通过型固相萃取-液相色谱-串联质谱法同时快速测定鱼肉中7种微囊藻毒素


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李诗言^1,2 , 王扬¹ , 王鼎南¹ , 吴洪喜¹ , 丁雪燕¹ , 崔益玮² , 沈清²

1. 浙江省水产质量检测中心, 浙江杭州 310023;
2. 浙江工商大学海洋食品研究院, 浙江杭州 310012

收稿日期：2017-04-17

基金项目：浙江省水产品质量安全技术支撑团队项目（QS2016001）

通讯联系人：王扬, Tel:85029759, E-mail:wangyangruanfeng@163.com; 沈清, Tel:88071024, E-mail:leonqshen@163.com

摘要：采用通过型固相萃取净化去除样品基质中脂类物质的干扰，建立了鱼肉中7种微囊藻毒素的液相色谱-串联质谱快速分析方法。样品经80℃水浴热处理后用体积分数为90%的甲醇水溶液进行提取，使用Oasis PRiME HLB通过型固相萃取柱净化。净化后的样品采用Waters XSelect HSS T3色谱柱分离，以0.1%（体积分数）甲酸乙腈溶液和0.1%（体积分数）甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱，多反应监测正离子模式扫描，采用基质匹配溶液外标法定量。研究了7种微囊藻毒素的质谱离子化特征，结果表明，酸能显著增加双电荷离子的响应强度。7种目标物在相关范围内线性关系良好，相关系数不低于0.99，定量限为0.30~2.0 μ g/kg，基质加标回收率为70.6%~96.1%，相对标准偏差为3.4%~9.6%。该方法前处理操作简便，灵敏度和准确度高，可实现鱼肉中多种微囊藻毒素的同时快速测定。

关键词：通过型固相萃取液相色谱-串联质谱双电荷离子微囊藻毒素鱼肉

Rapid and simultaneous determination of seven microcystins in fish meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry coupled with pass-through solid phase extraction

LI Shiyan^1,2, WANG Yang¹, WANG Dingnan¹, WU Hongxi¹, DING Xueyan¹, CUI Yiwei², SHEN Qing²

1. Aquatic Products Quality Inspection Center of Zhejiang Province, Hangzhou 310023, China;
2. Institute of Seafood, Zhejiang Gongshang University, Hangzhou 310012, China

Foundation item: Zhejiang Province Technical Team Projects for Quality and Safety of Aquatic Products (No. QS2016001)

Abstract: An analytical method was developed for the simultaneous and rapid determination of seven microcystins in fish meat by liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) coupled with pass-through solid phase extraction (SPE). The samples were extracted with methanol-water (90:10, v/v) after heat treatment by water bath at 80℃, and then cleaned up with an Oasis PRiME HLB pass-through SPE column. The samples were analyzed directly on a Waters XSelect HSS T3 column using 0.1% (v/v) aqueous formic acid and acidified acetonitrile (0.1% formic acid, v/v) as mobile phases. Qualitative and quantitative analysis of the analytes was carried out under the multiple reaction monitoring mode with positive electrospray ionization. The matrix matching external standard method was used for quantitation analysis. To solve the problem of parent ion selection of the microcystins, the ionization characteristics of microcystins were evaluated under different mobile phase conditions. Finally, the results showed that the acid could promote the intensity of the doubly charged ions significantly. The calibration curves were linear well in the corresponding concentration ranges, with correlation coefficient ≥ 0.99. The limits of quantification ranged from 0.30 to 2.0 μ g/kg. The average spiked recoveries for the seven microcystins were between 70.6% and 96.1% with the relative standard deviations of 3.4%-9.6%. The proposed method is sensitive, accurate, and efficient. It is applicable for the determination of microcystins in fish meat.

