随着色谱技术的发展, 混合模式色谱(MMC)作为一种新型的液相色谱可以与溶质产生多种形式的相互作用[1, 2]。MMC相对于常规的单模式色谱的主要优势在于可以在单个色谱柱上实现多种类型的分离。例如, 反相液相色谱(RPLC)通常用于分离非极性化合物, 而亲水作用液相色谱(HILIC)用于分离极性化合物。但是这两种模式的色谱在分离复杂样品时都遇到了一些困难。RPLC/HILIC混合模式色谱具有分离疏水性和亲水性化合物的特殊能力, 可以用于不同类型混合物的分离[3]。
液相色谱的进步主要依赖于固定相的发展, 因此越来越多的新型混合模式固定相被合成出来并应用于复杂化合物的分离。张静等[4]将硅胶与氨丙基三甲氧基硅烷和葡萄糖酸内酯反应制备了一种多羟基化合物修饰的新型RPLC/HILIC混合固定相, 并成功分离了6种酚酸和糖苷以及丹参注射液。Qiu等[5]通过使用磺酸偶氮苯改性二氧化硅基质, 合成了一种RPLC/HILIC固定相。这种固定相可以分离7种黄酮类化合物和一系列极性化合物。此外在分离Tanaka测试混合物(尿嘧啶、苯酚、咖啡因、丁基苯、三联苯、戊基苯、苯并菲)时也显示出一定的优势。Aral等[6]合成了一种将含氮基团与苯基相结合的反相/亲水色谱固定相, 这种固定相既可以在HILIC模式下分离核苷类化合物, 也可以在RPLC模式下分离酚类化合物, 并成功分离了9种核苷类混合物、11种植物激素和7种酚类化合物。然而, 这些RPLC/HILIC色谱固定相大多是基于二氧化硅介质, 而以二氧化硅为基质的色谱柱的pH使用范围有限, 通常在2~8之间, 这是由于硅氧键在高pH时被腐蚀断裂, 导致硅胶骨架坍塌, 柱压升高, 且其表面的官能团也会缓慢溶解。
聚倍半硅氧烷作为一类新型的有机-无机杂化材料[7], 其结构单元中既含有“有机基团”又含有“无机结构”, 因此兼具有机聚合物化学稳定性好和无机聚合物机械强度高的优异性能。其中, 聚甲基倍半硅氧烷(PMSQ)已经应用于反相色谱固定相。Nakanishi等[8-10]制备了一种以PMSQ为基质的大孔整体柱, 分别在正相和反相模式下分离了极性和非极性化合物。Rosenberg等[11-13]综合评价了一组具有分级孔结构的PMSQ整体柱的色谱性能。尽管这些色谱柱的热力学性能(如疏水选择性和硅羟基活性)与辛烷基键合硅胶柱相当, 但是动力学性能却很低, 在分析化合物时峰展宽严重。为了解决聚倍半硅氧烷整体柱柱效低的问题, 需要开发出一种单分散性好, 孔径合适的球形聚倍半硅氧烷色谱固定相。
球形聚倍半硅氧烷微球的合成可以通过各种途径进行[14], 但是所制备的微球基本上是无孔结构[15], 不能满足色谱分离的需要。因此, 我们开发了一种合成单分散多孔聚甲基倍半硅氧烷微球的新方法[16], 并且通过乙烯基三甲氧基硅烷与甲基三甲氧基硅烷的水解共缩聚合成了乙烯基功能化聚甲基倍半硅氧烷(V-PMSQ)微球, 最终将其应用于反相色谱填料。初步结果表明, 这种固定相在没有后续键合C18的情况下已具有较高的碳载量, 且化学稳定性优于二氧化硅。
本文以V-PMSQ微球为基质, 采用巯基-烯基点击化学[17]在其表面键合半胱氨酸, 合成了新型RPLC/HILIC混合模式色谱固定相半胱氨酸修饰的乙烯基功能化聚甲基倍半硅氧烷(C-V-PMSQ), 并对其进行表征和色谱评价。以相对分子质量较低的极性化合物(核苷和核酸碱基)作为测试溶质考察其在反相和亲水模式下的保留行为。接着通过对苯的同系物和亲水性、疏水性化合物的分离, 考察了固定相的色谱性能。最后以中药苦参的主要活性成分作为实际样品, 考察了其在高碱性条件下利用不同分离模式的分离情况。
