亲水作用色谱-串联质谱测定尿液中尼古丁和可替宁


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	李明昕

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李明昕¹ , 王倩¹ , 朱婧¹ , 任琳² , 雍莉² , 邹晓莉¹

1. 四川大学华西公共卫生学院卫生检验与检疫系, 四川成都 610041;
2. 四川省疾病预防控制中心, 四川成都 610041

收稿日期：2017-05-27

基金项目：四川大学国际合作评估吸烟者牙种植体存活率的前瞻性、非随机化临床研究资助项目

通讯联系人：邹晓莉, E-mail:zouxl_1113@163.com

摘要：建立了测定人尿液中尼古丁和可替宁含量的亲水作用色谱-串联质谱（HILIC-MS/MS）方法。尿样加入尼古丁-d₄和可替宁-d₃同位素内标后，用水稀释10倍，经过滤后的滤液由超高效液相色谱-串联质谱（UPLC-MS/MS）进行分离分析。采用ACQUITY UPLC^® BEH HILIC色谱柱（50 mm×3.0 mm，1.7 μ m），以甲醇和体积分数为0.1%的氨水为流动相，流速为0.2 mL/min，在电喷雾电离源正离子模式下测定尿液中尼古丁和可替宁的含量，用标准曲线法定量。尼古丁和可替宁在1.0~1000 μ g/L范围内线性关系良好，相关系数分别为0.9949和0.9958；检出限分别为0.082 μ g/L和0.077 μ g/L；定量限分别为0.27 μ g/L和0.26 μ g/L；加标回收率分别为90.4%~103.5%和93.0%~104.6%；相对标准偏差分别为4.80%~6.21%和4.22%~7.15%。应用所建立的方法测定了200份尿样，结果表明，吸烟人群尿中尼古丁含量为26.68~854.30 μ g/L，可替宁含量为36.66~1191.18 μ g/L（n=86，M_nicotine=76.00 μ g/L，M_cotinine=83.52 μ g/L，M为中位数）；非吸烟人群尿中尼古丁含量为5.08~69.66 μ g/L，可替宁含量为3.16~28.21 μ g/L（n=114，M_nicotine=7.53 μ g/L，M_cotinine=3.79 μ g/L）。该方法快速灵敏，操作简单，适用于尿样中尼古丁和可替宁的批量测定，能满足烟草暴露评价的需要。

关键词：亲水作用色谱-串联质谱同位素稀释尼古丁可替宁尿液

Determination of nicotine and cotinine in urine by hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry

LI Mingxin¹, WANG Qian¹, ZHU Jing¹, REN Lin², YONG Li², ZOU Xiaoli¹

1. Department of Laboratory Techonology and Science of Public Health, West China School of Public Health, Sichuan University, Chengdu 610041, China;
2. Center for Disease Control and Prevention of Sichuan Province, Chengdu 610041, China

Foundation item: Sichuan University International Cooperation Prospective, Non-Randomized Clinical Study to Evaluate Dental Implants Survival in a Smokers Population

