双乙酰(diacetyl), 化学名称为2, 3-丁二酮, 是一种具有挥发性的发酵产物, 因其具有特殊香气, 现已被作为食品添加剂广泛应用于食物中^[1]。双乙酰具有显著的感官、生化和毒理特性, 其宜人的香气可能使人们忽略其本身对人体健康的危害^[2]。据报道^[3], 长期吸入双乙酰会不同程度的影响肺功能并诱发多种肺部疾病；双乙酰会引起淀粉样肽的聚集，从而诱发阿茨海默症等；双乙酰与2-脱氧鸟苷形成共价化合物，使DNA解旋，导致细胞凋亡。双乙酰在酒中的作用取决于其在酒中的浓度和酒的种类^[4]。双乙酰可与酒中的酯类化合物相互作用, 促进酯类化合物挥发, 使酒具有特殊的复合香味及口感^[5]。但如果双乙酰含量过高, 则会对酒的风味产生负面影响, 极大地影响酒的品质。一般来说, 名优白酒中双乙酰的含量较高, 约为1.16~4.65mmol/L, 而质量较差的白酒中双乙酰的含量则较低; 葡萄酒中双乙酰的含量通常应低于116μmol/L。因此建立有效实用的检测双乙酰含量的方法不仅对于各种发酵类食品的质量控制具有重要意义, 而且有利于保障食品行业从业人员的健康安全。

目前常用的检测双乙酰的方法为柱前衍生高效液相色谱法, 最常用的衍生化试剂是能与双乙酰形成喹喔啉结构的邻苯二胺(OPD)。OPD是目前性价比较好的衍生化试剂, 其与双乙酰形成的衍生物可以利用HPLC进行分离，并以紫外、荧光或质谱的方法进行检测, 适用于食品中双乙酰含量的测定, 如各种酒类^[6-14]、咖啡^{[15, 16]}和蜂蜜^[17]等。但该方法的缺点是衍生化反应需在约40℃甚至更高的温度下加热至少10 min, 以确保反应完成; 如果在室温下进行反应, 则必须在避光条件下反应几个小时甚至过夜^[17]。由于酒类样品中的乙酰乳酸存在非酶氧化过程, 反应温度较高或反应时间较长都可能导致乙酰乳酸转化为双乙酰, 从而降低测定结果的准确性^[18]。用于HPLC法测定双乙酰的其他衍生化试剂通常是OPD的结构类似物或衍生物, 但这些化合物常常需要在更严苛的条件下才能与双乙酰完全反应, 例如5, 6-二氨基-2, 4-二羟基嘧啶(60~80 ℃, 30 min)^[10]、3, 4-二氨基吡啶(90 ℃, 2 h)^[11]和4-硝基-1, 2-二氨基苯(45 ℃, 20 min)^{[13, 14]}等。

3, 3′-二氨基联苯胺(DAB)在各研究领域中的用途十分广泛, 目前主要作为单体用于制备耐高温树脂和纤维材料等^[19]。而在分析领域中其应用并不多见, 主要用于分光光度法测定硒的含量^{[20, 21]}。本课题组在前期的研究工作中发现, DAB的双乙酰衍生物4-(2, 3-二甲基-6-喹喔啉基)-1, 2-邻苯二胺(DABMD)可作为双乙酰的衍生化试剂, 并利用DABMD建立了柱前衍生-高效液相色谱测定啤酒中双乙酰的方法^[22]。但该方法的缺点是衍生化试剂DABMD需要实验室自己制备, 这也使得该方法的使用受到了限制。因此, 开发能够方便快捷使用的新型双乙酰衍生化试剂就显得十分必要。

本文直接以3, 3′-二氨基联苯胺作为双乙酰的衍生化试剂(DAB与双乙酰的反应方程式见图 1), 建立了柱前衍生高效液相色谱测定酒中双乙酰含量的分析方法。本方法相较之前的报道具有明显优势, 衍生化过程简便、快捷, 衍生化产物稳定, 便于推广应用。

