色谱  2017, Vol. 35 Issue (11): 1198-1203   PDF    
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张居舟
纪水琳
蔡荟梅
李静
汪永信
王璟秋
高效液相色谱法同时测定塑料和纸质包装材料中6种荧光增白剂
张居舟1 , 纪水琳2, 3 , 蔡荟梅2, 3 , 李静1 , 汪永信1 , 王璟秋1     
1. 安徽省食品药品检验研究院, 安徽 合肥 230051;
2. 安徽农业大学茶与食品科技学院, 安徽 合肥 230036;
3. 安徽农业大学, 省部共建茶树生物学与资源利用国家重点实验室, 安徽 合肥 230036
收稿日期：2017-06-23
基金项目：安徽省自然科学基金项目（1408085MKL38）；安徽省特色创新建设资金项目（15czs08032）；安徽省教委自然科学基金项目（KJ2016A216）
通讯联系人：张居舟, Tel:(0551)63356522, E-mail:juzhouzhang@163.com
摘要：建立了同时测定塑料和纸质食品包装材料中6种脂溶性荧光增白剂（FWA 135、FWA 184、FWA 185、FWA 199、FWA 378和FWA 393）的高效液相色谱方法。用三氯甲烷-乙腈（3：7，v/v）混合溶液提取，经HLB小柱净化后用高效液相色谱-荧光检测法进行定性定量分析。采用Phenomenex C18色谱柱分离，以5 mmol/L的乙酸铵水溶液和乙腈为流动相，进行梯度洗脱。结果显示：FWA 393在15~1500 μg/L范围内的线性关系良好，其余5种荧光增白剂在5~500 μg/L范围内线性关系良好，相关系数均大于0.999；加标回收率为80.4%~125.0%；相对标准偏差（RSD，n=6）为1%~13%。应用该方法分析了市场销售的12个样品以验证方法的实用性。该方法前处理简单，回收率高，精密度好，适用于食品包装材料中6种荧光增白剂的检测。
关键词：高效液相色谱    荧光检测    荧光增白剂    食品包装材料    
Simultaneous determination of six fluorescent whitening agents in plastic and paper packaging materials by high performance liquid chromatography
ZHANG Juzhou1, JI Shuilin2, 3, CAI Huimei2, 3, LI Jing1, WANG Yongxin1, WANG Jingqiu1     
1. Anhui Provincial Institute for Food and Drug Test, Hefei 230051, China;
2. School of Tea & Food Science and Technology, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China;
3. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China
Foundation item: Natural Science Foundation of Anhui Province (No. 1408085MKL38); Special Innovative Province Construction in Anhui Province (No. 15czs08032); Natural Science Foundation of Anhui Educational Commission (No. KJ2016A216)
Abstract: A novel analytical method was developed for the simultaneous determination of six fluorescent whitening agents (FWAs:FWA 135, FWA 184, FWA 185, FWA 199, FWA 378 and FWA 393) in paper and plastic food packaging materials by high performance liquid chromatography with fluorescence detection (HPLC-FLD). The sample was extracted with mixed solution of chloroform and acetonitrile (3:7, v/v), then cleaned up by HLB solid phase extraction column. Qualitative and quantitative analyses were carried out by HPLC. The sample was separated on a Phenomenex C18 column using acetonitrile and 5 mmol/L ammonium acetate aqueous solution as mobile phases. The results indicated that the linear range of FWA393 was 15-1500 μg/L and the linear ranges of the other five FWAs were 5-500 μg/L with correlation coefficients greater than 0.999. The recoveries in spiked samples were between 80.4% and 125.0% with RSDs (n=6) of 1%-13%. Furthermore, this method was applied to analyze 12 samples in the market to verify the practicality of the method. The method showed the advantages of simplicity, high recovery and good precision, and is suitable for the detection of the six fluorescent whitening agents in food packaging materials.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     fluorescence detection (FLD)     fluorescent whitening agents (FWAs)     food packaging materials    

荧光增白剂(FWAs)[1-3]是一种无色或浅色的有机化合物, 它可以吸收人肉眼看不见的近紫外光, 再发出肉眼可见的蓝紫色荧光。此外, 荧光增白剂也被称为白色染料, 国外将其列入染料类。近些年来荧光增白剂的用途日趋广泛, 需求量也日益增加, 其范围已经渗透到各个工业领域, 如纺织、洗漆、造纸、皮革、塑料、油墨、激光、涂料、油漆等。一般增白剂分为两类, 一类是水溶性增白剂, 另一类为脂溶性增白剂。前者可用于纸张、涂料、洗衣粉、棉织物的增白[1, 4-7], 后者一般用于化纤、塑料等的增白[7]。