Key words: pass-through solid-phase extraction liquid chromatography-tandem mass (LC-MS/MS) doubly charged ions microcystin (MC) fish meat

微囊藻毒素(microcystins, MCs)是一类由淡水蓝藻水华所产生的单环7肽生物毒素, 在水域中分布广泛且具有强烈的肝毒性、神经毒性及生殖毒性, 同时也是肝癌的促进剂^[1-3]。目前发现的MCs异构体已经达到了80种以上^[4], 典型的化学结构见图 1。近年来, 我国水体富营养化情况较为普遍, 藻类的大量繁殖导致了蓝藻水华现象日益频繁^[5], 同时大量的研究^[6-8]已经证明MCs可以通过食物链传递到水生动物中, 其在淡水鱼中富集所导致的潜在人体健康风险已经引起了国内外学者的普遍关注。因此建立一种淡水鱼肉中高效、准确、灵敏的MCs分析检测方法, 对水产品的质量安全与相关风险监测工作具有重要意义。

MCs的检测方法主要包括酶联免疫法^[9]、液相色谱法^{[9, 10]}和液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法^[11-14]等, 其中LC-MS/MS法通量较大, 定性能力强, 更适用于复杂基质中MCs的残留检测。目前, MCs的前处理大多采用吸附目标物后再洗脱的SPE方法^{[11, 13, 15, 16]}, 常需要溶剂替换, 且操作步骤相对繁琐。此外, MCs作为环肽类化合物, 其ESI⁺离子化特征较为特殊, 可同时形成单电荷离子[M+H]⁺和双电荷离子[M+2H]²⁺^[17], 因此其质谱分析方法还存在着不少差异。如Beltrán等^[16]采用LC-MS/MS方法检测了水中6种MCs残留, 发现除了微囊藻毒素-RR(MC-RR)易形成双电荷离子[M+2H]²⁺外, 其余MCs均主要形成单电荷离子[M+H]⁺; 王超等^[17]建立了蓝藻中5种MCs的LC-MS/MS分析方法, 其中MC-RR、微囊藻毒素-YR(MC-YR)和微囊藻毒素-LR(MC-LR)的双电荷离子[M+2H]²⁺响应较强, 被选为MRM方法的母离子, 其余MCs则选择单电荷离子[M+H]⁺作为母离子。

本研究在样品前处理上采用通过型SPE净化方法, 具有快速、高通量的特点; 同时探究了MCs的质谱离子化特征, 并在此基础上优化了MRM方法参数, 建立了高灵敏度、高准确度的LC-MS/MS检测方法, 实现了鱼肉中7种MCs(化学结构式见图 1)的快速测定。

图 1 部分微囊藻毒素的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of some microcystins (MCs)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1200系列液相色谱仪(美国Agilent公司); 4000 Qtrap三重四极杆质谱仪(美国AB SCIEX公司); HD120-T8数控式恒温循环水浴槽(英国PRIMA公司); Multi Reax全能型振荡器(德国Heidolph公司); Allegra X-12高速离心机(美国BECKMAN公司); 5427R台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司)。Oasis PRiME HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Oasis HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL)、Sep-Pak C18固相萃取柱(500 mg/6 mL)、XSelect HSS T3色谱柱(150 mm×2.1 mm, 3.5μm)(美国Waters公司)。

7种MCs标准品的含量均高于95%(中国台湾Algal Sciences公司); 甲醇、乙腈和甲酸(色谱纯, 美国TEDIA公司); 实验用水为Milli-Q(美国Millipore公司)超纯水。其余试剂均为国产分析纯。

1.2 标准溶液的配制

以甲醇为溶剂分别配制7种MCs标准储备液(质量浓度均为10 mg/L), 临用时以空白鱼肉基质提取液将上述标准溶液稀释为系列混合标准工作液。

1.3 样品的采集与制备

样品为市售鲤鱼、鲫鱼和草鱼, 分别取肌肉组织, 用清水去除血污与泥沙后, 用干纱布小心吸除多余水分, 放入搅拌机中制为匀浆状, 置于-20℃冻藏备用。

1.4 样品前处理

1.4.1 热处理与样品提取

称取2.0 g鱼肉样品于50 mL离心管中, 盖上螺旋盖, 置于80 ℃水浴加热20 min。取出离心管, 加入5 mL 90%(体积分数, 下同)甲醇水溶液, 高速漩涡震荡5 min, 以5 000 r/min的速度离心5 min, 转移全部上清液于10 mL带刻度比色管中。再向离心管中加入4 mL 90%甲醇水溶液重复上述提取步骤, 合并提取液并用90%甲醇水溶液定容至10 mL(样品提取液), 备用。