图 1

Fig. 1

图 1 双乙酰与衍生化试剂DAB的反应方程式 Fig. 1 Reaction equation of diacetyl with derivatization reagent DAB DAB: 3, 3′-diaminobenzidine; DABMD: 4-(2, 3-dimethyl-6-quinoxalinyl)-1, 2-benzenediamine; rt: room temperature.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200高效液相色谱仪(配有二极管阵列检测器(DAD))、8453紫外光谱仪、6520液相色谱-质谱仪(美国Agilent公司); Varian Inova-600 MHz核磁共振仪(美国Varian公司)。

3, 3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(分析纯, 美国Fluka公司); 双乙酰(分析纯, 上海晶纯试剂有限公司); 甲醇(色谱级, 美国Sigma-Aldrich公司)。超纯水由Milli-Q系统(美国Millipore公司)制备, 其他试剂均为分析纯。红酒及白酒样品均购自西安本地。

1.2 标准溶液的配制

精确称量0.018 g 3, 3′-二氨基联苯胺四盐酸盐, 以超纯水溶解后定容至10.0 mL, 配制浓度为5 mmol/L的DAB标准储备液(pH 2.0~3.0);精确称量双乙酰0.043 g, 以超纯水溶解后定容至5.0 mL, 配制浓度为100 mmol/L的双乙酰标准储备液; 根据实验需要, 稀释上述溶液, 配制适当浓度的标准工作液。以上试剂均在4 ℃下保存备用。

1.3 衍生化产物的制备

准确称取108 mg (0.3 mmol) 3, 3′-二氨基联苯胺四盐酸盐, 加入10 mL蒸馏水, 待完全溶解后, 加入35 mg (0.4 mmol)双乙酰, 于室温下搅拌30 min进行衍生化反应后, 用2 mol/L的NaOH溶液调节反应混合溶液的pH值至9.0, 然后用15 mL氯仿萃取3次, 合并萃取液, 加入少量无水MgSO₄干燥2 h后, 过滤, 将滤液减压浓缩, 得到暗红色固体, 用硅胶色谱柱进行纯化, 洗脱液为氯仿-甲醇-二乙胺混合溶液(60:10:1, v/v/v)。用薄层色谱检测, 展开剂为氯仿-甲醇-二乙胺混合溶液(60:15:1, v/v/v)。将比移值(R_f)为0.35的部分收集、合并, 减压旋蒸后得到暗红色粉末, HPLC检测后，用ESI-MS和¹H-NMR进行结构鉴定。

1.4 衍生化反应

1.4.1 优化条件时的衍生化过程

准确移取10 μL双乙酰标准储备液, 加入200 μL DAB标准储备液, 用超纯水稀释至1.00 mL, 使用涡流混合器充分混匀, 于室温下放置10 min, 过0.22μm滤膜, 待HPLC分析。

1.4.2 实际样品测定时的衍生化过程

移取0.89 mL待测酒样品, 加入0.1 mL 2.0 mmol/L的DAB标准工作液, 混匀, 然后加入0.01 mL超纯水或双乙酰标准工作液(双乙酰标准溶液的浓度根据待测样品中双乙酰的浓度进行调整), 涡旋混匀, 于室温下放置10 min后, 移取10 μL进行HPLC测定。

1.5 色谱条件

色谱柱:Shim-pack VP-ODS色谱柱(250 mm×4.6 mm, 4.6μm, 日本岛津公司); 流动相:(A)甲醇和(B)水。梯度洗脱程序:1~10 min, 60%A; 10~15 min, 100%A; 15~17 min, 60%A。进样量:10 μL; 流速:0.7 mL/min; 检测波长:254 nm。流动相在使用前用0.22μm滤膜过滤。

2 结果与讨论

2.1 衍生化产物的结构鉴定

研究表明, 水中的邻苯二胺类化合物在室温下即可迅速与邻二酮类化合物反应生成喹喔啉类衍生物^[23]。因此尝试了在室温条件下、酸性水溶液中使DAB与双乙酰进行衍生化反应(反应物摩尔比为1:1)，并对衍生化产物进行紫外光谱测定。结果显示, 室温下反应10 min后, 反应混合物的紫外光谱图已与DAB标准品的紫外光谱图完全不同(见图 2a), 这说明该反应在选定的实验条件下可快速进行。从图 2中也可以观察到衍生化产物的最大吸收波长(λ_max)出现在254 nm处。

