色谱  2017, Vol. 35 Issue (8): 848-854   PDF    
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潘剑
陶云国
胰岛素反相制备色谱的方法开发
潘剑 , 陶云国     
海正药业(杭州)有限公司, 浙江 杭州 311404
收稿日期：2017-04-13
通讯联系人：潘剑，E-mail:jpan@hisunpharm.com
摘要：以胰岛素反相制备色谱方法的开发和优化为目标，通过考察色谱保留参数、峰展宽及样品流出曲线的浓度分布等色谱参数，对流动相梯度、色谱填料、载样量等色谱条件进行了优化，并建立了胰岛素制备色谱峰参数的描述方法。结果表明，所建立的方法可快速筛选出最适于胰岛素分离的色谱条件（包括流动相梯度及分离填料），即流动相中的强洗脱溶剂（有机相）需采取缓梯度窄区间的变化条件，筛选出的分离填料需具备峰向两侧展宽且展宽程度较小、样品最高浓度居中分布的特点。将方法用于实际胰岛素粗品的纯化制备，获得了杂质去除效果好、胰岛素纯度高的产品。该法为胰岛素反相色谱纯化制备方法的快速建立提供了指导，具有较强的实用价值，同时为发展大分子化合物的制备色谱方法提供了参考。
关键词：反相制备色谱    色谱参数    峰展宽    浓度分布    胰岛素    
Method development of reversed-phase preparative liquid chromatography for insulin
PAN Jian, TAO Yunguo     
Hisun Pharmaceutical(Hangzhou) Co. Ltd., Hangzhou 311404, China
Abstract: The development and optimization of reversed-phase preparative liquid chromatography method for insulin were performed. The chromatographic retention, sample loading and peak broadening were investigated. The mobile phase gradient conditions and stationary phases were optimized. The parameters of the method contained the peak broadening levels under different amounts of sample loading and the concentration distribution of the target compound in the elution curves. The parameters of peak broadening levels were defined and expressed as a matrix, which consisted of sample loading, the forward broadening and the backward broadening levels. The most suitable chromatographic system (including stationary phases and mobile phase conditions) was selected. A gradient program with slow change of the strong elution solvent was used. The most suitable stationary phase should exhibit the narrower peak broadening and the peaks were best to broaden to both sides comparing to that under the analytical conditions. Besides, the concentration distribution of the target compound should be focused on the middle of the elution. The guide principles were validation by purification of crude insulin products. The preparative chromatographic system constructed through this method can remove impurities effectively. The method has good practical value. It can provide reference for the development of preparative chromatographic methods of other macromolecular compounds.
Key words: reversed-phase preparative liquid chromatography     chromatographic parameters     peak broadening     concentration distribution     insulin    

胰岛素(insulin)是治疗糖尿病的重要药物, 随着人们对药物品质的要求越来越高，对其中杂质的控制越来越严格, 胰岛素的分离纯化也面临着更高的要求[1-3]。通过基因工程生物合成的重组人胰岛素是目前生产胰岛素药物的主要途径之一[4], 在其产品的下游生产工艺中, 反相制备色谱是进行重组胰岛素药物精制的必须环节[5], 但在实际生产中制备色谱方法的开发多凭经验进行, 缺乏系统的理论指导。

胰岛素由51个氨基酸残基组成, 为离子型化合物, 且相对分子质量较大, m/z约为5 700, 在色谱分离过程中, 对流动相的梯度变化比较敏感[6], 因此在建立制备方法优化流动相条件时, 需采取缓梯度的流动相条件。离子型化合物在常规的反相色谱材料高载样量的条件下峰展宽现象十分严重[7], 影响制备效率及产品品质, 因此需对制备色谱方法进行优化以控制色谱峰展宽的现象。虽然非线性色谱理论可以解释一些制备色谱峰展宽的现象并拟合流出曲线[8-11], 但一般采用前沿色谱法, 对样品、溶剂的消耗量大, 且多数以小分子化合物如咖啡因、阿米替林为模型进行研究[12, 13], 在药物实际工业化生产过程中并不适用。

