场流分离(field-flow fractionation, FFF)是一项基于分析物流体动力学尺寸、质量、密度、体积等性质的差异进行分离的技术。最早由Giddings[1]在1966年提出, 该方法可用于分离、提纯和收集流体中的悬浮物颗粒进行无损分析, 广泛用于制药、材料科学、高分子科学及生物领域。本文介绍了非对称流场流分离(asymmetrical flow field-flow fractionation, AF4) 技术的基本原理以及近年来在分析领域的重要进展。
场流分离的分离通道中无固定相填料, 不同尺寸的样品在载液的层流作用下, 分布在液流抛物线剖面不同高度的位置上, 靠近积累壁的颗粒更晚洗脱, 因此得到不同尺寸分析物不同的保留时间。在场流分离家族中, 其分离通道的常规尺寸一般为20~50 cm长, 2~3 cm宽, 0.01~0.05 cm厚。载液从入口处泵入分离通道, 液流可将分析物推向出口处, 在通道内形成抛物线形剖面(牛顿层流), 同时垂直于载液液流方向施加的外力场将样品颗粒推向积累壁, 排布在载液液流剖面的不同位置。根据外力场的不同, 场流分离可分为流场流分离、重力场流分离、沉降场流分离、热力场流分离和电离场流分离等。其中重力场流分离属于沉降场流分离的分支, 同时也是场流分离家族中较为常用的一个分支[2, 3]。每一亚类都具有不同的分离机制, 分离范围也有所差异。场流分离系统与其他分离分析技术的应用范围对比见图 1。
流场流分离系统是场流分离家族中应用较为普遍的一支, 其外力场为垂直于液流方向施加的流体场。根据其构造可分为对称流场流分离和AF4。此外还有一些其他变体, 如中空纤维流场流分离系统(hollow fiber flow field-flow fractionation, HF5), 其分离通道为中空纤维, 交叉流在中空纤维内部径向辐射形成外力场, 与通道载液液流方向垂直。对称流场流分离系统的通道上下壁均为多孔熔块组成的渗透性壁(半透性多孔熔块)。样品进入分离通道后, 在交叉流作用下向积累壁方向分布, 在样品松弛期间通道纵向流停止, 交叉流泵向通道内泵入一个通道体积量的交叉流。在此期间, 样品在交叉流力场和扩散力的双重作用下移动到平衡位置, 根据流体动力学尺寸的不同, 分布在通道交叉流截面/厚度面的不同高度位置上, 即纵向流剖面的不同流速层上, 随后在纵向流载液的推动下完成分离。可用于分离1 nm到50 μm直径范围内的大分子、胶体和微粒。AF4系统的分离通道由非渗透性的消耗壁(上层壁)和渗透性的积累壁(下层壁)构成, 构造简单且分离效率高, 成为应用最广泛的场流分离技术。
AF4系统由Wahlund和Giddings[4]在1987年首次提出, 在接下来的多年间不断被优化。AF4系统的通道上层壁为非渗透性的透明玻璃板, 可以直观反映有色样品在通道中的分离行为; 下层和对称流场流分离系统下层设置相同, 为可渗透性多孔材料。在AF4系统中, 进入通道的载液液流分成两部分:一部分沿着通道自入口向出口方向流动, 另一部分垂直于主体载液的液流, 在非对称渗透壁的作用下向积累壁方向流动, 该液流为交叉流。其分离范围一般是从1 nm到50 μm左右, 主要取决于仪器本身。分离下限取决于通道中所使用的聚酯膜的截止相对分子质量, 目前最常用的规格和材料是截止相对分子质量为10 kDa的再生纤维素膜。分离上限取决于通道厚度, 理论上分析物尺寸不应超过通道厚度的20%[5]。
在AF4系统中, 松弛过程也称为聚焦-松弛(focusing-relaxation)过程。从入口处和交叉流入口处进入通道的载液会在通道入口附近进行聚焦-松弛, 这一位置也称为聚焦点(focusing point), 在此期间, 样品停止迁移以达到平衡过程[6]。从原理上看, AF4系统中分析物的保留时间取决于扩散通量, 在分离大分子/颗粒时根据其扩散系数的不同即流体动力学尺寸差异进行分离。进样后, 样品在外加力场的作用下向通道底部即积累壁方向均匀扩散开, 随后会在积累壁形成指数浓度分布[7]。因为积累壁可以看成是颗粒继续向下扩散的屏障, 在积累壁形成指数浓度分布的颗粒会趋向于从高浓度区域向低浓度区域扩散, 这种扩散趋向与外加力场对抗平衡, 达到流体动力学稳定态, 该期间即聚焦-松弛过程。