S-4800场发射扫描电镜(日本Hitachi公司); Multisizer 3库尔特计数及粒度分析仪(美国贝克曼库尔特有限公司); NOVA 3000比表面分析仪(美国康塔公司); Vario元素分析仪(德国Elementar公司); Infinityplus 300 MHz固体核磁共振谱仪(美国瓦里安公司); 安捷伦1200高效液相色谱分析仪, 配G1322A脱气机、G1311A四元泵、G1329A自动进样器、G1329A柱温箱、G1314B紫外检测器和ChemStation色谱工作站(美国安捷伦公司)。
甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙烯基三甲氧基硅烷(VTMS)(含量为98%, 湖北武大有机硅新材料股份有限公司)。甲苯、L-半胱氨酸、浓盐酸(天津市江天化工技术有限公司)。偶氮二异丁腈(AIBN)、乙苯、丁苯(天津市光复精细化工研究所)。氨水(25%)、甲醇、无水乙醇(分析纯, 天津市康科德科技有限公司)。胸腺嘧啶、胞苷、腺嘌呤、胞嘧啶、胞苷、鸟苷(上海麦克林生化科技有限公司)。丙苯、戊苯(上海萨恩化学技术有限公司)。苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱标准品(纯度≥98%，中国药品生物制品检定所)。
将16.32 g(0.12 mol)MTMS, 4.44 g(0.03 mol) VTMS和100 mL超纯水置于配有机械搅拌装置的250 mL三口瓶中。在室温下搅拌2 h, 水解反应完全后, 将8 μL氨水加入反应体系中, 继续搅拌2 min后停止搅拌。在30 ℃静置反应3 h。将所获得的二氧化硅微球经过乙醇和蒸馏水多次洗涤后, 将其悬浮于80%(v/v)乙醇水溶液中, 加入氨水(3 mL/g), 并在70 ℃水浴摇床振摇12 h。之后用乙醇和蒸馏水洗涤至中性。并在80 ℃下减压干燥过夜, 制备得到20%(质量分数)乙烯基含量的乙烯基功能化聚甲基倍半硅氧烷微球。
将1.05 g(8.68 mmol)L-半胱氨酸, 60 mL 30%(v/v)甲醇水溶液和0.5 mL(6 mmol)浓盐酸置于100 mL反应瓶中, 超声将半胱氨酸溶解。再加入3 g(含8.64 mmol乙烯基) V-PMSQ微球和0.07 g(0.432 mmol)AIBN, 经连续振荡使微球和AIBN溶解。之后通入氮气, 除氧。最后将反应瓶口密封, 放入70 ℃恒温振荡水浴中, 连续振荡10 h。之后将微球经乙醇和蒸馏水离心洗涤数次, 80 ℃减压真空干燥, 得到C-V-PMSQ微球。C-V-PMSQ色谱填料的总反应示意图见图 1。
采用常规高压匀浆法进行装柱。称取适量微球样品, 均匀分散于异丙醇中, 制成装柱匀浆液。在30 MPa的压力下, 以甲醇为顶替液, 将固定相填充到150 mm×4.6 mm不锈钢柱管中, 得到C-V-PMSQ色谱柱。
溶质的保留因子k=(t-t0)/t0, 其中t为溶质的保留时间, t0为甲苯在乙腈-水(95:5, v/v)条件下的保留时间。
流动相:核酸类化合物, 乙腈-20 mmol/L甲酸铵; 苯同系物, 甲醇-水(80:20, v/v); 亲水性与疏水性化合物, 乙腈-水(75:25, v/v); 碱性药物, 乙腈-20 mmol/L甲酸铵(NaOH调节pH)。检测波长:核酸类化合物、苯同系物、亲水性与疏水性化合物为254 nm; 碱性药物为220 nm。流速:1.0 mL/min。柱温:25 ℃。
使用扫描电镜对C-V-PMSQ微球进行表面形貌表征。结果如图 2a所示, 微球的球形规则, 单分散性好。使用库尔特粒度分布仪测得微球的平均粒径为6.5 μm(见图 2b)。