本文以胰岛素反相制备色谱方法的开发和优化为目标, 通过考察色谱保留参数、峰展宽及样品浓度分布等色谱参数, 对流动相梯度、色谱填料、载样量等色谱条件进行了优化。在此过程中建立了胰岛素制备色谱峰参数的描述方法, 并对重组胰岛素粗品进行了应用验证。通过本文的方法可快速建立适合胰岛素纯化的反相制备色谱的条件, 同时可为大分子化合物制备方法的开发提供参考。

1 理论部分
1.1 色谱保留参数

流动相的洗脱条件对目标化合物的保留是否合适具有重要的影响, 一般采用色谱保留参数(a, c)来研究流动相的洗脱强度[14, 15], 反相色谱的保留方程[6]见公式(1)。

(1)

其中, k代表保留因子; a代表与溶质和固定相的相互作用能、溶质同流动相的相互作用能、溶质的分子体积相关的常数[16]; c代表与溶质和流动相中溶剂的作用能相关的常数[16]; CB代表流动相中强溶剂组分(有机相)所占的体积分数(%)。计算保留参数a值和c值时, 根据文献[17]的方法, 各色谱分离系统的死时间(t0)由尿嘧啶测定。

1.2 峰展宽参数

制备色谱中, 由于样品的上样量大(填料质量的1%以上), 色谱峰极易出现峰展宽的现象, 分析色谱中峰的保留时间、峰宽、柱效、分离度等已不适用于描述制备色谱中的色谱峰。根据文献[18]提供的描述制备色谱中小分子化合物峰参数的方法, 用矩阵的方式直观地描述胰岛素在制备色谱中的峰参数, 所用矩阵见公式(2)。

(2)

其中, PLCi为色谱分离体系; Lq为上样量, 即进样的样品质量, 单位为mg; tforward为相对分析色谱中峰向前展宽的程度, 通过tstart-tR, 0获得, 单位为min; tbackward为相对分析色谱中峰向后展宽的程度, 通过tend-tR, 0获得, 单位为min。在本实验中, tR, 0为胰岛素在分析色谱水平下的出峰时间; tstart为胰岛素开始出峰的时间; tend为胰岛素出峰后回到基线的时间。通过不同上样量(至少3次)即可动态描述各色谱分离体系下峰展宽的过程。

2 实验部分
2.1 仪器、试剂与材料

Alliance 2695e高效液相色谱仪, 包括四元梯度泵、自动进样器、紫外检测器、在线脱气机、柱温箱和Empower色谱工作站(美国Waters公司)。色谱柱(250 mm×4.6 mm, 10 μm)使用C8HCE(10 μm, 中国科学院大连化学物理研究所)和Kromasil C8(10 μm, 瑞典AkzoNobel公司)填料分别装填获得。

乙腈(HPLC级)购自美国Merck公司; 甲酸(HPLC级)购自中国百灵威公司; 实验用水由Milli-Q水纯化系统(美国Millipore公司)制备。胰岛素纯品购自中国食品药品检定研究院; 重组胰岛素粗品溶液由本公司发酵部门提供。

2.2 色谱条件
2.2.1 重组胰岛素粗品的制备条件

色谱柱:C8HCE自制色谱柱; 柱温:30 ℃; 流动相:A相为乙腈, B相为0.2%(v/v)甲酸水溶液, C相为胰岛素粗品溶液; 流速:0.7 mL/min; 检测波长:276 nm。梯度洗脱程序:0~2 min, 100%C; 2~7 min, 5%A; 7~12 min, 5%A~12%A; 12~72 min, 12%A~27%A; 72~77 min, 27%A~70%A; 77~82 min, 70%A。在2 min后只有流动相A和流动相B参与梯度洗脱。