图 2

Fig. 2

图 2 DAB标准品、衍生化产物的(a)紫外光谱图和(b)衍生化反应后混合物的HPLC色谱图 Fig. 2 (a)UV spectra of DAB standard and derivative product and (b) HPLC chromatogram of the reaction mixture of DAB and diacetyl The amount of substance ratio of DAB to diacetyl were 1:1. The other reaction conditions were the same as in Fig. 1.

衍生化反应后混合物的HPLC色谱图见图 2b, 可以看出, 除少量反应物DAB(保留时间(t_R)为4.11 min)残留外, 还出现两个色谱峰, t_R分别为7.61 min和13.12 min, 说明反应中可能产生了两个产物。LC-MS结果显示, 保留时间为7.61 min的色谱峰对应物质的相对分子质量为265.1, 推测可能为DABMD。为证明该推测, 制备了衍生化反应产物并对其进行了高效液相色谱、高分辨质谱和核磁共振分析。HPLC检测结果显示，所得化合物的保留时间为7.65 min；高分辨质谱数据显示其相对分子质量为265.145 3;核磁共振氢谱显示，在低场区(δ 7.0~7.5) 有6个质子信号, 而在高场区(δ 2.3~2.4) 有两个单峰甲基信号。以上结果均表明衍生化反应的产物为DABMD(结构式见图 1)。

2.2 衍生化反应条件的优化

2.2.1 反应物比例的优化

由2.1节可知, 当DAB与双乙酰反应的物质的量之比为1:1时，反应会生成两个产物, 其中一个产物是DABMD, 而另一个则可能是彻底双乙酰化的产物, 这可能是因为衍生化试剂DAB具有两组可反应的邻二氨基基团, 而这一现象的存在会影响方法的灵敏度。为解决该问题, 当DAB与双乙酰反应时，对二者设定了不同的物质的量之比，考察衍生化的反应情况(见图 3)。结果显示, 当DAB与双乙酰的物质的量之比≥8:1时, 反应中仅产生单一的衍生化产物DABMD。因此为保证方法的可靠性, 最终选择DAB与双乙酰的反应物质的量之比为10:1。

图 3

Fig. 3

图 3 不同物质的量之比的DAB与双乙酰化反应产物的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the product of reaction of DAB with diacetyl on different amount of substance ratios

2.2.2 反应体系的酸度、温度及反应时间的优化

通常情况下, 反应体系的酸度、温度及反应时间都对反应效果有直接影响, 因此考察了当DAB与双乙酰的物质的量之比为10:1时，上述这几个因素对衍生化反应的影响。

首先考察了不同的酸度(pH分别为3.0、5.0、7.0、9.0、10.0) 对衍生化产物峰面积的影响(见图 4a)。结果表明, 当反应体系的酸度在pH 3.0~10.0之间变化时, 产物DABMD的峰面积基本不变, 说明该衍生化反应不受酸度的影响。由于DAB标准溶液的pH值为2.0~3.0, 因此选择pH 3.0作为衍生化反应体系的酸度, 该酸度也有利于保护HPLC系统。

图 4

Fig. 4

图 4 (a)酸度、(b)时间和(c)温度对衍生化产物峰面积的影响 Fig. 4 Effects of (a) acidities, (b) times and (c) temperatures on the peak area of derivative product

其次，在室温下考察了不同的反应时间(5、10、20、30、40、50和60 min)对衍生化产物峰面积的影响(见图 4b)。结果表明, 当反应为10 min时，衍生化产物的峰面积最大, 且随反应时间的延长, 产物的峰面积无明显变化, 因此实验确定10 min为最佳反应时间。