图 3a和3b分别给出了C-V-PMSQ微球的氮气吸附-解吸等温线和孔径分布图。从图 3中可以看出:微球显示了典型的Ⅳ类吸附等温线, 表明微球的孔结构规则有序, 孔径分布窄。氮气吸附和脱附量p/p0在0. 6至0. 9之间逐渐增大, 从孔径分布图可看出微球的孔径大致分布在6.6 nm左右, 是典型的介孔结构。使用p/p0=0.95处的点确定总孔体积(Vp)为0.8466 mL/g。氮气吸附脱附BET法测得比表面积(SBET)为579 m2/g。结果表明, C-V-PMSQ微球具有较高的比表面、较大的孔体积和合适的孔径。
图 4为V-PMSQ和C-V-PMSQ微球的红外表征谱图。可以看出, 与V-PMSQ相比, C-V-PMSQ显示出较强的羧酸吸收峰。其中, 1 730 cm-1处的吸收峰为羰基的伸缩振动。3 400 cm-1附近宽峰的强度增加, 这是由于羧酸中的羟基使微球表面的羟基浓度增强。而在C-V-PMSQ中未明显观察到氨基的特征吸收峰, 一方面是由于氨基不稳定, 易氧化, 另一方面氨基的C-N伸缩振动在3 300~3 500 cm-1之间, 可能被较强的羟基吸收峰掩盖。
表 1列出了V-PMSQ和C-V-PMSQ的元素分析仪结果。由碳元素的含量变化可以计算出C-V-PMSQ的键合量为0.45 μmol/m2。
由于C-V-PMSQ固定相表面具有亲水基团(-COOH, -NH2)和疏水基团(-CH3, -CH=CH2), 因此它可能具有亲水和反相双重保留特性。以几种常见的核苷和核酸碱基作为测试样品, 研究了乙腈-水体系中溶质的保留因子和流动相中水的体积分数的关系。结果如图 5所示, 当流动相中水的含量由0增大到50%(v/v)时, 溶质的保留因子逐渐减小, 此时水为强洗脱剂, 体现出HILIC的保留特性。但是, 当水的比例继续增大, 保留因子反而呈现增大的趋势, 体现出RPLC的保留特征。溶质在C-V-PMSQ固定相上的保留因子随流动相中水的含量的变化曲线均呈现“U”型, 表明溶质的保留机理是混合机理, 即亲水相互作用色谱和反相色谱的双重保留机理。
核酸类极性化合物通常被用于评价HILIC固定相的色谱性能, 我们详细研究了5种核苷酸在C-V-PMSQ色谱固定相上的保留行为(见图 5)。
我们还根据HILIC保留模型研究了保留因子与水含量(5%~30%)的定量关系, 如公式(1) 及公式(2)[18]:
基于公式(1) 的多元回归结果见表 2。
由表 2可以看出, 公式(1) 中得到的所有回归系数(R2)均不小于0.999 6。公式(2) 用于表示HPLC的分配机制, 其回归系数为0.978 2~0.986 1。这表明核酸在公式(1) 中的拟合度优于公式(2)。因此, 核酸在C-V-PMSQ上的保留与公式(2) 中描述的分配机制不相符, 它们的保留机制不仅仅是分配机制, 还包括一些其他相互作用, 如吸附机制、离子交换机制等。
在HPLC中, 溶质和固定相之间疏水相互作用的程度以及固定相的保留模式可以通过考察烷基苯在固定相表面的保留行为来确定。本文考察了一系列烷基苯(包括甲苯、乙苯、丙苯、丁苯和戊苯)在C-V-PMSQ固定相上的保留因子对数(log k)和碳数之间的关系。结果表明, 烷基苯在C-V-PMSQ色谱柱上的保留随着苯环上碳数的增加而增大, 且呈良好的线性关系。通过计算可知, C-V-PMSQ的平均亚甲基选择性为1.363, 与C18相当, 且疏水性较强。这是由于固定相表面存在大量的甲基和未反应的乙烯基, 使其具有19%的高碳载量, 这使得C-V-PMSQ固定相能够较好地应用于反相色谱模式。