研究表明人体皮肤可通过接触含有荧光增白剂的食品包装吸附荧光增白剂。长期接触大量荧光增白剂会影响人的视力, 荧光增白剂进入人体后会加重肝脏的负担, 此外, 荧光增白剂还会与伤口处的蛋白质结合, 阻碍伤口的愈合[3, 7-11]。因此, 《食品包装用原纸卫生标准》[12]中明确规定, 食品包装用纸不得采用废旧纸和社会回收废纸作为原料, 也不得使用荧光增白剂或对人体有影响的化学助剂为添加剂。现行国家标准中对荧光增白剂的检测主要依据GB/T 31604.47-2016, 该标准规定使用紫外灯照射对食品接触材料及制品纸、纸板及纸制品中的荧光增白剂进行定性测定。SN/T 4396-2015中规定使用液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术测定出口食品中FWA 85、FWA 71和FWA 113, 其检出限为0.1 mg/kg。但目前仍存在检测荧光增白剂的已有标准检出限较高及缺乏脂溶性非质子化荧光增白剂检测标准的问题。

现有的荧光增白剂测定方法主要有高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD)[4, 13]、高效液相色谱-二极管阵列检测法(HPLC-DAD)[14-16]和高效液相色谱-质谱法(HPLC-MS)[2, 17], 其中液相色谱-质谱法对样品的洁净程度要求较高, 仪器和检测成本较高。本文采用高效液相色谱-荧光检测法测定塑料及纸质包装材料中的6种荧光增白剂(FWA 199、FWA 393、FWA 184、FWA 185、FWA 378和FWA 135, 结构式见图 1), 在前处理过程中使用了HLB固相萃取小柱对样品中的荧光增白剂进行净化和富集, 提高了方法的灵敏度。该方法的建立为相关部门的检测提供了技术支持, 并为相关标准的制定提供了依据。

图 1 6种荧光增白剂的结构式 Fig. 1 Chemical structures of the six fluorescent whitening agents (FWAs)
1 实验部分
1.1 材料与试剂

荧光增白剂标准品:FWA 199、FWA 393、FWA 184、FWA 185、FWA 378和FWA 135 (纯度均大于98%), 购于美国Sigma Aldrich公司。

食品包装材料:牛皮纸购于云南万隆纸业有限公司; PE(聚乙烯，polyethylene)塑料购于汉正塑业批发经营部有限公司; 12种食品包装取自安徽省合肥市超市。

试剂及SPE小柱:乙腈(色谱级)购于美国Fisher公司; 三氯甲烷(分析纯)购于上海国药集团化学试剂有限公司; Waters HLB小柱(500 mg, 6 mL)购于美国Waters公司。

1.2 仪器与设备

高效液相色谱仪(Agilent 1260, 美国安捷伦公司), 配荧光检测器; 氮吹仪(N-EVAPTM 112, 美国Organomation公司); 高速离心机(Z-323 K型, 德国Hermle公司); 电子天平(AB204-S, 感量0.1 mg, 瑞士梅特勒-托利多公司); 恒温培养箱(DHP-9162, 上海齐欣科学仪器有限公司); 数控超声波清洗器(KQ 5200 DE, 昆山市超声仪器有限公司); 涡旋仪(IKA MX, 德国Basic公司); 过滤器(聚四氟乙烯(polytetrafluoroethylene, PTFE), 孔径为0.22 μm, 上海安谱科学仪器有限公司); 超纯水机(Milli-Q Biocel, 美国密理博公司); 紫外分光光度仪(UV-5300, 上海元析仪器有限公司); 荧光分光光度仪(970 CRT, 上海精科有限公司)。

1.3 标准溶液

分别精确称取6种荧光增白剂各10.0 mg, 用乙腈定容于100 mL棕色容量瓶中, 配制100 mg/L的标准溶液, 在4 ℃条件下储备, 可保存3个月。使用时将6种100 mg/L的荧光增白剂标准溶液用乙腈稀释, 配制成FWA 393为3 mg/L，其他FWAs为1 mg/L的混合标准溶液。

1.4 样品前处理
1.4.1 阳性样品的制备

取6 cm×6 cm阳性包装样品, 将其剪成不大于0.5 cm×0.5 cm的碎片, 加入0.5 mL 1 mg/L荧光增白剂混合标准液, 均匀混合, 晾干, 备用。