首先定义一个无量纲保留参数λ作为样品与通道壁平均距离l和通道厚度w的比值, 在流场流分离系统中, λ与样品颗粒的扩散系数D、通道死体积V0、交叉流流速Vc以及通道厚度w之间的关系见公式(1):
从公式(1) 中可以推出, 在给定分离通道条件下, 不同颗粒区域的分离完全依赖于颗粒扩散系数D的差异。分布在载液抛物线剖面上的颗粒根据其与积累壁距离l的不同, 迁移速度也有所差异。较小的颗粒在聚焦-松弛阶段平衡在通道中部, 此处液流速度快于通道两侧; 较大的颗粒平衡在距离积累壁相对较近的位置, 因此较大的颗粒会晚于较小的颗粒被洗脱出来(见图 2)。
保留比R与保留参数λ的关系式见公式(2):
其中t0为死时间, tR为保留时间, 根据Stokes公式[8]对扩散系数D和流体动力学直径dH关系的表述, 在流场流分离系统中结合公式(1) 和公式(2) 可以推导出公式(3):
其中kT为热能, η为载液黏度[6], π为圆周率。
在非对称流场流中, 分析物的保留模式一般分为两种：常规(Brownian)模式和空间/超层(steric/hyperlayer)模式。不同的分离模式主要由分析物尺寸的差异决定。上述公式推导过程均为常规模式下的分离, 这种分离由Brownian运动主导, 分析物在外加力场和分析物的扩散作用下达到不同高度的平衡位置, 较小分析物位于中部, 早于大颗粒洗脱。当分析物颗粒尺寸超出一定限度(约1 μm)时, 公式(3) 中的流体动力学直径dH将大于颗粒平衡位置与积累壁之间的距离l, 此时Brownian运动可忽略不计, 外加力场将颗粒推向积累壁, 洗脱顺序与正常模式相反, 较大颗粒先洗脱出来, 这种模式就是空间/超层模式。
在色谱分离技术中, 分离效率或带增宽主要用塔板高度H或理论塔板数N来表示。在场流分离中主要影响因素包括不平衡效应Hn、轴向扩散HD、仪器本身和操作影响Hi以及样品多分散性(polydispersity)Hp, 因此, 根据文献推导[7], 场流分离中分离效率可表示如公式(4):
其中＜V＞是通道中载液的平均流速, χ是无量纲的不平衡参数。公式(4) 的第1部分表示垂直扩散的影响, 由于场流分离中大部分分析物都有较大相对分子质量或尺寸, 其扩散系数相对较小, 所以第一部分的垂直扩散影响一般可以忽略不计。第2部分表示不平衡效应的影响, 不平衡参数χ是分离参数λ的复杂函数, 当λ足够小时, χ可以用估计值χ=24λ3来表示。第3部分是仪器本身的影响, 包括进样、检测、系统死体积、液流不稳定性的影响, 对于组装良好、操作稳定的场流设备来说, 第3部分的影响也非常小。第4部分表示样品的多分散性对塔板高度的影响, 由于场流分离方法的高选择性, 对于颗粒尺寸分布范围较广的样品, 其洗脱峰通常较宽。
经过多年的发展及优化, AF4系统成为场流分离家族中应用最广的分支, 基本上取代了对称流场流分离系统, 目前广泛应用于生物、工业、食品和农产品、药学、生物技术和纳米技术领域。除传统型AF4系统外, 还发展出熔块入口型非对称流场流分离系统(frit inlet asymmetrical flow field-flow fractionation, FI-AF4) 和小型化/芯片化非对称流场流分离系统(miniaturized asymmetrical flow field-flow fractionation, mAF4/chip-type asymmetrical flow field-flow fractionation, cAF4)。
FI-AF4在传统的AF4通道上壁靠近入口处嵌入一个可渗透性多孔熔块, 来自多孔熔块的液流可以均匀分散地将样品推向积累壁进行动力学平衡, 而在传统型非对称流场流装置中需要将迁移流停止一段时间用于完成聚焦-松弛过程, 通过多孔熔块的装置, 分离过程中无需停止迁移流[9]。