1.4.2 样品净化

准确移取5 mL 1.4.1节中的样品提取液于Eppendorf离心管中, 在4 ℃下以12 000 r/min的速度离心10 min。取2.5 mL上清液加于Oasis PRiME HLB柱上, 控制流速为1滴/s, 自然流干后再加入2 mL 90%甲醇水溶液润洗柱子, 收集全部流出液, 于40 ℃下氮吹至近干。用0.5 mL甲醇复溶, 溶液过0.22μm有机相滤膜, 上机检测。

1.5 液相色谱-质谱条件

色谱柱:Waters XSelect HSS T3柱; 柱温:40℃; 进样量:10 μL。流动相:A为0.1%甲酸乙腈溶液, B为0.1%甲酸水溶液; 梯度洗脱程序:0~1 min, 75%B; 1~5 min, 75%B~5%B; 5~9 min, 5%B; 9~10 min, 5%B~75%B; 10~16 min, 75%B; 流速:0.30 mL/min。

离子源:电喷雾离子源, 正离子模式; 离子源温度:550 ℃; 电喷雾电压:5 500 V; 雾化气(GS1) 压力:379 kPa; 辅助气(GS2) 压力:345 kPa; 气帘气(CUR)压力:172 kPa; 扫描方式:MRM模式。优化后的质谱参数见表 1。

表 1 7种微囊藻毒素的质谱参数 Table 1 Mass spectrometric parameters of the seven MCs

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

2.1.1 酸对MCs离子化特征的影响

MCs的离子化特征是影响本方法分析结果的重要因素之一, 目前相关研究报道^{[13, 15, 17]}对于MCs母离子价态的选择存在着较大差异。检测人员在建立质谱方法时, 往往会采用标准溶液针泵进样(通常为无酸流动相环境)进行方法开发, 而进行多肽类化合物LC-MS/MS分析时, 为了提高灵敏度, 会往流动相体系中加入适量的酸^[18]。为了探究流动相环境中酸是否会影响MCs的离子化特征, 进行了如下考察:7种MCs标准品被配制为C、D两组标准溶液, 其中C组采用纯甲醇配制, D组采用添加0.1%甲酸的甲醇溶液配制, 两组标准溶液质量浓度均为5 mg/L。分别对C、D两组标准溶液进行针泵流动注射进样, 流速为5 μL/min, 质谱采用Q1 center/width扫描模式, 选择7种MCs的[M+H]⁺和[M+2H]²⁺离子为目标离子, 质量窗口为5 Da, 源条件参照1.5节, 其余参数缺省, 开启MCA(multichannel acquisition), 采集10次循环叠加后的数据。