由于制备得到的C-V-PMSQ色谱固定相具有HILIC和RPLC保留模式, 因此可将其用于同时分离亲水性和疏水性化合物。以亲水性的尿嘧啶、鸟苷和疏水性的联苯、丙基苯、戊基苯作为测试样品, 使用C-V-PMSQ色谱固定相, 以乙腈-水(75:25, v/v)为流动相对这5种混合物进行分离。结果如图 6所示, 这5种化合物在6 min之内实现了基线分离, 且峰形对称。在商品化的C18色谱柱上使用相同的色谱条件分离亲水性与疏水性化合物, 可以看出, 在C18色谱柱上5种混合物的分离时间较长, 且尿嘧啶和鸟苷几乎同时被洗脱, 色谱峰重叠。以上结果表明, 在色谱热力学方面, C-V-PMSQ色谱固定相的亲水、疏水选择性较好, 可同时用于分离亲水性与疏水性化合物, 且分离效果优于商品化的C18色谱柱。而在色谱动力学方面, C-V-PMSQ色谱柱的柱效比C18色谱柱略低, 一方面是由于C-V-PMSQ填料的粒径(6.5 μm)比C18色谱柱(约5 μm)大, 使填料的涡流扩散增大, 柱效降低。另一方面C-V-PMSQ填料的孔径(6.6 nm)比C18色谱柱(约10 nm)小, 影响了溶质分子在色谱柱中的传质, 最终导致C-V-PMSQ色谱柱的柱效比C18色谱柱略低。
除了可以在不同模式下分离多种化合物外, C-V-PMSQ色谱固定相还具有优异的化学稳定性, 可以耐受较高的pH。使用碱性流动相通常可以改善碱性化合物的峰形和保留, 因而C-V-PMSQ成为分离碱性化合物的理想固定相。本文通过一个实例考察了这种色谱固定相在分离碱性药物中的潜力。苦参是豆科植物苦参的干燥根, 有清热燥湿、杀虫、利尿之功效, 已经被《中国药典》正式收录。苦参碱、槐定碱和氧化苦参碱是苦参的干燥根中的主要活性成分, 《中国药典》利用氨基柱的亲水色谱性质分离它们, 但氨基柱不稳定, 使用寿命短, 这使得色谱图重复性变差。另外, 还可以使用键合C18的二氧化硅反相色谱柱在碱性流动相条件下分离它们, 但常规的二氧化硅色谱柱的pH使用范围有限。本工作使用C-V-PMSQ色谱柱, 分别在pH 6和pH 10的流动相中使用不同比例的水相分离苦参碱(pKa 8.2)、槐定碱(pKa 8.9) 和氧化苦参碱(pKa 6.9) 混合标准液。
在流动相的pH为6时, 生物碱以高亲水性的离子形式存在。当水相的体积分数为8%时, 3种生物碱以苦参碱、槐定碱、氧化苦参碱的顺序被分离, 显示出HILIC分离模式。随着水相的比例逐渐增加, 它们的保留先减小后增加, 表现了分离模式的转变(见图 7)。在高水相的条件下, 它们的出峰顺序发生反转, 变为氧化苦参碱、槐定碱、苦参碱, 显示出RPLC分离模式。但是, 此时生物碱处于完全电离状态, 使得它们的疏水性较弱, 在RPLC模式下没有完全分离。调节流动相的pH至10, 使其高于生物碱的pKa。此时生物碱处于未电离状态, 疏水性较强。在高水相和低水相的条件下, 它们的出峰顺序与在低pH条件下一致。不同的是, 由于亲水性减弱, 疏水性增强, 所以在低水相的HILIC模式下溶质的保留略微减弱, 而在高水相条件下溶质的保留显著增强, 使生物碱在RPLC模式下得到较好的分离。值得注意的是, 在水含量为40%时, 溶质的保留顺序为氧化苦参碱、苦参碱、槐定碱, 体现了二维色谱的特征。
制备并表征了半胱氨酸改性的乙烯基功能化聚甲基倍半硅氧烷微球的新型HILIC/RPLC混合模式固定相, 发现其对核苷和核酸碱基的保留呈现U型曲线, 表明C-V-PMSQ固定相具有亲水和反相的双重保留特性。它对于苯的同系物和亲水性与疏水性化合物均具有较好的分离效果。由于C-V-PMSQ固定相具有良好的化学稳定性及双重保留模式, 因此可以在高pH条件下, 利用不同的模式分离碱性药物, 且表现出二维色谱的特征。其在碱性化合物的分离中具有较大的应用价值。
2017,
Vol. 35 Issue (9): 927-933
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