改进的高效液相色谱法测定婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸


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励炯 , 王姣斐 , 邱红钰 , 李玮

杭州市食品药品检验研究院, 浙江杭州 310017

收稿日期：2017-04-06

通讯联系人：励炯, Tel:85463893, E-mail:jokelee2@126.com

摘要：建立并优化了高效液相色谱检测婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸（尿嘧啶核苷酸（UMP）、腺嘌呤核苷酸（AMP）、次黄嘌呤核苷酸（IMP）、鸟嘌呤核苷酸（GMP）、胞嘧啶核苷酸（CMP））的方法。样品用水提取后，经乙酸沉淀蛋白质和HLB固相萃取柱净化，采用Waters XBrigde Amide（150 mm×4.6 mm，3.5 μ m）色谱柱分离，以乙腈、10 mmol/L磷酸二氢钠溶液和0.12%（v/v）磷酸溶液为流动相进行梯度洗脱，二极管阵列检测器（波长为254 nm）检测。结果表明，5种核苷酸检测的线性范围宽，相关性好，相关系数（r²）均为0.9999；方法的加标回收率为86.9%~105.7%；定量限为5.6~8.0 mg/kg；日内和日间精密度分别为0.5%~1.7%（n=5）和0.6%~1.9%（n=9）。该法前处理简单，分离效果好，回收率高，重复性好，可作为婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的有效检测方法。

关键词：高效液相色谱固相萃取核苷酸婴幼儿配方奶粉

Determination of five nucleotides in infant formula milk powder by modified high performance liquid chromatography

LI Jiong, WANG Jiaofei, QIU Hongyu, LI Wei

Hangzhou Institute for Food and Drug Control, Hangzhou 310017, China

Abstract: A modified high performance liquid chromatographic (HPLC) method was developed for the determination of the five nucleotides (uridine monophosphate (UMP), adenosine monophosphate (AMP), inosine monophosphate (IMP), guanosine monophosphate (GMP) and cytidine monophosphate (CMP)) in infant formula milk powder. The samples were extracted by water, deproteinized by acetic acid and purified with an HLB SPE cartridge. The analytes were separated by a Waters XBrigde Amide column (150 mm×4.6 mm, 3.5 μ m). Acetonitrile, 10 mmol/L sodium dihydrogen phosphate aqueous solution and 0.12%(v/v) phosphoric acid aqueous solution were used as mobile phases with gradient elution. The detection wavelength of photodiode array detector was set at 254 nm. Five linear calibration curves were obtained with correlation coefficients (r²) of 0.9999. The recoveries were determined at three spiked levels ranging from 86.9% to 105.7%. The limits of quantification (LOQs) were from 5.6 mg/kg to 8.0 mg/kg. The intra-day and inter-day precisions were 0.5%-1.7% (n=5) and 0.6%-1.9% (n=9), respectively. The method is simple, effective, accurate and repeatable. It is suitable for thedetermination of the five nucleotides in infant formula milk powder.

Key words: high performance liquid chromatography (HPLC) solid phase extraction (SPE) nucleotide infant formula milk powder

核苷酸(nucleotides)是一类由嘌呤碱或嘧啶碱、核糖或脱氧核糖以及磷酸3种物质组成的化合物。核苷酸主要参与构成核酸, 对许多基本的生物学过程有一定的调节作用, 对生物的生长、发育、繁殖和遗传都起着主宰作用^[1]。母乳中含有尿嘧啶核苷酸(UMP)、腺嘌呤核苷酸(AMP)、次黄嘌呤核苷酸(IMP)、鸟嘌呤核苷酸(GMP)、胞嘧啶核苷酸(CMP)等多种核苷酸, 其具体的化学结构式见图 1。因此目前许多婴幼儿配方奶粉均按照其在母乳中的含量添加微量的核苷酸, 以提高婴儿的免疫调节功能和记忆力, 维持宝宝胃肠道的正常功能, 减少腹泻和便秘等^[2]。中华人民共和国卫生部2005年第15号公告建议核苷酸在婴幼儿配方奶粉中的添加量为0.2~0.58g/kg(以核苷酸总量计)。

