糖皮质激素(glucocorticoids, GCs)是一类母核为环戊烷骈多氢菲结构的甾体激素, 具有抗炎、抗过敏、抗休克和免疫抑制等药理作用[1], 是临床皮肤科领域应用最广泛的外用药物之一。但长期使用GCs会引起激素依赖性皮炎、皮肤萎缩和其他毒副作用[2], 对人体造成严重危害。2015年版的《化妆品安全技术规范》[3]将GCs列为化妆品禁用组分, 欧盟[4]、东盟[5]、日本[6]、韩国[7]等国家和地区的化妆品法规亦有此规定。但因GCs对皮肤具有显著的消炎祛痘、美白护肤功效, 部分商家依然将其非法添加到化妆品中, 以谋取不当利益。类似的不法行为在各级食品药品监督管理部门组织开展的化妆品监督抽检中多次被发现[8-10], 由此导致的化妆品安全事件也屡见报道。更为严重的是, 在日常检测工作中发现, 为规避监管, 非法添加法定检验方法[11, 12]监测范围之外的其他GCs成为新趋势。因此, 建立样品前处理方法更简便、品种更齐全的检测方法尤为迫切, 对保障消费者安全具有重要的现实意义。
近年来检测化妆品中GCs的方法主要有液相色谱法[13]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[14-16]和液相色谱-高分辨质谱法(LC-HRMS)[17, 18]。由于质谱法具有选择性好、灵敏度高、抗干扰能力强等特点, 目前已成为最主要的检测手段。尽管高分辨质谱较串联质谱具有更强的定性能力, 但仪器成本高、普及率低。因此, 对于大多数检测机构而言, LC-MS/MS更为适用。此外, 已报道的方法[11, 12, 14]大多采用固相萃取(SPE)净化样品, 方法耗时, 成本高, 且难以实现大批量样品的同时处理。
本课题组在前期研究[14]的基础上, 针对现有方法普遍存在的样品前处理耗时、成本高、分离效果较差、定量结果受基质影响大等问题, 采用兼具疏水、π-π、偶极-偶极等多重色谱作用模式的五氟苯基(PFP)色谱柱, 通过优化样品前处理和色谱-质谱条件, 建立了分散固相萃取(d-SPE)-液相色谱-串联质谱同时快速测定化妆品中81种GCs的分析方法, 实现了10组同分异构体的基线分离, 是目前可同时测定化妆品中GCs种类最多的高通量方法, 涉及法定检测方法规定的所有42种GCs及可能被非法添加至化妆品中的其他39种GCs, 可为化妆品中GCs的高通量分析提供技术支持, 能极大地提高化妆品安全风险的监控水平。
1200 SL Series RRLC-6410B Triple Quard MS液相色谱-串联四极杆质谱仪(美国Agilent公司); AS 3120超声波发生器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司); H1850离心机(湖南湘仪实验室仪器开发有限公司); XW-80A快速混匀器(海门市麒麟医用仪器厂); DC12H水浴式氮吹浓缩仪(上海安谱科学仪器有限公司)。
氯化钠(NaCl)、亚铁氰化钾三水合物和乙酸锌二水合物(分析纯, 广州化学试剂厂); 无水硫酸镁(MgSO4, 分析纯, 上海晶纯生化科技股份有限公司); 乙腈、甲醇和乙酸(色谱纯, 美国Thermo Fisher Scientific公司); 十八烷基键合硅胶颗粒(Bondesil-C18)、N-丙基乙二胺颗粒(Bondesil-PSA)均为40μm(美国Agilent公司)。实验用水为二次蒸馏水。
