酸度调节剂亦称pH调节剂, 是增强食品中酸味、调整食品pH值或具有缓冲作用的酸、碱、盐类物质的总称, 通常以有机酸类及具有缓冲作用的盐为主。在现代食品工业中, 酸度调节剂广泛应用于各种食品, 如饮料、糖果、乳制品、饼干糕点、罐头和各式酱料等。酸度调节剂与其他香味成分一起, 赋予了食品一定的口感。目前, 食品中常用的有机酸类酸度调节剂有酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、己二酸、乙酸、富马酸等等。酸度调节剂除可调节食品的pH值、控制酸度、改善风味之外, 尚有许多其他的功能特性, 如柠檬酸可改善食品的感官性状, 增强食欲和促进体内钙、磷物质的消化吸收; 乳酸有很强的防腐保鲜功效, 可用于饮料、肉类、糕点、蔬菜腌制以及水果的贮藏、罐头加工等, 具有抑菌、延长保质期、保持食品色泽等作用; 苹果酸在用于制作咸味食品时, 可减少食盐用量^[1-4]。由于其相对较高的安全性, 我国的国家标准^[5]中仅对富马酸、己二酸、柠檬酸在几类特定产品中有限量规定, 在其他产品中并没有限量规定, 最大使用量根据“生产需要适量使用”。但是, 研究^[6]也表明, 长期食用或过量摄入有机酸同样会对人体产生损害, 在小鼠中进行的急性毒性试验结果显示, 柠檬酸本身具有轻微毒性, 与重金属螯合后会导致肝细胞弥漫性坏死, 肝小叶消失。

我国2016年新发布的国家标准^[7]中, 将有机酸检测的适用范围扩充至果冻、固体饮料以及水果罐头等食品, 但仍未包含乳制品样品; 文献报道中乳制品中酸度调节剂的检测多采用气相色谱法^[8]、液相色谱法^[9-11]和离子色谱分析技术^{[12, 13]}。但是, 上述方法通常需耗费40~60 min的检测时间, 以保留时间作为定性定量依据, 易导致假阳性结果。近年来高分辨质谱通过与液相色谱串联的方式在食品检测^[14]、纺织品^[15]、蛋白质组学^[16]等方面已开始逐渐应用, 其质量分辨率高和相对分子质量精确的功能可以弥补传统低分辨质谱方法的不足, 但在与离子色谱串联应用的检测领域报道尚少, 这是由于现有的离子色谱-质谱串联仪器主要是离子色谱与单四极杆串联, 尚未出现离子色谱与高分辨质谱串联的商业化产品。

本文利用本实验室^[17]发明的实用新型离子色谱-高分辨质谱(IC-HRMS)的接口装置, 在样品及流动相通过抑制器出口后用PEEK(聚醚醚酮)管直接将其与高分辨质谱的进样口连接, 并用另一台泵向抑制器中注入再生液, 建立了一套基于离子色谱-高分辨质谱串联技术筛查乳制品中酸度调节剂的方法, 选取酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、己二酸进行方法学验证, 以此探索新型的离子色谱-高分辨质谱串联技术在乳制品检测中的广泛非目标型的筛查应用。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Dionex ICS-2000离子色谱仪、Q-Exactive高分辨质谱仪(美国Thermo公司); 三通、分流器、外加泵(日本岛津LC-10AT公司); 小型高速离心机(德国Sigma公司); Aspecxl多通道固相萃取仪(法国Gilson公司); Oasis MAX、Oasis WAX固相萃取小柱(规格均为3cc 60 mg, 美国Waters公司); strata SAX、strata XAW固相萃取小柱(规格均为100 mg/3 mL, 美国Phenomenex公司)。

酒石酸、苹果酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、己二酸标准品(纯度均不小于98%, 美国Sigma公司); 甲醇、甲酸(均为色谱纯, 美国Fisher公司); KOH(分析纯, 北京化学试剂公司); 实验用水均由Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)制备。

1.2 色谱条件

离子色谱系统:Dionex ICS 2000。色谱柱:Dionex IonPac AS11-HC柱(250 mm×4 mm); 柱温:30 ℃; 进样量:25 μL; 流速:1.0 mL/min; 流动相:40 mmol/L KOH; 抑制器电流:99 mA; 分析时间:15 min。

1.3 质谱条件

高分辨质谱系统:Q-Exactive; 电喷雾离子源:负离子模式; 喷雾电压:2.80 kV; 质荷比范围:50~300;毛细管电压:2.8 kV; 透镜电压:-50.0 kV; 毛细管温度:320 ℃; 鞘气(N₂)流速:35 arb; 辅助气(N₂)流速:10 arb; 扫描模式:Orbitrap检测器全扫描(full scan)模式检测; 全扫描的分辨率(R): 35 000。