1.4.2 样品中荧光增白剂的提取

将制备好的阳性样品置于50 mL离心管中, 准确加入20 mL的三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液, 分两次加入, 每次加入10 mL, 且每次在50 ℃条件下超声40 min, 将两次的提取液收集在同一个50 mL离心管中, 以9 000 r/min离心5 min, 取上层清液于40 ℃氮吹仪中吹干, 再用5 mL乙腈复溶, 放置, 待用。

HLB小柱的净化:使用5 mL 80%(体积分数)的甲醇水溶液活化HLB小柱, 加入5 mL提取液过小柱, 再使用5 mL甲醇-水(2 : 1, v/v)混合溶液进行淋洗, 最后用5 mL三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液洗脱, 收集洗脱液。

将收集液在4 ℃下用氮气吹干, 用2 mL乙腈定容, 定容液经有机滤膜过滤后进行液相色谱分析。

1.5 液相色谱条件

色谱柱:C18柱(Phenomenex, 250 mm×4.6 mm, 5 μm); 柱温:40 ℃; 进样量:10 μL; 检测器:荧光检测器; 检测波长:激发波长为360 nm, 发射波长为430 nm; 流动相:乙腈(A)和5 mmol/L的乙酸铵水溶液(B)。洗脱程序:0~1.5 min, 80%A; 1.5~4.0 min, 80%A~100%A; 4.0~7.5 min, 100%A; 7.5~8.5 min, 100%A~30%A; 8.5~12.5 min, 30%A; 12.5~13.0 min, 30%A~80%A; 13.0~18.0 min, 80%A。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件
2.1.1 激发波长和发射波长的选择

使用紫外可见分光光度仪测定混合标准溶液中各个荧光增白剂的激发波长, 并使用荧光分光光度仪测定各个荧光增白剂的发射波长(见表 1)。从信号峰的大小、对称性以及物质之间存在的相互影响等方面的综合考虑, 选用了360 nm为激发波长, 440 nm为发射波长。

表 1 6种荧光增白剂的最大激发波长和最大发射波长 Table 1 Maximum excitation wavelength and emission wavelength of the six FWAs
2.1.2 色谱柱的选择

本文选用了4种色谱柱(安捷伦ZORBAX SB-C18色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB色谱柱(150 mm×4.6 mm, 5 μm)、ZORBAX Eclipse XDB色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Phenomenex C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm))对6种荧光增白剂进行色谱分析, 结果见图 2。从分离效果来看, 图 2a和图 2b中各荧光增白剂没有得到较好的分离，这可能是因为色谱柱长度不够; 图 2c和图 2d中各个荧光增白剂都得到了较好的分离, 但采用ZORBAX Eclipse XDB色谱柱分离时分离时间较长, 且FWA 393的色谱峰峰形过宽, 不对称, 还有拖尾现象; 采用Phenomenex C18色谱柱可以在较短的时间内将6种荧光增白剂基本完全分离, 其中FWA 199出现了两个色谱峰, 可能是由于该物质存在异构体, 发生了构型转变[17]。因此, 本文选用Phenomenex C18柱作为这几种荧光增白剂的色谱分离柱。

图 2 使用不同色谱柱时荧光增白剂的分离色谱图 Fig. 2 Separation chromatograms of FWAs with different columns a. ZORBAX SB-C18 column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); b. ZORBAX Eclipse XDB column (150 mm×4.6 mm, 5 μm); c. ZORBAX Eclipse XDB column (250 mm×4.6 mm, 5 μm); d. Phenomenex C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm).
Peak identifications: 1. FWA 199; 2. FWA 135; 3. FWA 185; 4. FWA 393; 5. FWA 378; 6. FWA 184.
2.2 提取条件的选择
2.2.1 提取剂的选择

由于超声提取耗时短, 操作简单, 所以本文选用超声提取法。本文分别选取了乙腈、三氯甲烷、丙酮、乙酸乙酯、正己烷以及三氯甲烷与乙腈的混合溶液(三氯甲烷与乙腈的体积比分别为1 : 9、2 : 8、3 : 7、4 : 6、5 : 5、6 : 4、7 : 3)为提取剂, 在相同提取条件下(室温下超声40 min, 提取剂用量为20 mL)提取, 氮吹, 复溶, 经HLB小柱净化, 氮吹, 2 mL乙腈定容。提取阳性牛皮纸和阳性食品级PE塑料样品中的荧光增白剂, 对比提取效果, 选出最优提取剂。其提取结果如图 3所示, 通过比较各个荧光增白剂在不同溶剂中的提取率及各荧光增白剂的平均提取率, 可以看出三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液提取效果最好。