Abstract: The analytical method of nicotine and cotinine in human urine with hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) was established. After the urine sample containing nicotine-d₄ and cotinine-d₃ isotope internal standards being diluted with water, the filtrate was introduced into ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) for analysis. Separation was performed on an ACQUITY UPLC^® BEH HILIC column (50 mm×3.0 mm, 1.7 μ m), in which methanol and 0.1% (v/v) ammonia were used as the mobile phases with isocratic elution at 0.2 mL/min of flow rate. Positive ion scan mode was used for mass spectrometry measurement and calibration curves were plotted for quantification determination. A good linearity could be obtained in the range of 1.0-1000 μ g/L for nicotine and cotinine with the linear coefficients of 0.9949 and 0.9958, respectively. The limits of detection of nicotine and cotinine were 0.082 μ g/L and 0.077 μ g/L, and the limits of quantification were 0.27 μ g/L and 0.26 μ g/L, respectively. The recoveries of the spiked urine samples were 90.4%-103.5% and 93.0%-104.6%, and the relative standard deviations (RSDs) were 4.80%-6.21% and 4.22%-7.15% for nicotine and cotinine respectively. The established method was applied to the analyis of 200 urine samples. Based on the investigation information of the urine of the smoking people, the nicotine contents were 26.68-854.30 μ g/L, and the cotinine contents were 36.66-1191.18 μ g/L (n=86, M_nicotine=76.00 μ g/L, M_cotinine=83.52 μ g/L, M:median); of the nonsmoking people, the nicotine contents were 5.08-69.66 μ g/L, and the cotinine contents were 3.16-28.21 μ g/L (n=114, M_nicotine=7.53 μ g/L, M_cotinine=3.79 μ g/L). The method is simple, sensitive and rapid. It is suitable for batch analysis of nicotine and cotinine in urine, and it can meet the requirement of evaluating the human tobacco exposure.

Key words: hydrophilic interaction chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) isotope dilution nicotine cotinine urine

吸烟引起的危害是当今世界最严重的公共卫生问题之一, 吸入香烟烟雾可导致癌症、哮喘、婴幼儿猝死综合征、心脑血管病、急性呼吸道感染等多种疾病^[1]。科学测量烟草暴露是研究烟草暴露对健康危害的基础。尼古丁(nicotine)及其代谢物可替宁(cotinine)是广泛使用的评价环境烟草暴露(ETS)的生物标志, 用于估计人体烟草暴露的剂量和程度^[2]。测定尼古丁和可替宁常用的生物材料有尿液、血液、唾液和头发, 前3者中尼古丁和可替宁的含量能够反映短时间的烟草暴露情况^[3], 头发中尼古丁的含量可以反映较长时间的烟草暴露情况^[4]。尿液因属于无创伤性采样, 且由于肾脏有浓缩作用, 因此尿液中尼古丁和可替宁的浓度相对较高, 易于检测, 是最为常用的生物材料样品^[5]。

色谱是测定尼古丁和可替宁含量的常用方法, 高效液相色谱法^[6]、气相色谱法^[7]、气相色谱-质谱法^[8]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法^{[9, 10]}以及高效毛细管电泳(HPCE)法^[11]等均有应用。其中, LC-MS/MS结合了色谱的高分离效能和串联质谱的强定性能力, 具有更高的选择性和灵敏度, 往往仅需简单的样品前处理即可测定复杂基质中的痕量有机物^{[12, 13]}。亲水作用色谱(HILIC)采用强亲水性的极性固定相, 在极性化合物的分离分析中取得了较好的效果^{[14, 15]}。尼古丁和可替宁具有较强的极性和亲水性, 适合选用亲水作用色谱。因此, 本文采用简单的稀释法进行样品前处理, 以同位素内标校正基质效应, 建立了HILIC-MS/MS法测定尿液中尼古丁及其代谢产物可替宁的方法, 在实际分析中取得了较为满意的结果。国内暂未见关于HILIC-MS/MS测定尼古丁和可替宁的报道, 国外有少量报道^[15-17], 与之相比, 本法快速简便, 采用直接稀释的前处理方法, 降低了基质效应, 并以同位素内标校正, 达到了较高的灵敏度, 能满足批量分析和人群烟草暴露评价的需要。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Nexera X2 LC-30AD超高效液相色谱(UPLC)仪(日本岛津公司); TSQ Vantage串联质谱仪(美国赛默飞世尔公司); ACQUITY UPLC^® BEH HILIC色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.7μm, 美国沃特世公司); ULUP-Ⅰ微量分析型超纯水器(中国优普公司)。