mAF4/cAF4是将传统型的非对称流场流通道尺寸缩小化[10], 既可以缩短分离时间, 又可以节约样品, 减少载液消耗量, 并且在联用纳流液相色谱-电喷雾离子源-串联质谱(nanoflow liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry, nLC-ESI-MS/MS)[11]时具有无需分流器分流、可在线脱盐等优势。
纳米颗粒(nanoparticles)为纳米量级的微观颗粒, 定义为至少在一个维度上小于100 nm的颗粒, 在工业和生物制药等领域中具有重要作用, 其颗粒尺寸分布信息成为评价纳米颗粒的重要指标。常规表征纳米颗粒粒径的技术包括显微镜和颗粒计数法等方法, 但这些方法较为费时; 常用的光学方法如动态光散射(dynamic light scattering, DLS)和激光衍射(laser diffraction, LD), 虽然可以在短时间内进行分析, 但是这些方法只能用于能够散射可探测光且形态均匀的颗粒。因此引入AF4联用合适的检测器进行纳米颗粒的分离和粒径表征[12]。
生物纳米颗粒(nano-sized bioparticles)的基础研究和应用呈高速发展态势, 其中整合生物纳米颗粒的基本信息是研究其在生物体内吸收分布代谢排泄情况的基础, 然而目前评估生物纳米颗粒尺寸、尺寸分布、表面电荷、颗粒间相互作用等性质的分析方法仍存在局限性, 对于药物转运纳米载体、病毒样纳米颗粒等生物纳米颗粒, 使用AF4进行预分离已经成为一种可靠的分析手段。
Setälä等[13]使用Langmiur磷脂单层模型和AF4研究磷脂转运蛋白(phospholipid transfer protein, PLTP)在脂质囊泡和高密度脂蛋白(HDL)之间转运的界面性质。Chen等[14]应用AF4-多角度激光散射(multi-angle light scatter detector, MALS)分析系统比较不同溶液环境中病毒样颗粒的稳定性。研究中使用的两种商用病毒样颗粒模型分别为中国仓鼠卵巢细胞表达的CHO-HBsAg(4727 kDa, 29.4 nm)和多形态Hansenula表达的Hans-HBsAg (3039 kDa, 22.8 nm), 研究考察了不同处置条件下两种颗粒的分子量和颗粒尺寸变化及抗原性损失情况。
非生物纳米颗粒(如用于服装制造、医疗和精密仪器等领域的工程纳米颗粒(engineered nanoparticles, ENPs)、用做食品添加剂的二氧化硅纳米颗粒等)在多领域应用也日益广泛。对这些纳米颗粒的尺寸分离和表征是进行质量控制和污染检测的重要一环。
ENPs中具有代表性的银纳米粒(silver nanoparticles, AgNPs)和金纳米粒(gold nanoparticles, AuNPs)应用最为广泛。其中AgNPs主要用于服装制造业和医疗器械产业, AuNPs则主要用于医疗和精密仪器领域。虽然目前还没有AuNPs造成环境污染的报道, 但是AgNPs的排放会在植物和水生生物体内造成蓄积作用, 且缺乏合适的分析方法测定环境介质中的金属纳米颗粒。为了进行一系列后续研究, 需要建立一种浓度响应关系, 流场流分离技术便是该领域中最有发展前景的分离技术之一。Meisterjahn等[15]使用AF4在线联用检测系统分离定量复杂基质中的ENPs, 使用AgNPs和AuNPs作为模型分析物考察分离系统的分离效率、保留时间、回收率等参数, 并对分离条件进行优化。此外, Shin等[16]将AF4应用于纳米探针领域用以检测保护性抗原, 使用AF4离线联用表面增强拉曼光散射(surface enhancement of Raman scattering, SERS)进行表征。
