microcystins in algal bloom samples by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and elimination of their matrix effects

SHEN Fei^1,2, XU Yanjuan¹, JIANG Sheng³, ZHAO Bin¹, SHI Junzhe¹, CHEN Jing¹

1. Wuxi Environmental Monitoring Central Station, Wuxi 214121, China;
2. School of Environment and Civil Engineering, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. Jiangsu Environmental Monitoring Center, Nanjing 210036, China

Foundation item: Environmental Monitoring and Research Fund of Jiangsu Province (No. 1621); Research and Innovation Project for Postgraduate of Higher Education Institutions of Jiangsu Province (No. KYLX16_0813); Research and Demonstration Project of Urban River Environment Monitoring Technology (No. WX03-04B0205-051600-07)

Abstract: A rapid and simple method was commonly used for the determination of microcystins by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS). The reliability, accuracy and sensitivity of LC-MS/MS determination were affected by the matrix effect because of the complex matrices in algal bloom samples. In this study, the matrix interference and matrix effect problems were effectively reduced or eliminated by diluting samples, optimizing gradient elution programs, and reducing injection volumes. The correlation coefficients (r²) of the seven microcystins were ≥ 0.99. The limits of detection and limits of quantification ranged from 0.064 μg/L to 0.103 μg/L and 0.213 μg/L to 0.343 μg/L, respectively. Algal bloom samples were determined by diluting 10 times and injecting 5 μ L of sample volume. The method provides some references for the determination of microcystins. It is of great significance for ensuring the safety of drinking water source.

Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) matrix effect microcystins algal bloom samples

微囊藻毒素(microcystins)是目前在蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大、造成危害最严重的藻毒素^[1]。微囊藻毒素对人体和水生生物具有很高的毒性及危害, 因此微囊藻毒素的检测技术一直是藻毒素污染防治关注的焦点。超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)因其灵敏度高、选择性好, 已被广泛用于微囊藻毒素的测定^[2-4]。随着液相色谱-串联质谱仪灵敏度的不断提高, 在满足方法检出限要求的前提下, 直接进样方式被广泛应用于水中污染物的检测^[5-8]。直接进样法拥有简单、快速、前处理无损失和保留全部样品信息的优点, 适用于样品量较大以及环境突发应急事件的快速定性定量分析。但是, 直接进样-超高效液相色谱-串联质谱法在复杂基质的实际样品分析过程中常常受到基质干扰等问题。复杂基质样品在分析过程中, 基质成分与待测物在雾滴表面离子化竞争过程中会显著地降低或增强目标离子的生成效率及离子强度, 进而对测定结果产生严重影响。目前关于基质效应的研究及其消除问题在国际上已有较多成果发表^{[9, 10]}, 但是对于水中微囊藻毒素的基质效应问题的研究仍较少。水华爆发时, 由于大量藻渣堆积, 藻细胞代谢产生的大量有机物质及单糖、氨基酸、肽等厌氧分解产物, 导致水华样品基质较为复杂^[11], 采用直接进样法对微囊藻毒素进行测定不可避免地会受到基质干扰的影响。针对蓝藻水华爆发时的复杂基质样品, 本文通过样品稀释、优化流动相条件、减少进样量的方法来消除或降低微囊藻毒素分析中的基质效应, 为微囊藻毒素的准确测定提供参考, 同时对于预警水体微囊藻毒素污染, 及时提供污染信息, 保障饮用水源地的安全具有十分重要的意义。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂及材料

Acquity超高效液相色谱仪(美国Waters公司); API 4000⁺串联质谱仪(美国AB Sciex公司); Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司); C₁₈固相萃取小柱(500 mg/6 mL, 美国Supelco公司); GF/C滤膜(英国Whatman公司)。

甲醇、乙腈(HPLC级, 德国CNW科技公司); 甲酸(纯度≥98%, 美国Sigma-Aldrich公司); 微囊藻毒素-LR(MC-LR)、微囊藻毒素-YR(MC-YR)、微囊藻毒素-RR(MC-RR)、微囊藻毒素-LA(MC-LA)、微囊藻毒素-LY(MC-LY)、微囊藻毒素-LW(MC-LW)和微囊藻毒素-LF(MC-LF)(纯度95%, 瑞士Alexis Biochemicals公司)。将上述标准品用甲醇溶解后, 配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液; 根据实验需要用甲醇配制质量浓度为1~10 mg/L的微囊藻毒素系列混合标准溶液。

1.2 样品采集和前处理

用500 mL棕色玻璃瓶采集满瓶水样, 不留顶空, 采集后于4 ℃避光保存, 当天分析。

取20 mL蓝藻水华样品, 以6 000 r/min离心20 min, 移取上清液, 经GF/C滤膜过滤, 待测。

用10 mL甲醇活化C₁₈固相萃取小柱, 再用10 mL纯水淋洗, 取10 mL过滤后的实际水样上样净化, 收集流出液, 制备空白基质溶液, 备用。

1.3 分析条件

色谱柱:Acquity BEH130色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司); 柱温:40.0 ℃; 流速:0.4 mL/min; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流动相B:含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 20%B; 1.0~2.5 min, 20%B~95%B; 2.5~3.5 min, 95%B; 3.5~3.6 min, 95%B~20%B; 3.6~5.0 min, 20%B。进样量:5 μL。