甲醇、乙腈(色谱纯, 美国赛默飞世尔公司); 氨水(优级纯, 成都科龙化工试剂厂); 硫酸氢钠(分析纯, 天津市福晨化学试剂厂)。标准品:尼古丁(纯度≥99.7%)和可替宁(纯度≥98%)购于美国Sigma-Aldrich公司, 内标尼古丁-d₄标准溶液(100 mg/L)和可替宁-d₃标准溶液(100 mg/L)购于美国CERILLIAN公司。实验用水均为超纯水(18.2 MΩ·cm)。

1.2 溶液的配制

尼古丁、可替宁标准储备液:分别准确称取10 mg尼古丁和可替宁标准品, 用乙腈溶解并定容至10 mL, 配制成浓度为1 g/L的标准储备液。于-80 ℃保存。

混合标准应用液:取上述两种标准储备液, 用超纯水稀释至5.0 mg/L。于-20 ℃保存。

混合内标标准应用液:取两种内标标准溶液, 用超纯水稀释至5.0 mg/L, 即为混合内标应用液。于-20 ℃保存。

1.3 尿样的采集与保存

分别采集主动吸烟人群和不吸烟人群的尿样。将受试者的尿样收集在已编号的10 mL尖底塑料离心管中, 按照v(尿样):m(硫酸氢钠)=100:1(mL/g)的比例加入硫酸氢钠(防止尿液腐败, 同时保证尿液中尼古丁及可替宁的稳定性), 振荡, 使硫酸氢钠溶解。于-80 ℃保存。

1.4 样品处理

取0.1 mL尿样, 加入20 μL 5.0 mg/L的混合内标应用液, 加水稀释至1 mL, 振荡混匀后, 过0.22μm聚醚砜微孔滤膜, 滤液进UPLC-MS/MS测定。

1.5 色谱和质谱条件

1.5.1 色谱条件

色谱柱:ACQUITY UPLC^® BEH HILIC色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.7μm); 柱温:40 ℃; 流动相:A相为甲醇, B相为体积分数(下同)为0.1%的氨水, A:B=60:40(v/v); 流速:0.2 mL/min; 进样量:5.0 μL。

1.5.2 质谱条件

电离方式:ESI正离子模式; 毛细管柱温度:350 ℃; 雾化器温度:350 ℃; 鞘气流速:35 Arb; 辅助气流速:10 Arb; 吹扫气流速:2.0 Arb; 喷针电压:3 500 V。

1.6 标准曲线的绘制

用超纯水将尼古丁、可替宁混合标准应用液稀释为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0、300.0、500.0、800.0和1 000.0 μg/L的系列混合标准溶液。分别取0.1 mL系列标准溶液, 加入20 μL 5.0 mg/L混合内标应用液, 加水稀释至1 mL, 经0.22μm聚醚砜微孔滤膜后, 进UPLC-MS/MS分析, 以待测物的质量浓度(μg/L)为横坐标、待测物和内标峰的面积比值为纵坐标绘制标准曲线。

2 结果与讨论

2.1 色谱和质谱条件的优化

2.1.1 色谱条件的优化

比较了反相色谱和亲水作用色谱模式的分离效果。反相色谱采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.8μm), 亲水作用色谱采用ACQUITY UPLC^® BEH HILIC色谱柱(50 mm×3.0 mm, 1.7μm)。结果表明, 两种模式以甲醇-氨水作为流动相时, 均能取得较好的分离效能, 但反相色谱须使用梯度洗脱才能将样品中不同极性的物质有效分离, 分析时间为15 min。图 1为尼古丁和可替宁的结构式，二者均含有2个杂氮环, 具有较强的极性, 在亲水色谱柱中能得到较好的保留, 采用合适的等度洗脱即能较好地避免样品基质效应的干扰, 10 min内可完成一次分析。因此选择亲水作用色谱进行尼古丁和可替宁的分离分析。