胶体磷是自然水域中磷的重要表现形式之一, 但由于其浓度过低而难以测定。Baken等[17]采用AF4联用高分辨率电感耦合等离子体质谱(inductively coupled plasma mass spectrometry, ICP-MS)表征自然水域中的低浓度胶体磷, 研究发现样品中P与含Fe胶体密切相关。此外Barahona等[18]采用多种方法(包括DLS、MALS、AF4、ICP-MS、透射电镜(transmission electron microscope, TEM)等)分析食品级合成无定型二氧化硅(amorphous silica nanoparticles, SAS)纳米颗粒(食品添加剂), 按照合理详细的分离检测顺序对11种不同的食品级SAS样品中的纳米颗粒进行检测和表征。
生物大分子(biomacromolecules)的分离及表征一直是生物技术领域的研究热点。由于生物大分子的结构复杂性及生物样品的多样性, 分析方法不仅需要测定生物大分子的准确构型, 而且需要在分析过程中保持其天然构象、超分子结构且避免与分离介质发生相互作用。AF4由于其宽分离范围、温和的分离环境等优点, 在生物大分子领域受到越来越多的关注。
在蛋白质组学研究中, 温和高效的预分离技术是后续研究的关键基础, AF4在线/离线联用MALS检测器和/或不同类型的质谱已经成为该领域较为成熟的预分离技术, 得到了广泛使用。
朱尘琪等[19]使用自组装AF4仪器对蛋白质的分离条件进行优化。Yohannes等[20]开发AF4-RPLC分离系统用于综合二维分析生物大分子, 该系统重复性好, 可用于定量表征鸡蛋清蛋白质。Kang等[21]开发小型化熔块入口型非对称流场流(miniaturized frit inlet asymmetrical flow field-flow fractionation, mFI-AF4) 分离系统并使用标准蛋白质进行测试, 该系统降低了样品进样量和载液消耗量, 作者考察了改变进样口和通道入口间连接套管的内径评估端口效应对塔板高度的影响。该系统可用于分离蛋白质标准品、硫酸聚苯乙烯、单链DNA、复制蛋白A-单链DNA复合物。
Kim等[22]于2009年开发等新的电子聚焦非对称流场流(isoelectric focusing and asymmetrical flow field-flow fractionation, IEF-AF4) 联用系统, 用于二维分离蛋白质(根据蛋白质等电点和流体动力学直径的差异), 可将分离时长控制在30 min内, 相比于耗时3 h的毛细管等电子聚焦中空纤维流场流(capillary isoelectric focusing-hollow fiber FlFFF, CIEF-HF5) 和36 h的二维聚丙烯酰胺凝胶电泳(2D-polyacryamide gel electrophoresis, 2D-PAGE), 该系统大大提高了分离速度。该团队于2012年[23]使用IEF-AF4分离前列腺癌细胞裂解物中的磷酸化蛋白质, 测定特定磷酸化蛋白质(前列腺癌生物标记物)的相对丰度。收集IEF-AF4分离组分进行纳流液相色谱-串联质谱(nLC-MS/MS)分析, 测定磷酸化蛋白质的不同亚型及磷酸化肽的相对比值。由于基于亲和性的富集方法都需要移除未磷酸化修饰的肽, 而使用IEF-AF4则可以在蛋白质水平上分离完整的磷酸化蛋白质, 无须移除未磷酸化修饰的肽, 也无须进行同位素标记即可定量分析。
脂蛋白(lipoprotein)是血液中负责运输脂质和胆固醇的球形复合物, 由甘油三酯和胆固醇酯组成的内核外部包裹有磷脂、游离胆固醇、蛋白质等组成的外壳。一般根据脂蛋白的水合密度差异将其分为HDL、低密度脂蛋白(LDL)和极低密度脂蛋白(VLDL)。根据这种分类标准定义的脂蛋白亚类属于非均相混合物, 其中含有不同组成、不同尺寸的脂蛋白。人体中的脂蛋白功能与细胞结构、细胞内信号转导、细胞增殖和凋亡有着密切联系。脂蛋白的浓度、尺寸改变和性状分布与冠状动脉疾病发病风险密切相关, 其脂质代谢的变化通常会触发一些代谢性疾病的发病机制, 尤其是高密度脂蛋白水平的降低和低密度脂蛋白水平的升高且伴随低密度脂蛋白颗粒尺寸的减小与冠心病等心血管疾病的发生发展密切相关。因此在临床诊断及预后领域, 脂蛋白表征和脂质分析成为近年来的研究热点。