结果(见表 2)表明, 酸的加入能够显著改变MCs的带电特征, 增加其双电荷离子的响应丰度比例。以[M+2H]²⁺离子强度为基准(设其值为100%), 同时确定[M+H]⁺离子的丰度情况(百分比为其离子强度与[M+2H]²⁺离子强度的比值乘以100%)。本研究中7种MCs在酸影响下的离子化特征变化可以大致归为以下3类:(1) MC-RR在C、D两组中均为双电荷离子响应强度较高。酸的加入进一步提高了MC-RR双电荷离子的丰度占比, 离子丰度情况从C组的[M+2H]²⁺(100%)＞[M+H]⁺(28%)改变到D组的[M+2H]²⁺(100%)＞[M+H]⁺(6%); (2) MC-YR和MC-LR在C组中为单电荷离子响应强度较高, 能形成一定强度的双电荷离子(强度约为单电荷离子的四分之一), 在D组中则为双电荷离子强度较高。酸的加入显著地提高了MC-YR和MC-LR双电荷离子的丰度占比, 离子丰度情况从C组的[M+2H]²⁺(100%)＜[M+H]⁺(460%和416%)改变到D组的[M+2H]²⁺(100%)＞[M+H]⁺(31%和37%); (3) 微囊藻毒素-LW(MC-LW)、微囊藻毒素-LF(MC-LF)、微囊藻毒素-LY(MC-LY)和微囊藻毒素-LA(MC-LA)在C组中为单电荷离子响应强度较高, 基本不产生双电荷离子, 在D组中单、双电荷离子响应强度较为接近。酸的加入同时提高了MC-LW、MC-LF、MC-LY和MC-LA单、双电荷离子响应强度, 但双电荷离子的提升幅度更高, 离子丰度情况从C组的[M+2H]²⁺(100%)＜[M+H]⁺(840%~1 250%)改变到D组的[M+2H]²⁺(100%)＜或者＞[M+H]⁺(67%~112%)。

表 2 酸对7种微囊藻毒素单、双电荷离子强度的影响 Table 2 Influences of acid on [M+H]⁺ and [M+2H]²⁺ ion abundances of the seven MCs

有研究^[19]表明, 溶剂的pH对电喷雾离子源中多肽类物质的带电状态起到了至关重要的作用, 多肽等化合物通过带电残基理论形成的多电荷离子会受到溶剂和电解质的影响, 优化质谱方法时是否考虑酸的因素很可能是造成MCs母离子价态选择差异的原因之一。精氨酸含有胍基, 易发生电离, MC-RR含有两个精氨酸, 因而易生成双电荷离子^[13]; MC-LW、MC-LF、MC-LY和MC-LA的R₁和R₂位置基团(见图 1)均为疏水性氨基酸, 因此相对难以产生双电荷离子。流动相中酸的加入能促使MCs在离子化过程中溶剂表面电荷向其转移, 使之更易产生多电荷离子, 同时酸性条件也能进一步抑制化合物加钠、加钾离子的形成, 这可能是加入酸后导致MCs的双电荷离子响应强度大幅提升的原因。

2.1.2 离子对的选择

根据2.1.1节试验结果, 选用强度较高的双电荷离子作为MC-RR、MC-LR和MC-YR的母离子, MC-LW、MC-LF、MC-LY和MC-LA由于单、双电荷离子响应强度较为接近, 则单、双电荷离子同时被选为母离子进行MRM参数优化。结果表明, 所有MCs的母离子均能生成m/z 135.1的子离子, 且响应强度较高。m/z 135.1离子是MCs共有基团(2S, 3S, 8S, 9S)-3-氨基-9-甲氧基-2, 6, 8-三甲基-10-苯基-4, 6-二烯酸(Adda)结构甲氧键断裂形成的特征碎片(见图 1), 故作为本方法的定量离子。同时MC-LW、MC-LF、MC-LY和MC-LA的双电荷离子所产生碎片较少, 除m/z 135.1离子外, 其余碎片离子响应强度均较低, 因此选用其单电荷离子的m/z 135.1碎片作为定性离子。根据欧盟的2002/657/EC决议^[20]中有关质谱分析方法中必须不少于4个识别点数的规定, 两个母离子分别对应一个子离子, 能够获得5个识别点数, 能更好地满足化合物的定性要求, 7种MCs的MRM参数见表 1。

2.2 色谱条件的优化

通常使用乙腈作为有机相或在水相中添加0.1%甲酸均能使MCs获得更高的灵敏度^[12-15], 本研究在此基础上考察了在乙腈中添加0.1%甲酸对MCs色谱分离和质谱灵敏度的影响。结果表明, 当乙腈中加入0.1%甲酸后, MC-LW、MC-LF、MC-LY和MC-LA响应值明显提升, 分离度及重复性良好。上述4种MCs极性均相对较弱, 出峰时间迟, 此时流动相中乙腈比例较高, 如乙腈中不添加0.1%甲酸, 会减少系统中酸的含量, 降低MCs双电荷离子的响应强度。采用优化后的色谱条件, 所有待测物峰形良好, 灵敏度较高, 7种MCs的总离子流色谱图见图 2。