离子源:ESI⁺源; 喷雾电压:5 500 V; 气帘气压力:1.38×10⁵ Pa; 雾化气压力:3.79×10⁵ Pa; 辅助气压力:4.14×10⁵ Pa; 喷针温度:450 ℃; 扫描模式:多反应监测(MRM)模式。其他质谱参数见表 1。

表 1 7种微囊藻毒素的保留时间、母离子、子离子和其他质谱参数 Table 1 Retention times, precursor ions, product ions and other MS parameters of the seven microcystins

2 结果与讨论

2.1 流动相条件的优化

优化超高效液相色谱的条件是消除基质效应及离子抑制问题最常用也是最简单的方法。本实验考察了不同的梯度洗脱程序对目标化合物色谱行为的影响(见图 1)。在微囊藻毒素分析时, 起始流动相采用较小比例的有机相, 能够将复杂基质中的目标物与干扰物分离, 减少基质效应对色谱峰形及响应强度的影响, 从而提高目标物的离子化效率^[10]。在含复杂基质的样品中, 由于干扰物极性较大, 在反相色谱柱上保留能力较弱, 保留时间较短, 导致保留时间靠前的微囊藻毒素(MC-LR、MC-YR和MC-RR)的响应强度受干扰较大。当采用1.3节的梯度洗脱程序时，微囊藻毒素响应强度明显提高, 色谱峰形较好(见图 1c)。因此梯度洗脱程序的变化在一定程度上能够消除离子抑制问题，提高离子响应强度。

图 1 不同洗脱程序对7种微囊藻毒素色谱峰形及响应强度的影响 Fig. 1 Effect of different gradient elution programs on chromatographic peaks and responses of the seven microcystins Mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) acetonitrile containing 0.1 (v/v) formic acid; gradient elution program: a. 0-1.0 min, 5%B; 1.0-2.5 min, 5%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95% B; 3.5-3.6 min, 95%B-5% B; 3.6-5.0 min, 5%B; b. 0-1.0 min, 10%B; 1.0-2.5 min, 10%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95%B; 3.5-3.6 min, 95%B-10%B; 3.6-5.0 min, 10%B; c. 0-1.0 min, 20%B; 1.0-2.5 min, 20%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95%B; 3.5-3.6 min, 95%B-20%B; 3.6-5.0 min, 20%B; d. 0-1.0 min, 30%B; 1.0-2.5 min, 30%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95%B; 3.5-3.6 min, 95%B-30%B; 3.6-5.0 min, 30%B.

降低流动相流速，从而减少进入离子源的流量, 增加离子化效率, 也可以避免基质分子的干扰^[12]。本实验尝试了降低流动相的流速, 但是依然无法解决基质效应问题, 反而导致微囊藻毒素的峰形变宽, 响应强度降低, 甚至出现色谱峰发生分裂的现象。

2.2 内标的考察

合适的内标在一定条件下可以平衡由基质干扰所引起的分析物信号响应强度的变化，从而抵消离子抑制作用对测定结果产生的影响^[9]。目前市场上还没有微囊藻毒素的同位素内标, 本实验尝试使用与藻毒素结构类似的亮氨酸脑啡肽作为内标^{[13, 14]}。虽然亮氨酸脑啡肽作为内标物在清洁水体中微囊藻毒素的定量效果良好, 但是本实验的目标水体基质更复杂, 亮氨酸脑啡肽的保留时间(1.81 min)与微囊藻毒素的保留时间存在一定差异, 其响应强度不与分析物的响应强度保持在一个相对稳定的值^[15]。通过内标法测定实际样品中微囊藻毒素的加标回收率和精密度(内标的质量浓度为10 μg/L), 发现回收率为127%~193%, RSD为23.1%~48.5%(n=7)。采用亮氨酸脑啡肽作为内标定量时，无法消除水中微囊藻毒素测定时的基质干扰问题，精密度和准确度较差，因此采用外标法定量。

2.3 进样量的考察

在保证灵敏度的情况下, 减少进样量也可以减少基质干扰。通过对空白基质溶液加标(10 μg/L), 考察不同进样量(10、5和1 μL)对目标化合物回收率的影响(见表 2)。可以看出, 随着进样量的减少, 目标化合物的回收率逐渐增加, 有助于减少离子抑制现象。大多数测定水样中微囊藻毒素方法中样品的进样量为10 μL^{[4, 10, 13, 14]}，但通过表 2可知，减少进样量能有效降低基质干扰。但是由于本实验仪器条件的限制，进样量过低(1 μL)会影响到方法的灵敏度，因此本方法将进样量设定为5 μL。

表 2 不同进样量条件下目标化合物的回收率 Table 2 Recoveries of the target compounds with different injection volumes