Park等[24]使用FI-AF4分离并选择性测定冠状动脉疾病患者血清中的脂蛋白颗粒, 该研究证实FI-AF4是测定LDL轮廓的有力分析工具。Rambaldi等[25]率先将流场流分离技术与MALS结合起来, 用于表征人血浆中脂蛋白尺寸和形状。在对LDL尺寸表征的方法[24]中, PAGE耗时且不适合大量进样; 高效凝胶过滤色谱和PAGE都需要合适的标准品, 且都无法给出准确的构象信息, 而F4-MALS则成为有力的分析方法。
随着高精密质谱技术的发展, 人们基于AF4分离技术探究不同的联用技术对脂蛋白的研究及其用于临床实践可行性的效果。Rashid等[26]将AF4与GC-MS结合, 测定血清脂蛋白中的胆固醇和甘油三酯, 结果与AF4结合双向酶反应检测系统所得结果具有良好的一致性, 总胆固醇和总甘油三酯浓度值与医院临床实践中所用的标准酶法测定结果一致。Byeon等[27]采用复用式中空纤维流场流(multiplexed hollow fiber flow field-flow fractionation, MxHF5) 离线联用nLC-ESI-MS/MS发现并鉴定冠状动脉疾病患者脂蛋白(HDL和LDL)潜在的候选磷脂生物标记物。该方法提供了冠状动脉疾病患者脂蛋白在分子水平上变化的重要信息, 可用于诊断和跟踪治疗。
除了联用质谱提高结构鉴定的精密度以外, Lee等[28]在AF4分离前设置一个保护通道除去相对分子质量较小的血清蛋白质, 并结合荧光检测提高脂蛋白分离效果, 且荧光检测可大大减少所需血清样品的进样量。近来, Dou等[29]使用AF4联用紫外检测器(UVD)、多角度光散射检测器和荧光检测器(FD)研究鸡蛋黄匀浆中LDL的聚集行为。
多糖(polysaccharide)在发酵工业及生物技术等领域中应用广泛, 尤其是淀粉颗粒溶解得到的直链淀粉和支链淀粉应用范围更广。在这些应用中, 多糖的性质主要与其粒径、相对分子质量以及支链淀粉的分支度有关。由于直链淀粉和支链淀粉的相对分子质量范围很大, 因此对其颗粒尺寸分布(particle size distribution, PSD)的测定尤为重要, 也因此成为该领域的研究热点。而AF4-MALS在多糖尺寸测定和分子量表征方面表现出不可替代的优势, 不仅可以得到流体动力学半径、回转半径、相对分子质量, 还能得到分子构型和分支度相关信息[30]。AF4-MALS也适用于分析阳离子淀粉衍生和疏水改性的淀粉[31], 表现出良好的分析性能。
此外, AF4作为一种温和的分离技术, 可用于研究大麦中葡萄糖的溶解性能, 分析其微小的改变[32], 还可用于分析比较小麦淀粉和大麦淀粉的抗糖尿病活性[33]。
聚合物(polymer)的相对分子质量很大, 具有多分散性, 其分子结构基本上分为两种:线型结构和体型结构。前者是聚合物分子中的原子以共价键互相连结成卷曲状态的分子链, 后者的特征是分子链之间还有很多共价键交联起来, 形成三维空间网络结构。两种不同的结构在性能上具有很大差异, 在聚合物新材料合成技术飞速发展、聚合物应用范围日益广泛的今天, 亟须具有更高分辨率、更广应用范围的分析方法表征其相对分子质量、分子结构、表面性质等重要信息。AF4的引入为聚合物的分析带来了新的突破与思路, 近年来的研究也在该领域发展了很多成熟的分离条件和分析路径。
Ahn等[34]在考察AF4通道几何形状对分离效率的影响时, 使用聚苯乙烯乳胶颗粒标准品来考察3种形状(长方形、梯形、指数形)通道的分离效率。Woo等[35]采用FI-AF4-MALS联用示差折光检测器(RID)表征超高相对分子质量阳离子聚丙烯酰胺, 进行尺寸分离、相对分子质量测定、构型测定。
John等[36]通过AF4-MALS同时测定单甲氧基聚乙二醇左旋门冬酰胺酶(PEG-ASNASE)和聚乙二醇(PEG)。PEG-ASNASE是左旋门冬酰胺酶的聚乙二醇化形式, 二者均可用于缓解极性淋巴细胞白血病(ALL)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)[37]。此外, 在化妆品和涂料中[38], 不同的乳剂混有无机物添加剂, 例如二氧化钛, 可用AF4分析这些混合物的保留行为及颗粒间相互作用; AF4在线联用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)可用于无机添加物的元素形态表征和鉴定。
