二硫氰基甲烷(methylene bisthiocyanate, MBT)为黄褐色针状晶体, 分子式为CNS-CH2-SCN, 是一种易挥发的有机硫氰化合物。MBT是一种优异的非氧化性广谱杀菌灭藻剂, 可对皮革工业、油田注水处理等工业生产过程中存在的细菌、真菌、藻类、霉菌以及水体中的原生动物和后生动物有很好的杀灭作用和抑制作用, 也可用作药物、食品、化妆品和农作物等的防腐、防霉和防垢[1-4]。在水产养殖中, MBT主要通过全池泼洒和浸泡等方式杀菌。近年来, MBT在水库、池塘等水产养殖的实际应用中证明[5, 6]其对荧光假单孢菌(Pseudomonas fluorescence)、疖疮型点状产气单孢杆菌(Aeromonas punctata f. furunalus)、水型点状极毛杆菌(Pseudomonas punctata f. ascitae)、鱼害黏球菌(Myxococcus piscicola)、水霉(Sa-prolegnia)和嗜酸性卵甲藻(Oodinium acidophilum)等具有高效的杀灭作用。有研究表明, MBT具有非内吸性的特点, 在环境中易分解成硫氰酸盐及甲醛等, 其残留毒性小, 对鸟类无毒到中毒, 对淡水鱼类和水生无脊椎动物高毒, 对哺乳动物中毒[6-8]。2006年，农业部第627号公告明确废止了在水产品中使用MBT，但由于其杀菌效果好，在水产养殖中仍被广泛使用。因此, 迫切需要建立MBT的检测方法从而监管非法药品的不合理使用。
MBT极不稳定, 其分析方法的建立难度较大。常用的方法有高效液相色谱法(HPLC)[9-11]和气相色谱-氢火焰离子化检测法(GC-FID)[12], 但上述方法均是针对MBT标准品或水体中的MBT, 水产品中MBT的检测方法未有报道。脉冲式火焰光度检测器(pulsed-flame photometric detector, PFPD)是一种新型检测器, 使用的是脉冲式火焰, 其灵敏度高、选择性好。本研究建立的GC-PFPD方法可以准确测定水产品中MBT的含量, 为水产品中药物残留的监控提供简便、快速、实用的检测技术。
GC-450气相色谱仪, 配有PFPD(美国VARIAN公司); AE-240电子天平(美国梅特勒-托利多公司); 20PR-520自动高速冷冻离心机(日本HITACH公司); Hei-VAP旋转蒸发仪(德国Heidolph公司); KD200氮吹仪(杭州奥盛仪器有限公司); HR2105/90高速搅碎机(荷兰飞利浦公司); HQ-60涡旋混合器(北方同正生物技术发展有限公司); SK40-120DJ超声仪(张家港市神科超声电子有限公司)。
MBT标准品(纯度99.0%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 无水硫酸钠(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 中性氧化铝固相萃取小柱(1 g/3 mL)和乙腈、二氯甲烷、正己烷(色谱纯)(美国CNW公司); 超纯水(电阻率为18.2 MΩ\5cm, 美国Millipore公司)。
称取MBT标准品0.0050 g, 置于25 mL棕色容量瓶中, 用乙腈溶解并定容, 配制质量浓度为200 mg/L的标准储备液, 于-4 ℃冰箱中避光保存; 依次用二氯甲烷稀释上述标准储备液, 配制质量浓度为1.0、2.0、5.0、10.0和20.0 mg/L的系列标准工作液。
鱼类:去鳞, 沿脊背取肌肉(带皮); 对虾:去头、去壳、去附肢, 取可食肌肉部分; 中华绒螯蟹、中华鳖:取可食肌肉部分。将上述处理过的样品切成不大于0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm的小块后, 混匀, 高速搅碎机充分搅匀, 密封, 标记, 于-18 ℃冷冻保存。
称取(1.00±0.01) g解冻后的样品, 置于10 mL具塞玻璃离心管中, 加入4 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v), 涡旋混匀1 min, 在室温下超声振荡提取10 min, 以5 000 r/min离心5 min, 用玻璃胶头滴管移取上清液于另一10 mL玻璃离心管中。残渣用4 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)重复提取一次, 合并两次上清液, 混匀, 于40 ℃下氮吹至0.5~1.0 mL, 待净化。