1.4 样品提取和净化

称取0.1 g待测乳制品, 加2 mL pH 7~8 KOH溶液, 充分混合, 在4 ℃以13 000 r/min的速度离心10 min。取上清液, 待净化。将上清液上样至3 mL甲醇、4 mL体积分数为0.1%的KOH活化过的Oasis MAX柱中, 用2 mL体积分数为0.4%的甲酸溶液洗脱, 过0.45 μm水相微孔滤膜, 滤液供分析。

2 结果与讨论

2.1 样品前处理的优化

分别使用水、KOH、氨水作提取溶液, 发现碱性溶液具有更高的提取效率, 同时可利用碱性溶液的蛋白质变性剂功能, 使蛋白质构象发生改变, 聚集沉淀, 从而在提取的同时实现初步净化。

乳制品本身含有大量蛋白质和脂肪, 为有效除去样品中的蛋白质和脂肪, 延长色谱柱的寿命, 缩小稀释倍数, 本文考虑用固相萃取方式对样品进行进一步净化。依据有机酸易解离成阴离子的特性, 试验选取strata SAX、strata XAW、Oasis MAX、Oasis WAX 4种阴离子交换柱进行对比。结果显示, 有机酸在strata XAW、Oasis WAX柱上不保留, 在strata SAX柱和MAX两种强阴离子交换柱上均可保留。这是因为strata XAW和Oasis WAX柱为弱阴离子交换柱, 本文所筛查的有机酸酸性较弱(pK_a 3~4.5), 与柱的离子交换作用弱而不被保留; strata SAX柱和Oasis MAX为强阴离子交换柱, 吸附剂中的正电荷在活化步骤后激活, 结合弱酸性化合物, 从而实现去除杂质的目的。而Oasis MAX柱相比strata SAX柱的操作步骤更为简便, 因此最终选择Oasis MAX为净化小柱。

为使样品中的酸度调节剂完全离子化, 控制上样液pH值在7~8之间, 因为当pH大于8时, 乳酸的保留减弱, 部分样品随上样液流出。测试不同pH值溶液的洗脱效果, 结果显示, 当酸溶液的pH值小于2时, 使用甲酸和磷酸均可达到很好的洗脱效果。这是由于甲酸和磷酸的酸性都较强, 能够使有机酸得到氢离子变为分子形式而被洗脱。鉴于磷酸的存在会干扰质谱系统, 本文选取甲酸为洗脱液。

2.2 色谱条件的选择

离子色谱作为色谱分离系统, 一般使用电导检测器实现对化合物的检测。传统的离子色谱需要被测化合物达到基线分离才能够进行筛查, 要花费较多的时间成本。而对于乳制品这样基质复杂的样品, 即使前期将所有的标准品进行了基线分离, 也很难保证对样品中酸度调节剂的完全分离。使用离子色谱-高分辨质谱串联技术可以从根本上解决分离难题:无需进行色谱条件摸索, 使用提取离子流模式即可实现对目标化合物的分离(见图 1)。本文直接选择流速为1.0 mL/min、流动相为40 mmol/L KOH、分析时间为15 min的条件对样品进行分离, 使用高分辨质谱作为检测器完成实验。其中, 富马酸有3个峰, 对富马酸进行二级质谱裂解, 特征碎片显示这3个峰都有富马酸即反丁烯二酸产生, 推测可能是富马酸的在该离子色谱-质谱检测条件下产生的不同离子形式。

图 1

Fig. 1

图 1 7种酸度调节剂标准品的提取离子色谱图 Fig. 1 Extracted ion chromatograms of the acidity regulators

2.3 高分辨质谱与三重四极杆质谱的区别

传统的串联四极杆质谱属于定量质谱, 在测定目标化合物的灵敏度上有明显优势; 而高分辨质谱属于定性质谱, 其最大特点在于高通量全扫描和数据依赖的多级质谱扫描, 主要优势在于仪器对质量数的分辨率高, 精准性好, 表现为筛选功能和结构确证功能优异, 多应用于样品中非目标型化合物的筛查与定性。Orbitrap高分辨质谱具有质量分辨率高和相对分子质量测定精确的功能, 其测定的精确相对分子质量与理论计算相对分子质量误差在5 ppm(10^-6)之间, 本文选取7种酸度调节剂进行相对分子质量对比, 结果见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 7种酸度调节剂的IC-HRMS分析参数 Table 1 Ion chromatography-high resolution mass spectrometry technology (IC-HRMS) analysis parameters of the seven acidity regulators Number Compound tR/min Calculated m/z Measured m/z Mass error/ppm (10-6) 1 tartaric acid 3.80 149.0090 149.0090 0 2 malic acid 3.66 133.0142 133.0142 0 3 citric acid 6.46 191.0197 191.0199 -1.0 4 lactic acid 3.13 89.0244 89.0243 1.1 5 succinic acid 3.69 117.0193 117.0193 0 6 fumaric acid 4.02 115.0036 115.0036 0 7 adipic acid 3.60 145.0506 145.0505 0.7