UVD的原理是Lambert-Beer定律, 即当一束单色光透过样品池时, 若载液不吸收光, 则吸光度(A)与吸光组分的浓度(C)和样品池的光径长度(L)成正比。UVD包括固定波长检测器、可变波长检测器和光电二极管阵列检测器3类。
UVD是场流分离系统中最常用的检测器, 具有简单易行、成本低廉的优点。但是UVD很难直接用于大分子的定量研究, 因为UVD只能检测有紫外吸收的物质, 一些化合物如纤维素及其衍生物或糖类没有紫外吸收, 因此UVD常常与其他检测器联用, 辅助表征分析物。值得一提的是, 二极管阵列检测器的原理是复色光通过样品池被组分选择性吸收后再进入单色器, 照射在二极管阵列装置上, 使纳米波长的光强度转变为相应的电信号响度, 获得组分的吸收光谱, 从而获得特定组分的结构信息。在场流分离中, 可在线联用紫外/可见光二极管阵列检测器和激发发射基质荧光检测器用于表征水溶性有机物的光学性质[39]。
FD具有灵敏度高、选择性好、可检测微量组分和体内药物的优点, 但其仅适用于能产生荧光的物质的检测, 而且影响因素较多, 使用时对溶剂的纯度、pH值、样品浓度、检测温度等都有很高的要求。
Mangal等[40]使用荧光标记法联用AF4检测微生物培养基和丘吉尔河中硫醇的浓度及相对分子质量。Dou等[29]通过AF4在线联用UVD、MALS检测器和FD(AF4-UV-MALS-FD)分离表征鸡蛋黄匀浆中的低密度脂蛋白并研究其聚集行为。
RID中组分与载液的折光率不同, 其响应信号与浓度成正比。RID属于通用型检测器, 只要组分的折光率与载液的折光率有足够的差别就能检测, 适用于无紫外吸收的化合物的分析, 如糖类分析。对糖类检测灵敏度较高, 检出限可达10-5g/L, 稳定性好, 操作方便, 但该检测器对多数物质的检测灵敏度低(约10-2g/L), 且受环境温度、流动相组成等波动影响较大, 不适合梯度洗脱。
在AF4系统的联用方面, RID经常作为联用检测器之一被广泛应用。Zillies等[41]使用AF4联用RID建立了定量药物转运系统中聚乙二醇化凝胶纳米颗粒的方法。Makan等[42]在研究不同合成途径得到的聚苯乙烯-b-异戊二烯的分子异质性时, 使用AF4联用MALS检测器、RID和UVD从均聚物和偶联产物中分离二嵌段共聚物进行分析。
DLS也称为光子相关光谱、准弹性光散射, 测量光强的波动随时间的变化。DLS技术用于测量粒子粒径, 具有准确快速、可重复性好的优点, 已经成为纳米科技中比较常规的一种表征方法。随着仪器的更新和数据处理技术的发展, 目前DLS检测不仅具备测量粒径的作用, 还具有测量Zeta电位等能力, 因此广泛应用于表征多种微粒系统, 包括合成聚合物(乳液、聚氟乙烯等)、水包油/油包水型乳剂、囊泡、胶束、生物大分子、颜料、染料、二氧化硅、金属溶胶、陶瓷和其他胶体悬浮液及分散体。Chang等[43]比较了实际环境水域和污水样品中银纳米粒尺寸测定的3种分析方法, 分别是流体动力色谱、AF4和单粒子电感耦合等离子体质谱法, 并使用DLS进行尺寸表征。
静态光检测器(static light scattering, SLS)应用于悬浮在液体中的颗粒时, 利用Mie散射形成光强和角度的函数关系, 得到颗粒粒度大小和形状的信息; 应用于高分子溶液时, 光强与角度、浓度形成依赖关系, 利用Zimm等方法可以得到绝对重均分子量、第二维里系数、均方根回旋半径、Zimm/Berry/Debye曲线等参数[44]。SLS广泛用于石油化工、生命科学、生物医学和环境化学等领域[45]。与DLS法一样, 都对样品及溶剂的除尘要求很高。Varenne等[46]报道了被称为多模型发展的葡聚糖修饰的聚氰基丙烯酸异丁酯纳米颗粒分散体的尺寸分布评估的9种分析方法, 其中SLS作为批量表征颗粒的方法之一用来评估颗粒粒径尺寸分布信息。