实验还考察了不同反应时间(5 min和10 min)下不同的反应温度(20、40和60 ℃)对衍生化产物峰面积的影响(见图 4c)。结果表明, 随着反应温度的升高衍生化产物的峰面积基本不变, 因此反应在室温下进行即可。

2.3 方法评价

2.3.1 乙醇含量对检测结果的影响

由于白酒中乙醇的含量较高, 因此实验考察了衍生化反应体系中乙醇的含量对衍生化产物峰面积的影响(见图 5)。在DAB与双乙酰反应体系中分别加入不同体积分数(0%、10%、50%、90%)的乙醇, 然后在优化后的条件下进行衍生化反应, 并测定了衍生化产物的生成量。测定结果显示, 反应体系中乙醇的含量对衍生化产物的峰面积基本没有影响, 表明乙醇的存在不干扰衍生化反应的进行。

图 5

Fig. 5

图 5 乙醇的体积分数对衍生化产物峰面积的影响(n=3) Fig. 5 Effects of percentage of volume of ethanol on the peak area of the derivative product (n=3)

2.3.2 标准曲线、检出限和精密度

分别配制浓度为500、200、50、8、4、2、1、0.5和0.2μmol/L的双乙酰和DAB标准溶液, 将相同浓度的DAB与双乙酰标准溶液按10:1的体积比混合均匀, 室温下放置10 min后进行HPLC检测。每个浓度水平设置3个样品, 每个样品平行测定3次。测定结果显示, 在0.20~180μmol/L的浓度范围内衍生化反应产物的峰面积(y)对进样浓度(x, μmol/L)的线性回归方程为y=23.694x+6.630 7, 相关系数(R²)为0.999。进一步的测定结果表明, 当信噪比(S/N)为3时, 方法的检出限为0.09μmol/L; 当S/N为10时, 方法的定量限为0.20μmol/L。在一天内对浓度为10μmol/L的双乙酰标准工作液进行6次平行测定, 获得日内精密度(RSD)为1. 28%。说明所建立的方法具有线性关系良好、测定浓度范围宽、重复性好的特点。

2.3.3 稳定性

将双乙酰与DAB溶液混合, 进行衍生化反应, 分别在室温下放置1、5、10、24、48、72及96 h后, 测定衍生化产物的峰面积。结果表明, DABMD峰面积的RSD为1.23%(n=6)。说明衍生化产物的稳定性良好。

2.4 实际样品检测

采用标准加入法分别测定了两种白酒及两种红酒中双乙酰的含量(见表 1)。双乙酰标准溶液的加入量根据实际样品中双乙酰的含量进行调整, 每个样品平行测定3次。结果显示, 双乙酰的加标回收率为92.0%~103.6%, RSD为0.69%~3.45%(n=3)。说明建立的方法可用于酒中双乙酰含量的准确测定。

表 1 (Table 1)

表 1 白酒和红酒样品中双乙酰的浓度、加标回收率和相对标准偏差 Table 1 Concentrations, recoveries and RSDs of the diacetyl spiked in liquor and red wine samples Sample Background/(μmol/L) Added/(μmol/L) Found/(μmol/L) Recovery (n=3)/% RSD (n=3)/% Distilled liquor A 23.41 10.00 33.34 99.31 1.17 20.00 43.05 98.25 1.32 30.00 54.49 103.67 0.82 Distilled liquor B 1.55 1.00 2.47 92.03 3.31 2.00 3.48 96.54 2.98 3.00 4.36 93.77 3.45 Red wine A 16.32 10.00 26.30 99.88 2.12 20.00 36.46 100.79 1.65 30.00 46.87 101.81 0.69 Red wine B 7.33 5.00 12.12 95.82 2.22 10.00 17.39 100.64 0.99 15.00 22.16 98.93 1.32

表 1 白酒和红酒样品中双乙酰的浓度、加标回收率和相对标准偏差 Table 1 Concentrations, recoveries and RSDs of the diacetyl spiked in liquor and red wine samples