取中性氧化铝固相萃取小柱, 在小柱上层添加1.0 g无水硫酸钠, 将上述氮吹后的液体过柱, 用2.0 mL二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)洗涤容器, 过柱, 收集两次的溶液于试管中, 用8 mL二氯甲烷洗脱固相萃取柱, 收集洗脱液于同一试管中, 于40 ℃下氮吹至干, 并用二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)定容至1 mL, 涡旋1 min，使其完全溶解, 供仪器分析。
色谱柱:HP-5MS石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm, 美国Agilent公司); 进样口温度:110 ℃; 进样方式:无分流进样; 柱流速:1.0 mL/min; 载气:氮气, 纯度≥99.999%, 流速2 mL/min; 燃气:氢气, 纯度≥99.999%, 流速13 mL/min; 助燃气:空气, 纯度≥99.999%, 流速17 mL/min; 检测器温度:250 ℃; 程序升温:初始温度50 ℃, 保持1 min, 以25 ℃/min升温至180 ℃, 保持2 min; 进样量:1.0 μL; 门延迟:6 ms; 门开启宽度:20 ms; 触发点位:200 mV。
本实验比较了不同的溶剂(丙酮、乙腈、二氯甲烷、N, N-二甲基甲酰胺)对MBT的溶解效果。分别称取0.0050 g的MBT标准品, 用以上4种有机溶剂溶解于10 mL棕色容量瓶中, 随后转移至20 mL棕色样品瓶中, 于4 ℃冰箱内放置一周。结果表明, 用丙酮和二氯甲烷溶解时瓶子底端有少量黄褐色沉淀析出; 用乙腈和N, N-二甲基甲酰胺溶解时则没有任何沉淀析出, 说明溶解较完全。随后用二氯甲烷分别稀释用乙腈和N, N-二甲基甲酰胺溶解的标准储备液, 并进行仪器分析。发现采用乙腈配制的标准储备液的灵敏度较采用N, N-二甲基甲酰胺的高且基线平稳。因此本实验选择用乙腈溶解MBT标准品, 配制标准储备液。
水产品中具有较多的油脂, 所以常作为水产品提取溶剂的有丙酮、乙酸乙酯、乙腈、二氯甲烷以及其他不同比例的混合溶液[13-15]。丙酮和乙腈的极性较强, 能从样品中提取大量油脂、色素等, 不利于后续净化, 难以得到较高的回收率。本实验比较了正己烷、二氯甲烷和二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)作为提取剂时, 水产品中二硫氰基甲烷的提取效果。结果表明, 正己烷能够把较多的脂肪提取出来, 杂质峰较多; 二氯甲烷较难把水产品中的脂肪溶解, 使得最终得到的溶液比较浑浊; 二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)作为提取溶剂时, 提取液澄清透明, 获得的色谱图杂峰较少, MBT的峰形好, 灵敏度高。因此, 实验选择二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)作为提取溶剂。
使用固相萃取小柱是为了去除复杂基质中的脂肪、蛋白质、水分和其他杂质, 从而达到净化的目的, 若不经过净化直接进样, 不仅杂质峰多, 干扰目标化合物, 且容易堵塞色谱柱, 造成色谱柱损坏。实验比较了相同规格的弗罗里硅土固相萃取小柱和中性氧化铝固相萃取小柱对样品的净化效果。结果表明, 采用中性氧化铝固相萃取小柱时, MBT的峰形尖锐, 杂峰少, 回收率在74.5%~97.3%之间, 能够满足实验要求; 采用弗罗里硅土固相萃取小柱时, 目标物质的灵敏度较低, 杂峰较多, 且回收率在57.2%~70.1%之间。故最终采用中性氧化铝固相萃取小柱净化样品。
实验比较了采用乙腈和二氯甲烷两种溶剂作为洗脱溶剂时的净化效果。当采用乙腈洗脱时, 由于其极性较强, 洗脱下来的物质多, 杂质峰较多, 且进样口容易堵塞; 采用二氯甲烷洗脱时, 目标物的灵敏度较高, 且杂质峰较少, 因此选为实验所用。