81种GCs标准品:曲安西龙(TL)、泼尼松龙(PL)、氢化可的松(HC)、泼尼松(PN)、可的松(CS)、倍他米松(BM)、地塞米松(DM)、曲安奈德(TAN)、泼尼松龙醋酸酯(PLA)、氟米龙(FML)、氢化可的松醋酸酯(HCA)、地夫可特(DC)、氟氢可的松醋酸酯(FCSA)、泼尼松醋酸酯(PNA)、可的松醋酸酯(CSA)、布地奈德(BDN)、氢化可的松丁酸酯(HCB)、地塞米松醋酸酯(DMA)、氟米龙醋酸酯(FMLA)、曲安奈德醋酸酯(TANA)、氟轻松醋酸酯(FCD)、哈西奈德(HCN)、氯倍他索丙酸酯(CLBP)、倍他米松双丙酸酯(BMDP)和倍氯米松双丙酸酯(BCDP)(纯度＞95.0%, 中国食品药品检定研究院); 氟氢缩松(FDT)、曲安西龙双醋酸酯(TLDA)、氢化可的松戊酸酯(HCV)、阿氯米松双丙酸酯(ACDP)、瑞美松龙(RMX)、倍他米松苯甲酸酯(BMB)、氢化可的松环戊丙酸酯(HCC)和氯可托龙特戊酸酯(CCLP)(纯度＞95.0%, 美国药典委员会); 泼尼卡酯(PNC)、氟替卡松丙酸酯(FTCP)、氟轻松(FCAN)、泼尼松龙特戊酸酯(PLP)、地塞米松异烟酸酯(DMIN)、地塞米松特戊酸酯(DMP)、氟米松特戊酸酯(FMP)、氟可龙特戊酸酯(FCLP)、氢化可的松琥珀酸酯(HCHS)和己曲安奈德(TLHN)(纯度＞95.0%, 欧洲药品质量管理局); 倍氯米松(BC)、甲基泼尼松龙醋酸酯(MPA)、倍他米松醋酸酯(BMA)、双氟拉松双醋酸酯(DFDA)、倍他米松戊酸酯(BMV)、安西奈德(AN)、莫米他松糠酸酯(MMF)、氯倍他松丁酸酯(CBB)、地索奈德(DN)、环索奈德(CCN)、卤美他松(HM)、帕拉米松(PM)、帕拉米松醋酸酯(PMA)、双氟可龙戊酸酯(DFV)、异氟泼尼龙(IFP)、去羟米松(DOM)、卤贝他索丙酸酯(HBTP)、氟尼缩松(FN)、依碳氯替泼诺(LE)、氟可龙(FCL)、倍他米松丙酸酯(BMP)、异氟泼尼龙醋酸酯(IFPA)、甲泼尼松(MPN)、甲泼尼松醋酸酯(MPNA)、双氟拉松(DF)、氟氢可的松(FCS)、16α-羟基泼尼松龙(HPL)、6α-氟-异氟泼尼龙(FIFP)、甲基泼尼松龙琥珀酸酯(MPHS)、甲基泼尼松龙醋丙酸酯(MPAP)、卤贝他索(HBT)、地塞米松戊酸酯(DMV)、替可的松特戊酸酯(TCP)、氯泼尼醇(CLP)和双氟泼尼酯(DFP)(纯度＞98.0%, 加拿大TRC公司); 16α-羟基泼尼松龙醋酸酯(HPLA)(纯度95.0%, 美国Matrix Scientific公司); 甲基泼尼松龙(MP)(纯度98.9%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 氟米松(FM)(纯度99.0%, 挪威Chiron公司)。
7种GCs同位素内标:氢化可的松-d2(HC-d2)(纯度99.0%, 加拿大CDN公司); 甲基泼尼松龙-d3(MP-d3)、氟米松-d3(FM-d3)、地夫可特-d3(DC-d3)、氯倍他索丙酸酯-d5(CLBP-d5)、倍他米松双丙酸酯-d10(BMDP-d10) 和环索奈德-d7(CCN-d7)(纯度≥95%, 加拿大TRC公司)。
准确称取适量GCs标准品和同位素内标, 用乙腈分别溶解, 配制质量浓度为1 000mg/L的单标准储备液, 置于棕色瓶中, 于-20 ℃保存。
将7种同位素内标的单标准储备液用乙腈稀释成质量浓度为5 mg/L的混合内标工作液, 置于棕色瓶中, 于4 ℃保存。
根据需要, 吸取各单标准储备液适量, 用50%(v/v)乙腈水溶液稀释并配制成所需浓度的混合标准工作液, 其中各同位素内标的质量浓度均为50μg/L, 置于棕色瓶中, 于4 ℃保存。