图 2 液相色谱-串联质谱测定7种微囊藻毒素标准溶液(5 μg/L)的总离子流色谱图 Fig. 2 Total ion chromatogram of the seven microcystin standard solution (5 μg/L) by LC-MS/MS

2.3 前处理条件的优化

2.3.1 提取试剂的选择与热处理条件的确定

甲醇是提取生物体中MCs常用的提取试剂, MCs亲水性不同, 在甲醇中加入一定比例的水可满足大部分MCs的提取需要^{[4, 14]}。本研究选用了体积分数为60%、70%、80%、90%的甲醇水溶液以及纯甲醇作为提取试剂进行提取试验。结果表明, 当提取溶液中甲醇体积分数为90%时, 能兼顾7种MCs的提取效率, 通过2次分步提取, 7种MCs均能获得满意的提取效果, 回收率为86%~94%。

MCs会与样品基质中的蛋白磷酸酶特异性结合, 造成样品加标验证时回收率下降^[4]。考虑到MCs具有良好的热稳定性, 本研究采用高温水浴对样品进行热处理。通过热处理, 一方面可以使基质中的蛋白磷酸酶失活, 减少其与MCs的结合作用; 另一方面可以使样品蛋白质热变性沉淀, 减少后续净化的负担。参考文献^[4], 本研究选用80 ℃作为水浴温度, 并做了水浴时间的优化。结果表明, 水浴20 min后, 7种MCs的平均回收率便达到稳定, 此时平均回收率相比未进行热处理组提高了9%, 之后随着水浴时间的增加, 7种MCs的平均回收率无显著变化, 因此最终确定水浴时间为20 min。

2.3.2 通过型SPE方法的优化

蛋白质和脂类物质是鱼肉中主要的基质干扰物, 以往生物基质中MCs的净化手段大多采用富集浓缩类型的SPE方法, 该类方法涉及溶剂替换、SPE柱的活化、上样、淋洗和洗脱等操作步骤, 耗费时间较长。鉴于本方法的MCs提取液为高比例的有机相, 因此采用通过型SPE方法对样品进行净化。按照1.4.1节方法获得鲤鱼、鲫鱼、草鱼的提取液各2份, 按照1.4.2节方法取1 mL提取液通过SPE小柱获得净化后的基质溶液, 以基质效应(martrix effect, ME)评价了Sep-Pak C18、Oasis HLB和Oasis PRiME HLB小柱对7种MCs的净化效果, 并与未净化样品进行了比较。ME计算公式如下:ME=(基质空白溶液加标信号强度/空白溶剂加标信号强度)×100%; 6份样品的ME数据合并后按“均值±标准差”进行处理。结果(见图 3)表明, Oasis PRiME HLB柱对于MC-LF和MC-LW有显著的净化效果, 两者的ME值均超过了60%; Sep-Pak C18和Oasis HLB小柱处理后样品与未净化样品基质效应基本相当, 对于MCs无明显的净化效果。Oasis PRiME HLB柱作为新型的亲水-亲脂固相萃取小柱能够更好去除样品中脂肪和磷脂类化合物^[21]。MC-LF和MC-LW极性较弱, 出峰时间较迟, 共流出的干扰物同样以弱极性化合物为主, 更适合Oasis PRiME HLB柱进行净化, 另外样品基质中磷脂的去除也可以减轻质谱系统的负担, 有利于大批量样品检测的稳定性。最终, 本研究采用Oasis PRiME HLB作为SPE方法的使用柱。