图 1 尼古丁和可替宁的结构式 Fig. 1 Structures of nicotine and cotinine

比较了甲醇-0.1%氨水、甲醇-0.1%甲酸、甲醇-0.1%甲酸(含2 mmol/L乙酸铵)3种流动相对目标化合物分析的影响。结果表明, 尼古丁和可替宁在3种流动相中均能被分离。但当甲醇-0.1%甲酸和甲醇-0.1%甲酸(含2 mmol/L乙酸铵)为流动相时, 有拖尾现象; 而当甲醇-0.1%氨水为流动相时, 峰形尖锐, 且响应信号最强(灵敏度比其他两种流动相高约0.5倍)。因此选择甲醇-0.1%氨水作为流动相。

比较了甲醇-0.1%氨水流动相中不同甲醇含量对分离效果的影响。随着甲醇含量增加, 尼古丁和可替宁的保留时间延长, 分离更好。当甲醇体积分数从40%增至60%时, 尼古丁和可替宁的分离度从0.95提高至1.52。选择流动相中的甲醇体积分数为60%。在此流动相下, 10 min内可完成一次样品分析, 样品基质效应能得到有效的控制。在优化的条件下, 尼古丁、可替宁和相应内标标准溶液的选择离子流色谱图见图 2。

图 2 标准溶液的选择离子流色谱图 Fig. 2 Selective ion chromatograms of standard solutions

2.1.2 质谱条件的优化

尼古丁和可替宁为生物碱, 因此选择正离子模式。首先对1 mg/L的尼古丁和可替宁的标准溶液进行一级质谱扫描, 确定其母离子; 然后改变碰撞能量, 对每个母离子进行碎片扫描, 得到碎片离子信息, 从中选出信号较强、干扰较小的碎片离子。同时自动优化S-lens的参数。优化后的化合物质谱采集参数见表 1。

表 1 目标化合物和同位素内标的质谱采集参数 Table 1 Mass spectrometric parameters for target com-pounds and isotope internal standards

2.2 硫酸氢钠在样品保存中的作用

参照文献^[18], 在尿样保存时加入了硫酸氢钠, 并验证了硫酸氢钠的作用。混合20份尿样, 平行分装为16份, 其中8份按照v(尿样):m(硫酸氢钠)=100:1(mL/g)的比例加入硫酸氢钠, 另外8份不加硫酸氢钠。分别将尿样保存于-80℃, 隔天取出测定, 测定结果均与第0天的结果比较。结果表明, 尼古丁较稳定, 即使不加硫酸氢钠, 在-80 ℃也能稳定保存2周(相对误差为2.1%~4.6%); 可替宁不稳定, 若不加硫酸氢钠, 在-80 ℃保存1天即可降解30%, 若加入硫酸氢钠, 在2周内可稳定保存(相对误差为3.8%~6.2%)。

当加入过多硫酸氢钠时, 会造成较严重的基质效应, 使灵敏度大大下降, 因此在0.1~2.0 g范围内考察了硫酸氢钠的加入量。在100 mL尿样中, 硫酸氢钠加入量超过0.8 g, 即能保证可替宁的稳定性; 但当加入量超过1.5 g后, 基质效应过大, 一些样品的可替宁甚至不出峰。因此, 选择100 mL尿样中加入1 g硫酸氢钠。硫酸氢钠浓度对基质效应(分别采用混合尿液和水进行标准曲线的配制, 以两条曲线的斜率比值考察基质效应, 比值越低, 表示基质效应越大)的影响见图 3。

图 3 硫酸氢钠对基质效应的影响 Fig. 3 Effects of sodium bisulfate on matrix effect R_u/w: ratio of slope of standard curve prepared with urine to slope of standard curve prepared with water.