准确称取均匀试样1.0 g(精确至0.01 g)于50 mL聚丙烯离心管中, 准确加入40 μL混合内标工作液和10 mL水, 充分涡旋分散后, 加入10 mL乙腈, 涡旋提取1 min, 超声提取10 min后, 分别加入106 g/L的亚铁氰化钾溶液和219 g/L的乙酸锌溶液各0.2 mL, 涡旋混匀1 min, 加入盐析剂(1.0 g NaCl+2.0 g MgSO4), 振摇1 min, 以5 000 r/min离心10 min后, 准确移取上层清液5 mL于15 mL聚丙烯离心管中, 加入净化剂(150 mg Bondesil-C18+150 mg Bondesil-PSA+1 000 mg MgSO4), 涡旋混匀1 min, 以5 000 r/min离心5 min, 将上清液全部转移至带2 mL刻度的梨形瓶中, 然后置于45 ℃水浴中氮吹浓缩至1 mL, 用水定容至刻度, 涡旋混匀, 过0.22μm滤膜, 待上机分析。
色谱柱:Poroshell 120 PFP色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.7μm, 美国Agilent公司); 柱温:30 ℃; 流动相A: 0.2%(v/v)乙酸水溶液; 流动相B:乙腈; 流速:0.35 mL/min; 进样量:5 μL。梯度洗脱程序:0~5.0 min, 20%B; 5.0~10.0 min, 20%B~25%B; 10.0~20.0 min, 25%B~38%B; 20.0~28.0 min, 38%B~48%B; 28.0~31.0 min, 48%B~52%B; 31.0~31.1 min, 52%B~95%B; 31.1~33.0 min, 95%B; 33.0~33.1 min, 95%B~20% B; 33.1~39.0 min, 20%B。
离子源:电喷雾离子(ESI)源; 扫描方式:正离子扫描; 采集方式:动态多反应监测(DMRM); 雾化气压力:276 kPa; 干燥气流量:11.0 L/min; 干燥气温度:350 ℃; 毛细管电压:4 000 V; 采集时间窗口(delta retention time): 2 min。其他质谱参数见表 1。
在电喷雾离子源的正离子模式和负离子模式下, 分别对质量浓度为1.0 mg/L的各待测物单标准溶液进行一级全扫描分析, 获得准分子离子或加合离子。在正离子模式下, 除BC的基峰离子为[M+H-H2O]+，BM、DM、BMA、DMA和IFPA的基峰离子为[M+H-HF]+外, 其余待测物的基峰离子均为准分子离子[M+H]+; 在负离子模式下, 除化合物HCHS、HPL、HPLA、MPHS和TCP的基峰离子为[M-H]-, 其余待测物的基峰离子均为加合离子[M+CH3COO]-, 且该模式下基峰的相对丰度多数不到正离子模式下的1/2。因此, 实验在正离子模式下进一步优化质谱条件, 同时为了统一, 母离子均选择[M+H]+, 通过选择离子监测模式分别优化每个化合物的碎裂电压, 获得最佳的母离子响应。然后, 对母离子进行子离子全扫描, 按欧盟2002/657/EC决议的规定, 选择两个主要特征子离子, 通过优化碰撞能量使其响应最佳。优化后的质谱参数见表 1。
81种GCs是在环戊烷骈多氢菲基本母核基础上修饰得到的系列化合物, 包括具有相同相对分子质量的15组共43个化合物, 其中有10组共25个同分异构体, 部分化合物的母离子和子离子均相同, 仅依据质谱难以准确定性。因此, 实现这15组化合物的良好分离是准确定性定量分析的前提和关键。
对于分离分析含有众多同分异构体的GCs而言, 选择一款具有独特选择性的色谱柱非常必要。目前已报道的方法几乎都采用含有C18填料的色谱柱, 分离效果不甚理想, 尤其是对结构极为相似的差向异构体。本研究首先尝试采用兼具疏水和π-π相互作用的Poroshell 120 Phenyl-Hexyl(100 mm×2.1 mm, 2.7μm)和Xselect CSH Phenyl-Hexyl (100 mm×2.1 mm, 3.5μm)色谱柱进行分离, 尽管对大多数化合物具有良好的分离效果, 但仍较难实现差向异构体如地塞米松与倍他米松的分离。