图 1 5种核苷酸的化学结构式 Fig. 1 Chemical structures of the five nucleotides

目前, 测定核苷酸的常用方法包括毛细管电泳法、离子交换色谱法、高效液相色谱法、液相色谱-质谱法等^[3-8]。其中毛细管电泳法的重现性较差; 离子色谱法分离效果不好, 兼容性差; 液相色谱-质谱法检测费用高, 操作繁琐, 仪器维护困难。2016年国家卫计委颁布了GB 5413.40-2016《婴幼儿食品和乳品中核苷酸测定》的检验新标准, 采用了高效液相色谱法对婴幼儿配方奶粉中的核苷酸进行检测。本文在实际的方法学验证中发现该标准存在以下问题:一是由于核苷酸极性大, 一般色谱柱很难达到较好的保留和分离, 标准方法采用的流动相含有离子对试剂, 长期使用对色谱柱损伤较大, 影响柱效; 二是标准方法在处理奶粉等样品时前处理简单, 目标化合物检测存在杂峰干扰, 分离效果较差。针对上述情况, 本文对样品前处理以及色谱条件进行了优化, 建立了一种改进的高效液相色谱测定婴幼儿配方奶粉中核苷酸含量的方法, 为婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的检测提供了技术支持。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

e2695高效液相色谱, 配有2998二极管阵列检测器(DAD)(美国Waters公司); Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司); FE20K pH计(瑞士梅特勒公司)。

标准品:CMP(纯度99%, 批号:SLBR2789V)、AMP(纯度99%, 批号:SLBP5524V)购自美国Sigma公司; UMP(纯度98%, 批号:LL90Q61)、IMP(纯度98%, 批号:LC60Q137) 购自上海百灵威公司; GMP(纯度87.6%, 批号:115797) 购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

试剂与耗材:乙腈(色谱纯)购自德国Merck公司; 磷酸、乙酸和磷酸二氢钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)购自美国Waters公司。

1.2 标准溶液的配制

分别精密称取UMP、AMP、IMP、GMP和CMP标准品各10 mg, 用超纯水溶解并定容至同一容量瓶中, 配制质量浓度为1 000 mg/L的混合标准储备液; 分别精密吸取上述混合标准储备液0.04、0.08、0.10、0.20、0.40 mL于10 mL容量瓶中, 用水(乙酸调节pH至4.1) 稀释并定容, 配制系列混合标准工作液。

1.3 样品前处理

精密称取婴幼儿配方奶粉试样约5 g, 于100 mL锥形瓶中, 加入20 mL热水(50~60 ℃), 充分溶解试样, 然后冷却至室温, 用乙酸调节试样溶液的pH至4.1后, 移入50 mL容量瓶中, 用去离子水定容, 滤纸过滤。取5 mL滤液, 直接上样至Oasis HLB固相萃取柱, 收集流出液, 用0.45μm微孔滤膜过滤，待分析。

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters XBrigde Amide色谱柱(150 mm×4.6 mm, 3.5μm); 柱温:50 ℃; 检测波长:254 nm; DAD扫描范围:190~400 nm; 流动相:A为乙腈, B为10 mmol/L磷酸二氢钠溶液, C为0.12%(v/v)磷酸溶液; 流速:1.2 mL/min, 进样量:5 μL。梯度洗脱程序见表 1。

表 1 测定5种核苷酸的梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution programs for the determination of the five nucleotides

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的考察

婴幼儿配方奶粉的组分复杂, 干扰因素较多, 给色谱分析带来了很大困难^[9-13]。由于婴幼儿配方奶粉中含有大量的蛋白质(主要为酪蛋白(pI 4.1))，不去除会影响核苷酸在色谱柱上的分离效果, 一般采用酸沉淀法来去除其中的蛋白质^[14]。因此本文用乙酸溶液调节样品溶液的pH值至4.1, 使蛋白质沉淀。在此pH条件下既不破坏待测物的结构又尽可能地的引入其他离子^[15]，且沉淀蛋白质的效果较好。

采用HLB固相萃取柱对沉淀蛋白质后的样品溶液进一步净化, 操作比较简单, 只需将沉淀蛋白质后的样品溶液直接过柱即可。净化结果表明, 采用HLB固相萃取柱处理后, AMP与其附近杂质峰的分离效果(分离度1.8, 见图 2b)要好于净化前(分离度1.5, 见图 2a)，且杂质峰的响应强度也有所减小(见图 2虚线框)。

图 2 采用固相萃取柱净化(a)前和(b)后婴幼儿配方奶粉中核苷酸的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the nucleotides in infant formula milk powder (a) before and (b) after purification with SPE columns

2.2 色谱柱的选择

本实验比较了Agilent ZORBAX SB-Aq (250 mm×4.6 mm, 5μm)、Waters CORTECS C18(150 mm×4.6 mm, 2.7μm)、岛津Shim-pack VP-ODS(250 mm×4.6 mm, 5μm)和Waters XBridge Amide (150 mm×4.6 mm, 3.5μm)4种色谱柱对5种核苷酸的分离效果。结果表明, 使用Waters XBridge Amide色谱柱时5种核苷酸的分离度均大于1.5, 且能有效避免婴幼儿配方奶粉中杂质峰的干扰。使用其他3种色谱柱时, CMP的出峰时间过早, 受杂质峰干扰较大, 分离效果较差, 且GMP易与杂质峰重叠。由于核苷酸属于一类极性较强的化合物, 反相色谱中使用普通的通用型C18色谱柱分离时必须使用高水相的流动相^{[16, 17]}, 且保留困难, 特别是对CMP而言, 导致其出峰时间过早、分离度达不到要求, 而且长期使用高水相体系进行分离, 容易造成色谱柱柱效下降、寿命缩短。Waters XBridge Amide色谱柱的填料含有较为稳定的酰胺官能团, 可以减少色谱柱填料与核苷酸的相互作用, 在低水相体系中分离亲水性化合物, 在一定程度上解决了以上分离难题。标准溶液和婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的色谱图见图 3。