3 结论

本研究建立了以DAB为衍生化试剂的柱前衍生高效液相色谱测定白酒及红酒中双乙酰含量的分析方法。该方法线性范围宽, 重复性好, 准确度高, 克服了已有方法中衍生化条件苛刻, 耗时长, 衍生化试剂不易获得等缺点, 可用于酒类样品中双乙酰含量的快速准确测定。

参考文献

[1]	Cheng H F. Crit Rev Food Sci, 2010, 50(10): 938. doi: 10.1080/10408390903044081
[2]	Ortega C, López R, Cacho J, et al. J Chromatogr A, 2001, 931(1/2): 205.
[3]	Kovacic P, Cooksy A L. Arch Toxicol, 2005, 79(3): 123. doi: 10.1007/s00204-004-0602-z
[4]	Bartowsky E J, Henschke P A. Int J Food Microbiol, 2004, 96(3): 235. doi: 10.1016/j.ijfoodmicro.2004.05.013
[5]	Wang L, Lin L, Wang D Q, et al. Liquor-Making Science & Technology, 2014, 242(8): 91. 王莉, 林琳, 汪地强, 等. 酿酒科技, 2014, 242(8): 91.
[6]	de Revel G, Pripis-Nicolau L, Barbe J C, et al. J Sci Food Agric, 2000, 80(1): 102. doi: 10.1002/(ISSN)1097-0010
[7]	Da Silva Ferreira A C, Reis S, Rodrigues C, et al. J Food Sci, 2007, 72(5).
[8]	Ramos R M, Pacheco J G, Goncalves L M, et al. Food Control, 2012, 24(1/2): 220.
[9]	Santos C M, Valente I M, Goncalves L M, et al. Analyst, 2013, 138(23): 7233. doi: 10.1039/c3an00766a
[10]	del Carmen Hurtado-Sánchez M, Espinosa-Mansilla A, Rodríguez-Cáceres M I, et al. J Agric Food Chem, 2014, 62(1): 97. doi: 10.1021/jf404180t
[11]	Rodríguez-Cáceres M I, Palomino-Vasco M, Mora-Diez N, et al. Food Chem, 2015, 187(6): 159.
[12]	Pacheco J G, Valente I M, Goncalves L M, et al. Talanta, 2010, 81(1): 372.
[13]	Li P L, Zhu Y C, He S, et al. J Agric Food Chem, 2012, 60(12): 3013. doi: 10.1021/jf3007163
[14]	Mahar K P, Khuhawar M Y, Kazi T G, et al. Asian J Chem, 2010, 22(9): 6983.
[15]	Daglia M, Papetti A, Aceti C, et al. J Agric Food Chem, 2007, 55(22): 8877. doi: 10.1021/jf071917l
[16]	Papetti A, Mascherpa D, Gazzani G. Food Chem, 2014, 164: 259. doi: 10.1016/j.foodchem.2014.05.022
[17]	Marceau E, Yaylayan V A. J Agric Food Chem, 2009, 57(22): 10837. doi: 10.1021/jf903341t
[18]	Chai P H, Li S, Wu H P, et al. Industrial Microbiology, 2001, 31(4): 31. 柴平海, 李爽, 吴海平, 等. 工业微生物, 2001, 31(4): 31.
[19]	Yan H P, Luo Y, Li Z J, et al. Food Science and Technology, 2010, 35(12): 263. 严和平, 罗宇, 李自静, 等. 食品科技, 2010, 35(12): 263.
[20]	Jia S S, Zhu L Q, Zhu F H, et al. Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2012, 44(6): 74. 贾姗姗, 朱连勤, 朱风华, 等. 畜牧与兽医, 2012, 44(6): 74.
[21]	Ramadan A A, Mandil H, Shikh-Debes A. Int J Pharm Pharm Sci, 2014, 6(3): 148.
[22]	Wang J Y, Wang X J, Hui X, et al. J Agri Food Chem, 2017, 65: 2635. doi: 10.1021/acs.jafc.7b00990
[23]	Delpivo C, Micheletti G, Boga C. Synthesis, 2013, 45(11): 1546. doi: 10.1055/s-00000084