据文献[19]报道, PFP柱是键合了五氟苯基官能团的硅胶柱, 除具有传统C18填料的疏水相互作用外, 还可与化合物发生π-π、偶极-偶极、电荷转移和离子交换等作用, 使其对结构相近的化合物尤其是位置异构体及卤代物具有独特的选择性。本研究比较了采用Poroshell 120 PFP (100 mm×2.1 mm, 2.7μm)和Xselect HSS PFP (100 mm×2.1 mm, 3.5μm)色谱柱时的分离效果。结果显示, 前者对GCs的选择性较好, 最难分离的几组差向异构体如DM和BM、DMA和BMA的分离度均有明显改善, 获得色谱峰数量多且峰形佳。因此选用Poroshell 120 PFP色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.7μm)作为本方法的分析柱。
由2.1节可知，本实验选择电喷雾正离子模式采集质谱数据, 因此在流动相中加入酸性添加剂可获得更好的质谱响应。在选定的色谱柱上, 考察了3种常用的流动相体系(0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈、含10 mmol/L甲酸铵的0.2%(v/v)甲酸水溶液-乙腈和0.2%(v/v)乙酸水溶液-乙腈)对目标物分离效果的影响。结果表明, 大多数GCs在0.2%(v/v)乙酸水溶液-乙腈的流动相体系下可以获得最佳的质谱响应及良好的色谱峰形。经进一步优化梯度洗脱程序, 所有化合物均获得了良好的分离, 且保留时间分布均匀, 并实现了10组共25个同分异构体的基线分离。具有相同相对分子质量的15组化合物的分离情况见图 1。
根据GCs的结构特点和极性大小的分布情况, 本实验选取分布在不同保留时间段的10种代表性GCs(TL、PN、FMLA、FCD、FTCP、CCN、HM、PM、FN和DFP)作为样品前处理条件优化的研究对象。
在前期研究[14]中, 已知甲醇和乙腈适合提取化妆品中的GCs, 但考虑到甲醇的盐析分层效果不如乙腈, 不利于后续采用d-SPE技术进行净化, 因此本法选用乙腈作为提取溶剂。在化妆水、乳液、膏霜和粉剂等4种不同基质化妆品的阴性样品中, 分别添加50 μg/kg的待测物, 考察直接加乙腈提取(方法Ⅰ)与先加水分散后再加乙腈提取(方法Ⅱ)两种提取方式对4种不同基质化妆品中10种代表性GCs提取回收率的影响。结果表明, 对于化妆水基质, 两种方法的提取回收率没有显著差别; 对于乳液、膏霜和粉剂基质, 方法Ⅱ的提取回收率明显高于方法Ⅰ, 这可能是因为水提高了样品的分散程度, 同时乙腈与水互溶, 增加了提取溶剂的渗透性, 所以其提取效果更佳, 而直接加乙腈往往导致沉淀包裹, 阻止溶剂进一步渗透样品。因此, 本方法在加入乙腈提取前先用水充分分散样品。
常用的d-SPE吸附剂主要有C18、PSA和石墨化炭黑(GCB)等。其中C18可以有效去除弱极性杂质, 而PSA在脱水剂无水硫酸镁存在的情况下可以有效去除有机酸、色素和金属离子。GCB尽管对色素等干扰物有良好的吸附能力, 但其对甾醇类化合物亦有极强的吸附作用, 而GCs的结构与甾醇极为相似。因此, 选择C18和PSA作为吸附剂, 并与脱水剂无水硫酸镁组成d-SPE的净化剂。