2.2.2 制备胰岛素流分分析条件

色谱柱:XBridge C18柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Waters公司); 柱温:30 ℃; 检测波长:214 nm; 流速:1.0 mL/min; 流动相:A相为乙腈、B相为0.2 mol/L硫酸盐溶液(500 mL水中分别加入14.2 g无水硫酸钠、1.35 mL磷酸和0.5 mL乙醇胺, pH=2.3)。梯度洗脱程序:0~5 min, 5%A; 5~10 min, 5%A~24%A; 10~70 min, 24%A~26%A; 70~75 min, 26%A~50%A; 75~85 min, 50%A。

3 结果与讨论
3.1 色谱分离体系的选择
3.1.1 固定相的选择

目前胰岛素的反相制备色谱体系多采用常规的辛基键合硅胶填料(C8填料), 但对于连接了酰胺基、糖基的胰岛素结构类似物，其去除效果有限。胰岛素具有疏水性、极性、离子性的结构特征, 与碱性化合物类似, 这种化合物在色谱上极易出现峰展宽及拖尾现象。据报道[7], 带电荷的反相色谱填料可有效改善碱性化合物的峰形。因此本实验选择了表面带正电荷的C8HCE填料和常用的Kromasil C8材料作为固定相对胰岛素进行分析对比。

3.1.2 流动相的选择

对于胰岛素的分析, 文献多采用乙腈作为有机相, 因此本实验只对水相进行了考察。根据色谱柱填料(带正电荷的反相色谱填料)的性质可知，在低离子强度的酸性流动相条件下，离子型化合物峰拖尾的现象可有效被抑制[7]，因此选择了甲酸(FA)水溶液作为流动相中的水相进行考察；同时根据目标分析物的性质，选择了分离多肽和蛋白质中常用的三氟乙酸(TFA)水溶液和高氯酸盐缓冲液(Buffer-NaClO4, B-NaClO4)作为水相进行考察。

3.2 流动相洗脱条件的优化

采用3.1节选择的固定相和流动相建立不同的色谱分离体系进行梯度洗脱, 利用不同的梯度洗脱程序和公式(1) 计算色谱保留参数a值和c值(见表 1)。从表 1可以看出, 胰岛素在不同的色谱分离体系下, 保留参数a和c的绝对值要大于相对分子质量较小的化合物, 说明胰岛素的保留受流动相的影响比小分子化合物大, 强洗脱溶剂的调节空间较小[6], 微小的比例变化即会引起胰岛素分子保留的巨大变化, 这与前期Chase和Sabharwal[19]、邵晨和高友鹤[20]的研究结果一致。因此在建立胰岛素制备色谱方法时, 对有机相乙腈的变化要进行精确的优化, 一般采用缓梯度窄区间的变化条件。基于以上结果，再结合文献提供的CSASS软件[17]的优化结果和胰岛素的保留时间, 最终确定在进行胰岛素纯品分析时, 乙腈的梯度变化区间设为15%。

表 1 不同色谱分离体系下胰岛素的保留参数(a和c) Table 1 Retention parameters (a, c) of the insulin under different chromatographic separation systems

在优化的流动相梯度条件下, 考察了胰岛素在不同的色谱分离体系下的反相色谱保留, 具体的梯度洗脱条件见表 2。微调流动相比例, 使不同分离体系下胰岛素的出峰时间均保持在35 min左右。首先在低载样量的条件下(10 g/L胰岛素样品溶液, 进样量10 μL), 考察了采用C8HCE或Kromasil C8色谱柱和不同流动相添加剂(FA、TFA和B-NaClO4)的色谱分离体系下, 胰岛素纯品的保留与峰形(见图 1)。可以看出, 在6种色谱分离体系下, 胰岛素的峰形对称, 保留适中(k=10~15)。增大进样量(10 g/L胰岛素样品溶液, 进样量50 μL), 胰岛素的色谱峰出现不同变化, 除C8HCE-FA和Kromasil C8-B-NaClO4色谱分离体系外, 其余条件下胰岛素的色谱峰均出现较明显的拖尾, 且拖尾程度不同。以上结果表明, 在不同的色谱分离体系下, 载样量对胰岛素样品的峰形具有重要影响。