图 3 (a)混合标准溶液(8 mg/L)和(b)实际样品中5种核苷酸的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the five nucleotides in (a) a mixed standard solution (8 mg/L) and (b) a real sample

2.3 流动相条件的优化

GB 5413.40-2016标准方法中检测核苷酸时采用了离子对试剂, 但分离效果并不理想, 杂峰干扰难以去除, 特别是CMP出峰时间较早, 同时离子对试剂对色谱柱的损耗也较大, 因此本文没有采用目前普遍使用的含离子对试剂的高水相流动相体系。本文采用磷酸二氢钠溶液和乙腈作为流动相对5种核苷酸进行分析, 发现流动相的pH值对核苷酸分离度的影响很大。因此在流动相中加入一定比例的磷酸水溶液以调整体系的pH值^{[18, 19]}。本文分别选用了体积分数为0.10%、0.12%、0.15%的磷酸水溶液, 结果发现, 当磷酸水溶液的体积分数为0.10%时, AMP与相邻的杂质峰有部分重叠; 当磷酸水溶液的体积分数为0.12%时, AMP与相邻杂质峰的分离效果较好, 分离度大于1.5;当体积分数为0.15%时, IMP的分离度变差。因此将流动相体系中磷酸水溶液的体积分数设为0.12%。

2.4 线性关系、检出限和定量限

取1.2节中配制的系列混合标准工作液进行分析, 以各组分的峰面积(Y)为纵坐标、对应的质量浓度(X, mg/L)为横坐标进行线性关系考察, 结果见表 2。5种核苷酸在各自的线性范围内线性关系良好, 相关系数(r²)均为0.999 9。

表 2 5种核苷酸的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r²), LODs and LOQs of the five nucleotides

取空白婴幼儿配方奶粉样品5 g, 加入适当稀释的混合标准工作液后进行前处理, 以信噪比为3和10时的含量计算5种核苷酸的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 检出限为2.0~2.5 mg/kg, 定量限为5.6~8.0 mg/kg(见表 2)。

2.5 回收率与精密度

取空白婴幼儿配方奶粉5 g, 分别添加低、中、高3个水平的混合标准工作液, 每个水平做3个平行样品, 计算回收率, 结果见表 3。5种核苷酸在3个添加水平下的平均回收率为86.9%~105.7%, RSD为0.9%~4.0%(n=3)。

表 3 5种核苷酸的加标回收率和精密度 Table 3 Recoveries and precisions of the five nucleotides spiked in samples

取空白婴幼儿配方奶粉5 g, 加入适量的混合标准工作液, 使最终样品溶液中5种核苷酸的质量浓度约为20 mg/L。在1 d内重复进样5次，计算5种核苷酸峰面积的RSD值，作为日内精密度; 将上述样品溶液在3 d内重复进样，每天重复进样3次，计算5种核苷酸峰面积的RSD值，作为日间精密度, 考察方法的重复性是否良好, 结果见表 3。5种核苷酸的日内精密度为0.5%~1.7%(n=5), 日间精密度为0.6%~1.9%(n=9)。

2.6 实际样品检测

利用本文建立的方法对杭州市市售的20份婴幼儿配方奶粉中的5种核苷酸进行检测(编号1~20, 结果见表 4), 完成了杭州市市场监管局2016年第四季度开展的婴幼儿配方奶粉监督检查计划。其中，8、16和20号样品的外包装营养成分表中未标示添加了核苷酸, 但还是有微量的核苷酸检出, 推测可能是原料中本身存在的。其余17个样品均标示了5种核苷酸的添加量, 本方法的测定结果与标示量相当，说明方法准确、可靠。

表 4 20份婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的含量 Table 4 Contents of the five nucleotides in 20 infant formula milk powders

3 结论

本研究建立了一种改进的高效液相色谱测定婴幼儿配方奶粉中5种核苷酸的方法。该方法前处理简单, 色谱峰形良好, 杂质峰干扰少, 分离度能够达到定量要求。该法很好地解决了核苷酸这类高极性物质测定时不容易与杂质较好分离的问题。

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