图 3 不同SPE柱对7种微囊藻毒素在鲫鱼、鲤鱼和草鱼肉中基质效应的影响(n=6) Fig. 3 Effects of the different SPE columns on the matrix effects of the seven microcystins in Cyprinus carpio, Carassius auratus and Ctenopharyngodon idellus fish meat (n=6)

由于SPE小柱柱容量有限, 上样量过大可能导致柱子过载, 影响样品的净化效果, 上样量过小则会增大稀释倍数, 降低方法的灵敏度, 因此需要确定合适的上样量。本研究考察了上样量对MCs净化效果的影响, 发现提取液的上样量超过0.5 g鱼肉基质当量(即上样量为2.5 mL)后, 净化后样品的MC-LF和MC-LW基质效应开始显著增加。进一步考察了上样量为2.5 mL时7种MCs过柱后的回收率损失, 平均回收率损失为8%, 满足检测需要, 因此最终选取2.5 mL为最佳上样量。

2.4 标准曲线、线性范围和定量限

由2.3.2节的结果可知, 经过Oasis PRiME HLB小柱的净化, 部分MCs仍然具有中等或高等强度的基质抑制效应, 因此本方法采用基质匹配工作标准曲线对7种MCs进行定量, 以消除基质效应的影响。由图 3可知, 本方法处理后的鲤鱼、鲫鱼和草鱼样品中7种MCs的ME值具有良好的一致性。为简化检测工作, 采用空白鲤鱼样品配制基质溶液, 所有空白鲤鱼样品均事先进行检测验证, 无MCs残留。取适量MCs混合标准储备液, 用空白鲤鱼基质提取液配制成6种不同质量浓度的混合标准工作溶液, 以峰面积(y)为纵坐标、质量浓度(x, μg/L)为横坐标绘制标准曲线, 得出线性回归方程、线性范围和相关系数(r)(见表 3)。同时, 根据10倍信噪比(S/N)确定被测物的方法定量限(LOQ)。结果表明, 7种MCs的线性关系良好, 定量限为0.30~2.0 μg/kg, 满足MCs高灵敏度检测的需要。

表 3 7种微囊藻毒素的线性范围、回归方程、相关系数和定量限 Table 3 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r) and LOQs of the seven microcystins

2.5 回收率与精密度

在空白鲤鱼样品中添加7种MCs混合标准溶液, 制备成2、10和50 μg/kg的加标样品, 按上述前处理方法及测定条件进行回收率试验, 每个添加水平平行测定6次, 结果见表 4。7种MCs的回收率为70.6%~96.1%, RSD为3.4%~9.6%。

表 4 空白鲤鱼肉中7种微囊藻毒素的加标回收率及相对标准偏差(n=6) Table 4 Spiked recoveries and relative standard deviations (RSDs)of the seven microcystins in blank Cyprinus carpio fish meat (n=6)

2.6 实际样品检测

与现行国家标准^{[9, 11]}和相关文献^{[4, 13]}报道方法相比, 本方法在提升灵敏度的同时还可以将检测周期缩短1 h以上, 更适用于大批量样品的检测。采用本方法对市售的12批次鲤鱼、10批次鲫鱼和8批次草鱼样品进行MCs快速检测。检测结果表明:1批次鲤鱼中同时检出MC-RR和MC-LR, 残留量分别为8.92和4.52 μg/kg; 1批次鲫鱼中检出MC-LR, 残留量为3.98 μg/kg; 其余样品均未检出MCs。

3 结论

本研究采用通过型SPE净化, 建立了鱼肉中7种MCs的LC-MS/MS快速检测方法。方法中7种MCs在酸性流动相条件下选用双电荷离子作为母离子能够获得更高的检测灵敏度, 鉴于不同厂商质谱在设计结构上存在着不少差异(特别是离子源), 该现象是否具有普适性还值得进一步研究。此外, 如能利用在线SPE等高效净化系统, 基于通过型SPE方法, 便可以达到MCs的全自动多样品净化检测分析, 能够进一步提升检测效率。

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