表 2 不同色谱分离体系下胰岛素的梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution programs of the insulin under different chromatographic separation systems

图 1 不同色谱分离系统下进样量为10 μL和50 μL时胰岛素(10 g/L)的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the insulin (10 g/L) under different chromatographic separation systems with 10 μL and 50 μL injection volumes The chromatographic separation conditions were the same as in Table 2.
3.3 胰岛素制备色谱峰参数的描述方法
3.3.1 峰展宽参数的考察

在进样量为1 μL的条件下，对质量浓度为10 g/L的胰岛素样品溶液进行分析, 获得tR, 0, 同时提高胰岛素的上样量(0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 mg), 分别对其进行分析, 色谱图见图 2。利用公式(2), 获得6种色谱分离体系下胰岛素的峰展宽参数, 并定量描述峰展宽的矩阵(见图 3)。结合图 2和图 3, 可以看出, 胰岛素在C8HCE-FA色谱分离体系下的峰展宽具有独特性, 随着上样量的增加, 胰岛素的色谱峰向两侧展宽, tforward/tbackward的绝对值接近1。而在其他色谱分离体系下, 相对分析水平(0.01 mg上样量)，胰岛素的色谱峰基本不向后展宽(矩阵中第三列的数值基本一致), 而是随着上样量的增大, 其色谱峰向前展宽严重(矩阵第二列数据的绝对值逐渐增大)。

图 2 不同色谱分离体系和不同上样量条件下胰岛素的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the insulin under different chromatographic separation systems with different sample loadings The chromatographic separation conditions were the same as in Table 2.

图 3 不同色谱分离体系下胰岛素峰展宽的矩阵描述 Fig. 3 Matrix descriptions of peak broadening of the insulin under different chromatographic separation systems
3.3.2 浓度分布参数的考察

除了峰展宽的方向和程度外, 样品的浓度分布也是另一个描述色谱峰的重要参数。由于制备色谱的进样量大, 检测器过载, 主峰通常会表现为平头峰, 很难直接观察出样品的浓度分布。因此, 设计了样品浓度分布的研究实验, 在胰岛素上样量为10 mg的条件下, 从胰岛素出峰开始到结束, 每隔0.5 min收集一次流分。采用XUnion C4色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm, 中国科学院大连化学物理研究所提供)对流分中胰岛素的浓度进行分析, 观察不同色谱分离体系下胰岛素的浓度分布情况, 结果见图 4。可以看出, 胰岛素在C8HCE-FA色谱分离体系下, 最高浓度出现在样品流出曲线的中间, 但在其他色谱分离体系下, 色谱峰浓度最高点均出现在流出曲线的前半部分, 甚至前两个流分中即出现最高的样品浓度, 这与小分子碱性化合物的吸附行为类似, 属于典型的朗格缪尔(Langmuir)吸附[18]。当主峰浓度的高点出现在流出曲线靠前的位置时, 其前面的杂质会与主峰交叉, 在去除杂质时, 为了保证主峰的纯度, 位于高点的主峰会被部分去除, 造成回收率降低。

图 4 不同色谱分离体系下胰岛素流出曲线的峰浓度分布图 Fig. 4 Peak concentration distribution of elution curves of the insulin under different chromatographic separation systems Column: XUnion C4 (150 mm×4.6 mm, 5 μm); mobile phase A: ACN containing 0.1% (v/v) TFA; mobile phase B: 0.1% (v/v) TFA aqueous solution; isocratic elution: A-B (30:70, v/v); flow rate: 1.5 mL/min; detection wavelength: 214 nm; column temperature: 40 ℃.