为了获得最佳的净化效果, 本研究以添加了50 μg/kg10种代表性GCs的膏霜化妆品中待测物的平均回收率为试验指标, 选取Bondesil-C18用量(100、150、200 mg)、Bondesil-PSA用量(100、150、200 mg)和无水硫酸镁用量(500、1 000、1 500 mg)共3个因素和3个水平, 按照L9(34)正交表进行试验。结果表明, 影响回收率指标因素的主次顺序为Bondesil-C18用量＞Bondesil-PSA用量＞无水硫酸镁用量; 最佳的净化剂组成为150 mg Bondesil-C18+150 mg Bondesil-PSA+1 000 mg MgSO4, 此时可获得良好的净化效果和回收率。
与其他分析手段不同, 质谱分析尤其是电喷雾质谱分析往往会存在基质效应(ME)[20], 影响方法的灵敏度、精密度和准确度。本文采用提取后添加法对基质最复杂的膏霜样品进行了基质效应评价, 按照公式:ME=(1-空白基质溶液中待测物的响应值/纯溶剂中相应待测物的响应值)×100%计算, 得到81种GCs的ME(见表 2)。ME=0, 表示无基质效应的理想情形; ME＜0, 表示存在基质增强效应; ME＞0, 表示存在基质抑制效应。绝对值越大则表示基质效应越明显。结果表明, 大多数化合物的ME在±20%内, 属于弱基质效应, 且以基质抑制效应为主。
为了消减基质效应的影响, 采用同位素内标法进行定量, 结合优化后的样品前处理手段和色谱分离条件, 获得了较为满意的方法学数据。另外, 同位素内标的使用还有效监控了实验过程, 很好地消除了系统误差, 提高了定量结果的准确性, 避免了假阴性结果的发生。
在优化的色谱-质谱条件下, 对6个水平的系列混合标准工作溶液(2~200 μg/L)进行测定。81种GCs均以其定量离子对与相应同位素内标峰面积的比值为纵坐标(y)、对应的质量浓度为横坐标(x, μg/L)绘制标准曲线, 获得回归方程, 线性相关系数为0.994 3~0.999 9, 表明待测物在各自的线性范围内呈良好的线性关系。取空白样品, 添加一定浓度的混合标准溶液, 以S/N≥3和S/N≥10确定81种待测物的LOD和LOQ分别为0.002~0.006 μg/g和0.005~0.020 μg/g(见表 2)。
取适量空白膏霜化妆品, 在低、中、高3个添加水平(0.02、0.10和0.20μg/g)下进行加标回收试验, 每个水平平行测定6次, 计算每个待测物的平均回收率和RSD(见表 2)。结果显示, 方法的平均回收率为68.8%~105.3%, RSD为2.9%~13.1%(n=6)。
应用本法筛查了客户委托送检的137个化妆品样品, 发现阳性样品16个, 检出率为11.7%, 3个阳性样品被检出包含两种以上的GCs。检出的化合物分别为DN(6个)、FCAN(5个)、DF(3个)、CLBP(2个)、DM(1个)、TAN(1个)、TANA(1个)、BMV(1个)和HPL(1个), 含量介于16.9~158μg/g之间, 其中化合物DN、DF和HPL均不在法定检测方法[11, 12]的监测名单中。典型阴性和阳性样品的基峰色谱图见图 2。结果表明, 非法添加法定检测方法监测名单之外GCs的现象已相当普遍, 而使用本法能准确可靠地发现非法添加物, 可显著提高化妆品安全风险的监控水平。
本研究建立了d-SPE-LC-MS/MS同时快速测定化妆品中81种GCs的分析方法。本文采用具有多重色谱保留机制的PFP色谱柱, 实现了10组同分异构体的基线分离。与现有方法相比, 该法样品前处理更为简便、高效、经济, 色谱分离效果更好。采用同位素内标法校正, 定量更加准确可靠, 是目前可同时快速测定化妆品中GCs种类最全的高通量方法, 适用于化妆水、乳液、膏霜、粉剂等类型的化妆品中非法添加GCs的快速定性筛查和准确定量。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 816-825
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