2.4 样品稀释倍数的选择

将样品连续稀释若干倍, 再根据稀释因子和稀释后样品的含量推算出稀释前样品的实际含量。分别准备2组样品, 第一组是7种微囊藻毒素的混合标准溶液(100 μg/L), 第二组是向1 mL空白基质溶液中加入微囊藻毒素混合标准溶液, 配制质量浓度为100 μg/L的基质加标溶液。比较稀释前后复杂基质中样品的离子抑制作用。利用以下公式^[16]计算绝对基质效应(ME):

其中，A和B分别代表基质加标溶液和标准溶液中目标物的峰面积。

绝对基质效应与稀释因子的对数方程^[16]为ME=m×lg DF+n, 其中, 斜率m代表稀释后基质效应的下降程度; DF代表稀释因子; n代表未稀释样品所受到的绝对基质效应强度。该方程可以体现出目标物所受基质效应的干扰程度以及稀释法对于基质效应消除的效果。m越大说明稀释的效果越明显, n越小说明基质效应的影响越小。对7种微囊藻毒素的DF和ME作图(见图 2)，可以看出, 基质干扰对MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LA和MC-LY的影响较大(n＜-27), 对保留时间较长的MC-LW和MC-LF的影响较小。由图 1可知, 在MC-LR、MC-YR和MC-RR出峰时间附近的基线受干扰最大, 有明显的干扰物色谱峰；而通过与图 2与图 1结合，可以推断, 干扰物的极性可能与其极性相似，出峰时间较为接近，导致对MC-LR、MC-YR和MC-RR的干扰较大。通过绝对基质效应实验, 在稀释20倍以后, ME≈0%, 几乎无基质效应发生^[16], 基本消除了干扰物的ME对离子抑制作用的影响。

图 2 稀释倍数对ME的影响(稀释因子为1~100) Fig. 2 Effect of dilution factors (DF) on the matrix effects (ME) (DF for 1-100) The solid lines marked a complete elimination of the ME. The dotted lines marked a minimization to a remaining level of ±20% ME.

2.5 线性范围、检出限和定量限

以3倍和10倍信噪比(S/N)计算方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果见表 3。结果表明，检出限可以满足世界卫生组织(WHO)^[17]及我国水中微囊藻毒素的控制标准要求^[18]。在给定的线性范围内, 7种微囊藻毒素的线性关系良好, 相关系数(r²)均大于0.99。

表 3 7种微囊藻毒素的线性范围、相关系数、检出限和定量限 Table 3 Linear ranges, correlation coefficients (r²), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs)of the seven microcystins

2.6 环境样品分析

采集了江苏某地区蓝藻水华爆发时3个不同点位的样品(1^#~3^#)。因藻细胞大量的代谢产物导致样品基质复杂, 由2.4节可知，样品在稀释20倍后，几乎无基质效应发生，鉴于本实验现有的仪器设备，为避免过度稀释样品、减少进样量，导致灵敏度降低，最终在稀释10倍，进样量为5 μL的条件下对采集的样品进行检测。结果表明，7种微囊藻毒素均有不同程度的检出, 含量为3.51~175.6 μg/L(见表 4)。其中1^#样品在基质效应消除前、后的色谱图见图 3，可以看出，基质效应消除后，目标物的色谱峰峰形更好，基线波动更小。说明本方法有助于直接进样-超高效液相色谱-串联质谱法测定水华样品中微囊藻毒素时基质效应的消除问题。根据文献^{[19, 20]}可知, 蓝藻水华爆发时水中微囊藻毒素的含量高达54~584 μg/L, 而本方法的检出限为0.064~0.103 μg/L, 因此通过减少进样量和样品稀释, 能够满足我国《地表水环境质量标准》^[18]和《生活饮用水卫生标准》^[21]对水中微囊藻毒素限量值1.0 μg/L的要求。在蓝藻水华未爆发的地表水微囊藻毒素测定过程中, 样品较为干净, 不会发生明显的基质干扰问题^{[6, 8]}, 可直接进行测定。

表 4 水华样品中7种微囊藻毒素的含量 Table 4 Contents of the seven microcystins in algal bloom samples

图 3 基质效应消除(a)前、(b)后实际样品的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of a real sample (a) before and (b) after matrix effect elimination a. mobile phases: (A) 0.1% (v/v) formic acid aqueous solution and (B) acetonitrile containing 0.1 (v/v) formic acid; gradient elution program: 0-1.0 min; 5%B; 1.0-2.5 min; 5%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95%B; 3.5-3.6 min; 95%B-5%B; 3.6-5.0 min, 5%B; injection volume: 10 μL; b. mobile phases: the same as in Fig. 3a; gradient elution program: 0-1.0 min; 20%B; 1.0-2.5 min, 20%B-95%B; 2.5-3.5 min, 95%B; 3.5-3.6 min, 95%B-20%B; 3.6-5.0 min, 20%B; diluted factor: 10 times; injection volume: 5 μL.

3 结论

本文通过稀释样品、优化流动相条件、减少进样量等简单、快速、有效的措施降低或消除了复杂基质对微囊藻毒素测定时产生的影响。为建立合适的微囊藻毒素分析方法以及藻毒素预警预报提供参考, 并对保障饮用水源地的安全具有十分重要的意义。

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