综上, 采用制备色谱峰参数方法描述了胰岛素的制备色谱峰展宽情况。C8HCE-FA色谱分离体系与其他色谱分离体系显示出了显著的差异性, 胰岛素的色谱峰向两侧展宽且展宽程度最小、样品的最高浓度居中分布, 据此筛选出了最适于目标化合物纯化制备色谱分离体系。相对于复杂的非线性色谱理论的研究方法, 该方法非常适用于药物工业化的实际制备过程。

3.4 实际胰岛素粗品的纯化制备

参考药典[21], 采用2.2.2节的色谱条件分析胰岛素粗品, 其中存在相对胰岛素保留时间(RRT)为0.57、0.67、0.77、0.86、0.90、0.94、1.08、1.11和1.16的杂质, 胰岛素的纯度为91.81%(见表 3)。同时采用C8HCE-FA和Kromasil C8-B-NaClO4色谱分离体系对胰岛素粗品进行纯化制备, 其制备色谱图见图 5。可以看出, 上样量均为填料量的1.12%(质量分数)时, 在Kromasil C8-B-NaClO4色谱分离体系下主峰更宽且呈现拖尾现象。在上述2个色谱分离体系下, 每分钟接取一次流分, 合并C8HCE-FA色谱分离体系下46~51 min的流分(表 3中的Sample A)和Kromasil C8-B-NaClO4体系下35~47 min的流分(表 3中Sample B), 并在2.2.2节的色谱条件下对2组合并的流分进行分析, 结果见表 3。Sample A中胰岛素的纯度可达到99.32%, 回收率为93.64%; Sample B中胰岛素的纯度为96.95%, 但回收率仅为69.89%。

表 3 不同色谱分离体系下胰岛素和4个主要杂质峰面积的相对含量 Table 3 Relative contents of peak areas of the insulin and four main impurity fractions under different chromatographic separation systems

图 5 不同色谱分离体系下胰岛素的制备色谱图 Fig. 5 Preparative chromatograms of the insulin under different chromatographic separation systems a. column: C8HCE column (250 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phases: (A) ACN, (B) 0.2% (v/v) FA aqueous solution, (C) crude insulin sample; gradient elution program: 0-2.0 min, 100%C; 2-7 min, 5%A; 7-12 min, 5%A-12%A; 12-72 min, 12%A-27%A; 72-77 min, 27%A-70%A, 77-82, 70%A. After 2 min, φ(C) was 0.
b. column: Kromasil C8 column (250 mm×4.6 mm, 10 μm); mobile phases: (A) ACN, (B) B-NaClO4, (C) crude insulin sample; gradient elution program: 0-2.0 min, 100%C; 2-7 min, 5%A; 7-12 min, 5%A-31%A; 12-72 min, 31%A-36%A; 72-82 min, 36%A. After 2 min, φ(C) was 0.

经过纯化制备后, 离主峰较远的杂质可以被完全去除, 仅存在RRT为0.94、1.08、1.11和1.16的4个杂质, 其各自峰面积的相对含量见表 3。可以看出, 采用C8HCE-FA分离体系时4个杂质的去除效果明显优于Kromasil C8-B-NaClO4分离体系, 单个杂质的相对含量可以控制在0.4%以下, 而Kromasil C8-B-NaClO4分离体系中, 个别杂质的相对含量仍在1%以上。

3 结论

建立了胰岛素反相制备色谱方法的开发策略, 大分子化合物的色谱保留受流动相中强洗脱溶剂比例的变化影响较大, 优化流动相条件时需建立有机相缓梯度变化的方法。此外, 比较了不同色谱分离体系下目标峰展宽的参数矩阵和样品浓度分布的曲线, 从而快速筛选出适合化合物制备的色谱分离条件。本文建立的方法亦可指导新材料的研发, 力争发展对目标物峰展宽小且向两侧展宽、样品最高浓度居中分布的材料, 从而大大提高工业制备的生产效率。

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