实验还考察了不同体积(5、8、11 mL)的洗脱溶剂对目标化合物回收率的影响。结果表明, 随着洗脱溶剂体积的增加, 回收率逐渐增大, 采用8 mL和11 mL的洗脱溶剂洗脱, 样品的回收率相差不大, 但是采用11 mL洗脱时, 氮吹时间较长。因此为了保证目标化合物全部洗脱下来, 且尽量地减少氮吹时间, 设定洗脱溶剂的体积为8 mL。
实验比较了二氯甲烷、正己烷和二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)3种定容液的效果。在经过前处理过程后, 用二氯甲烷定容, 溶液浑浊, 不适合进样; 用正己烷定容, 溶液澄清, 但仪器分析结果显示, 色谱图杂峰较多, 目标物的灵敏度较低; 用二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)定容时, 溶液澄清, 目标物的灵敏度较高, 峰形对称。因此, 实验选择二氯甲烷-正己烷溶液(1：1, v/v)作为定容液。
实验比较了不同进样口温度(100、110、150、200 ℃)对MBT色谱行为的影响。当进样口温度为100 ℃时未检测到MBT标准品。当进样口温度为110 ℃时能准确地检测到MBT标准品, 灵敏度较高, 且峰形较好; 当进样口温度为150 ℃时, MBT标准品的灵敏度较110 ℃时低; 当进样口温度为200 ℃时MBT标准品出峰不稳定, 时有时无。由于MBT是非极性物质, 很容易气化, 且有研究表明, 该物质极易分解, 因此进样口温度采用110 ℃较合理。
实验比较了200 ℃和250 ℃的检测器温度对MBT色谱行为的影响。发现采用250 ℃时, MBT的灵敏度更高, 峰形更稳定。最终确定检测器温度为250 ℃。
比较了不分流和分流的进样方式对MBT色谱响应的影响。由于MBT属于易挥发且易分解的物质, 采用不分流模式的检测结果比分流模式高一个数量级, 因此选为实验所用。
由于需要两个硫原子生成一个激发态的S2, 处于电子激发态的S2分子发射碎片, 由PFPD产生信号, 该信号正比于在燃烧室中硫浓度的平方, 这样含硫化合物的浓度就与峰面积的平方根成正比。实验所用的仪器设置中有一个平方根采集模式, 即仪器自动进行数据的开平方, 但鉴于MBT的灵敏度较低, 本实验不采用平方根模式采集信号, 但是最终数据的处理采用开平方的计算方式。
在最终色谱条件下对系列标准工作液进行测定, 以MBT的色谱峰面积为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, mg/L)绘制标准曲线。MBT的出峰时间为6.18 min, 线性方程为Y=4 874.7X-1 823.3, 相关系数(R2)为0.997 1。
在不含目标化合物的空白样品中添加一定含量的MBT标准溶液, 并对其进行分析, 根据7个空白样品基线噪声的平均值, 按S/N=3和S/N=10计算方法的检出限和定量限, 分别为0.1 mg/kg和0.5 mg/kg, 满足残留分析的要求。MBT标准溶液、加标的鳗鲡样品和空白鳗鲡样品的色谱图见图 1。
向不含被测物的草鱼、鳗鲡、对虾、中华绒螯蟹和中华鳖样品中分别添加低、中、高(1.0、2.0、5.0 mg/kg)3个水平的MBT标准品, 进行回收率测定, 每个添加水平同时做7个平行样品, 结果见表 1。MBT的加标回收率为65.6%~97.6%, 相对标准偏差为6.32%~12.8%(n=7)。
随机抽检了一组池塘中的鱼类样品, 包括白鲢、草鱼和乌鳢各3条, 分别按1.2和1.3节的方法进行前处理和分析。结果表明, 白鲢体内MBT的含量为0.62 mg/kg, 草鱼和乌鳢体内均未检出MBT。
本实验建立了GC-PFPD测定水产品中二硫氰基甲烷残留的分析方法。该法的前处理操作简单、回收率高、重复性好、灵敏度高, 获得的MBT峰形尖锐、对称, 无杂质峰干扰, 适合水产品中二硫氰基甲烷物质的残留分析。
2017,
Vol. 35 Issue (8): 881-885
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