表 1 7种酸度调节剂的IC-HRMS分析参数 Table 1 Ion chromatography-high resolution mass spectrometry technology (IC-HRMS) analysis parameters of the seven acidity regulators

2.4 线性范围、回收率和精密度

高分辨质谱用于目标物质筛查的主要优势是可以不使用标准品, 仅根据被筛查物质的分子离子峰计算值即可开展筛查工作。本文所建立的方法适用于乳制品中多种有机酸的筛查, 将拟筛查的酸度调节剂相对分子质量输入系统即可进行筛查, 并不局限于具体某几种有机酸的筛查, 实例中仅选取6种常见的有机酸进行方法学验证。

分别配制6种有机酸的不同质量浓度混合标准系列溶液进行回收率测定, 酒石酸、苹果酸、柠檬酸的系列质量浓度为0、0.1、0.5、1.0、2.5 mg/L; 乳酸、丁二酸的系列质量浓度为0、0.2、1.0、2.0、5.0 mg/L; 己二酸的系列质量浓度为0、0.01、0.05、0.1、0.25 mg/L。以定量离子的峰面积对质量浓度(单位:mg/L)进行线性回归, 在0.01~5.00 mg/L范围内线性关系良好(r≥0.99)。用牛奶、黄油试样进行添加回收率和精密度试验, 样品中添加混合标准液后充分混匀, 静置, 使标准溶液被样品充分吸收, 然后按照本方法测定, 每个样品测定9次, 计算加标回收率和相对标准偏差(RSD), 结果见表 2。由于我国对于乳制品中的有机酸没有限量要求, 参照国家标准^[7]中检出限的要求:酒石酸50 mg/kg、苹果酸100 mg/kg、柠檬酸50 mg/kg、丁二酸250 mg/kg、乳酸50 mg/kg、己二酸5 mg/kg。本文中检测的质量浓度(LOQ)为:酒石酸10.0 mg/kg、苹果酸10.0 mg/kg、柠檬酸10.0 mg/kg、丁二酸20.0 mg/kg、乳酸20.0 mg/kg、己二酸1.00 mg/kg, 能够满足国标要求。由于本方法为筛查方法, 并非定量方法, 在满足国标要求的检出限的前提下未再探测极限值。

表 2 (Table 2)

表 2 乳制品中酸度调节剂的回收率和相对标准偏差(n=9) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of acidity regulators from diary products (n=9) Analyte Milk Butter Background/ (mg/kg) Spiked/ (mg/kg) Found/ (mg/kg) Recovery/ % RSD/ % Background/ (mg/kg) Spiked/ (mg/kg) Found/ (mg/kg) Recovery/ % RSD/ % Tartaric acid 0 10.0 7.43 74.3 2.95 0 10.0 10.45 104.5 0.63 Malic acid 0 10.0 8.59 85.9 3.32 1.19 10.0 12.34 111.5 1.86 Citric acid 0 10.0 10.5 105.0 0.64 51.61 10.0 61.91 103.0 4.97 Lactic acid 1.35 20.0 20.49 95.7 4.81 1.61 20.0 21.77 100.8 4.58 Succinic acid 0.29 20.0 20.61 101.6 2.25 0 20.0 20.74 103.7 2.81 Adipic acid 0.01 1.00 1.165 115.5 1.62 0 1.00 1.083 108.3 1.31

表 2 乳制品中酸度调节剂的回收率和相对标准偏差(n=9) Table 2 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of acidity regulators from diary products (n=9)

2.5 方法的应用

将建立的方法应用于干酪、奶酪、发酵乳、黄油、奶油、牛奶、酸奶等44份实际乳制品样品的检测中, 检出6份样品含有苹果酸, 4份样品含有柠檬酸, 17份样品含有丁二酸, 26份样品含有乳酸, 5份样品含有己二酸, 其余样品未检出目标化合物。样品中有机酸的高分辨质谱图见图 2。

图 2

Fig. 2

图 2 乳制品样品中苹果酸、柠檬酸、丁二酸、乳酸、己二酸的高分辨质谱图 Fig. 2 High resolution mass spectra of malic acid, citric acid, lactic acid, succinic acid and adipic acid in the diary samples

3 结论

本文利用新型离子色谱-高分辨质谱的分析装置, 以乳制品中的有机酸为对象进行方法学验证, 建立了一套基于乳制品中酸度调节剂的筛查分析方法, 为今后探索新型离子色谱-高分辨质谱串联技术在乳制品检测中广泛非目标型的筛查应用提供了基础与思路。

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