2.3 样品前处理条件的选择

样品前处理采用直接稀释法, 首先对稀释剂的种类进行了选择。分别用甲醇、水、甲醇-水(1:1, v/v)稀释样品, 稀释倍数均为10倍, 检测使用不同稀释剂时样品的出峰情况。结果见图 4, 甲醇、甲醇-水(1:1, v/v)稀释的样品中尼古丁和可替宁的峰形差, 甚至会发生峰分裂; 水稀释的样品能得到良好的峰形和回收率(回收率为90%~105%)。因此, 选择用水来稀释样品。同时, 用这3种溶剂稀释含有内标的混合标准溶液(尼古丁、可替宁混合标准溶液质量浓度为100 μg/L, 内标溶液质量浓度为100 μg/L), 尼古丁、可替宁及其内标在3种溶剂中均能得到良好的峰形。试验中观察到, 当甲醇加入到含有保存剂硫酸氢钠的尿液中时, 样品变浑浊。基于这些现象, 推测甲醇稀释样品峰形变差可能是因为甲醇与加有硫酸氢钠的待测尿液不互溶造成的。

图 4 不同溶剂稀释的尿液样品色谱图 Fig. 4 Chromatograms of urine samples diluted with different solvents

因样品中尼古丁和可替宁的含量高低不一, 在考察稀释倍数时要兼顾灵敏度和样品基质效应, 最终选择了稀释10倍进行样品处理。在此稀释倍数下, 离子抑制效应较弱, 灵敏度能满足样品的分析。分别采用混合尿液和水进行标准溶液的配制并绘制标准曲线, 以两条曲线的斜率比值考察基质效应。稀释10倍时, 尼古丁的两条曲线斜率分别为56 823(尿液配制)和74 630(水配制), 两者比值为0.76;可替宁的标准曲线斜率分别为58 444(尿液配制)和77 503(水配制), 两者比值为0.75。结合同位素内标校正, 尼古丁的标准曲线斜率分别为4.356(尿液配制)和4.597(水配制), 两者比值为0.95, 说明同位素内标进一步校正了基质效应对测定的影响。

2.4 方法学指标

2.4.1 线性范围、检出限和精密度

按照1.6节步骤绘制标准曲线, 结果表明, 尼古丁和可替宁在1.0~1 000 μg/L范围内线性关系良好, 相关系数分别为0.994 9和0.995 8。以3倍信噪比计算检出限, 尼古丁和可替宁的检出限分别为0.082和0.077 μg/L; 以10倍信噪比计算定量限, 尼古丁和可替宁的定量限分别为0.27和0.26 μg/L。取1.0 μg/L的标准溶液, 分别重复进样6次, 并重复6天, 以评价日内和日间精密度, 尼古丁和可替宁的日内RSD分别为1.95%和1.01%, 日间RSD分别为8.20%和10.5%。

2.4.2 加标回收试验

取20份尿液样本混合, 按1.4节所述方法进行样品处理后测定本底值, 同时进行加标回收试验, 结果见表 2。尼古丁和可替宁的平均加标回收率分别为90.4%~103.5%和93.0%~104.6%, 测定的相对标准偏差分别为4.80%~6.21%和4.22%~7.15%。

表 2 尼古丁和可替宁的加标回收率(n=5) Table 2 Spiked recoveries of nicotine and cotinine (n=5)

2.5 方法的应用

应用所建立的方法测定200份尿样, 测定样品浓度超过标准曲线线性范围时, 将样液稀释适当倍数后测定。结合调研信息, 吸烟人群尿中尼古丁含量为26.68~854.30μg/L, 可替宁含量为36.66~1 191.18 μg/L(n=86, M_nicotine=76.00 μg/L, M_cotinine=83.52 μg/L, M:中位数); 非吸烟人群尿中尼古丁含量为5.08~69.66 μg/L, 可替宁为3.16~28.21 μg/L(n=114, M_nicotine=7.53 μg/L, M_cotinine=3.79 μg/L)。图 5为吸烟人群尿样色谱图。

图 5 吸烟人群尿样色谱图 Fig. 5 Chromatograms of urine of smoking people

3 结论

本文建立了HILIC-MS/MS测定尿液中尼古丁及其代谢产物可替宁的分析方法, 从样品处理、保存、测定等多方面进行了系统的考察和优化, 本方法简便快速, 能满足批量分析人群烟草暴露的需要。

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