当分子被激光照射时, 散射光的强度与分子量直接相关, 这种关系可以用瑞利方程[47]进行描述, 如果能够保持入射光束角度为0°, 那么瑞利方程的应用就能大大简化, 但是在这个角度进行测量并不可行, 因为散射光信号很难与入射光信号区分开来。小分子聚合物(通常指大小在10~15 nm以下)各个角度的散射光强度都相同, 可在任何角度对这些各向同性散射体的散射光进行测量。但是对于较大的各向异性散射体, 散射光强度会受到不同角度的影响, 使无法0°测量的问题更加复杂。近些年陆续开发出了多种光散射技术以解决0°测量的问题, 如直角光散射(RALS)、小角度光散射(LALS)和MALS[48], 其中LALS检测器是适用于所有类型大分子的稳定可靠的检测器, MALS检测器是AF4联用技术中最为常用的检测器。
MALS对分子从多个角度进行光强度测量, 建立散射光随入射角度变化的函数模型, 从而推断出0°入射光时的散射光强度, 根据斜率可计算出精确的回转半径。MALS系统配备有2~20个不同数量的检测点, 一般来说检测点数量增多会使数据更加可靠, 但由于在入射角度较小的时候, 非线性特性会对所测量的分子量值产生很大的影响, 因此在选择检测系统要求更高精密度时, 则更应该关注入射角度较小时的检测器质量。
质谱是纯物质鉴定的最有力工具之一, 其中包括相对分子质量测定、化学式的确定及结构鉴定等, 是同时具备高特异性和高灵敏度且得到广泛应用的普适方法, 常与色谱等分离设备联用, 在AF4的联用系统中也是最重要的分支之一。质谱可分为电子轰击质谱(EI-MS)、场解吸附质谱(FD-MS)、快原子轰击质谱(FAB-MS)、基质辅助激光解吸飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)、ESI-MS、ICP-MS等, 其中MALDI-TOF MS和ESI-MS广泛用于大相对分子质量分子的分析。
AF4作为一种高效、宽范围、温和的分离方法, 与质谱的结合顺应了生物分析领域的发展趋势, 尤其是高分辨率、高精密度的质谱方法的飞速发展, 与AF4的联用具有更宽广的应用范围和更高的精密度, 与AF4联用分析时3种最常用的质谱技术为ESI-MS、MALDI-TOF MS和ICP-MS。
除以上所述表征技术方法外, 常用的还有扫描电镜(SEM)[32]和TEM[49]等, 用于分析物的尺寸、形态及分布表征。其中SEM适用于粒径分布较为均匀的颗粒, 常用于精确聚焦得到颗粒表面性质的表征, TEM更加精确, 可识别精度更高。
经过近20年的高速发展期, AF4技术无论从分离精度还是应用范围上都取得了突破性的进展, 尤其在生物分析领域表现出巨大的应用潜力。在接下来的发展中, 以下两种趋势有望成为发展主流:
1) 分离设备的小型化(芯片化)发展。通过缩小分离设备的尺寸用以发展快速高效的分离手段, 如便于临床实践中应用的快速诊断、用于移动监测的小型化、方便携带使用等。同时需要进一步优化分离系统小型化之后的各项参数, 使其能在线联用质谱等仪器, 在线脱盐且无需分流, 促进AF4系统在纳米技术、蛋白质组学、脂质组学等生物技术领域的应用。
2) 联用技术的多样化。针对分析物的特征性质, 将AF4与其他预分离方法结合进行多维度综合分离, 这是联用其他预分离方法; 另一种就是联用合适的、精密度高的检测器/鉴定表征设备, 便于对分析物进行更深入的探究挖掘。
然而目前AF4系统仍存在一定的局限, 如分离度与成熟的HPLC相比仍有发展空间。在分离膜的选择上仍可以进一步探究, 分离用聚酯膜的材质、孔径等影响分离图的峰形和分析物定量结果等。随着生物分析领域生物质谱等高精密检测技术的发展, AF4系统基于尺寸(扩散系数)的分离将为传统生物分析提供新的分离维度和分析思路。
2017,
Vol. 35 Issue (9): 918-926
PDF
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Vol. 35 Issue (9): 918-926
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