图 3 提取溶剂对荧光增白剂回收率的影响 Fig. 3 Effects of extraction solvents on recoveries of FWAs a. in kraft paper; b. in polyethylene (PE). A: acetonitrile; B: chloroform; C: acetone; D: ethyl acetate; E: hexane; F: chloroform-acetonitrile (1 : 9, v/v); G: chloroform-acetonitrile (2 : 8, v/v); H: chloroform-acetonitrile (7 : 3, v/v); I: chloroform-acetonitrile (4 : 6, v/v); J: chloroform-acetonitrile (5 : 5, v/v); K: chloroform-acetonitrile (6 : 4, v/v); L: chloroform-acetonitrile (3 : 7, v/v).
2.2.2 提取次数的选择

取自制阳性食品包装样品(牛皮纸和PE塑料)各一份(6 cm×6 cm/份), 在50 ℃条件下超声40 min。使用30 mL三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液提取阳性样品, 分别提取3次, 每次使用10 mL该溶液并测定含量。提取效果如图 4所示, 当提取两次后荧光增白剂可基本被提取完全。因此, 本文使用20 mL三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液提取，提取次数为2次, 每次使用10 mL。

图 4 提取次数对荧光增白剂回收率的影响 Fig. 4 Effects of extraction times on recoveries of FWAs a. in kraft paper; b. in PE.
2.2.3 超声时间的选择

取自制阳性食品包装样品(牛皮纸和PE塑料)各5份(6 cm×6 cm/份), 均使用20 mL三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液提取(分两次提取, 每次使用10 mL), 在50 ℃条件下超声, 探究超声时间(10、20、30、40、50、60 min)对荧光增白剂回收率的影响, 结果见图 5。实验结果表明, 超声时间对5种荧光增白剂的提取率没有明显变化, 对FWA 393的提取率变化较大，且在超声40 min后得到明显提高, 故本文超声时间选择40 min。

图 5 超声时间对荧光增白剂回收率的影响 Fig. 5 Effects of ultrasonic time on recoveries of FWAs a. in kraft paper; b. in PE.
2.2.4 超声温度的选择

取自制阳性食品包装样品(牛皮纸和PE塑料)各4份(6 cm×6 cm/份), 均加入20 mL三氯甲烷-乙腈(3 : 7, v/v)混合溶液, 提取2次, 每次使用10 mL。在提取条件下超声, 探究超声温度(30、40、50、60 ℃)对荧光增白剂回收率的影响, 结果见图 6。可以看出在30~60 ℃范围内, 牛皮纸中大部分荧光增白剂的提取率随着温度的上升而升高; 少数荧光增白剂的提取率上升后下降, 可能由于60 ℃接近三氯甲烷的沸点(三氯甲烷的沸点:62 ℃)使溶剂挥发, 从而使提取率下降。故本文选用最佳超声温度为50 ℃。

图 6 超声温度对荧光增白剂回收率的影响 Fig. 6 Effects of ultrasonic temperature on recoveries of FWAs a. in kraft paper; b. in PE.
2.3 线性关系、检出限及定量限

将按1.3节方法配制的混合标准溶液逐级稀释, 配制FWA 393为1500、600、300、150、60、15、6 μg/L，其他FWAs为500、200、100、50、20、5、2 μg/L的系列混合标准溶液, 经HPLC分析后制备标准曲线; 用空白基质进行加标试验, 按信噪比(S/N)≥ 3计算得到分析方法的检出限(LOD), S/N≥10计算得到分析方法的定量限(LOQ), 结果见表 2。

表 2 6种荧光增白剂的线性方程、相关系数(R2)、LOD值以及LOQ值 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R2), LODs and LOQs of the six FWAs
2.4 方法回收率和精密度

分别添加3个不同水平荧光增白剂的混合标准溶液于空白基质中进行方法回收率试验和精密度试验, 每个添加水平进行6次重复试验。

方法回收率和相对标准偏差(RSD)见表 3和表 4。结果表明, 6种FWAs的回收率在80.4% ~125.0%之间, 相对标准偏差为1% ~13%, 方法的准确度和精密度满足GB 4806.8-2016的要求。

表 3 包装纸中荧光增白剂的回收率(n=6) Table 3 Recoveries of FWAs in kraft paper (n=6)

表 4 PE食品包装材料中荧光增白剂的回收率(n=6) Table 4 Recoveries of FWAs in PE food wrapping (n=6)
2.5 实际样品的测定

在市场上抽取12种包装食品, 测定食品包装中6种荧光增白剂的含量, 在最优条件下进行样品处理和色谱分析, 结果见表 5。

表 5 不同食品包装袋中6种荧光增白剂的含量 Table 5 Contents of the six FWAs in different food package

由表 5可以看出, 在12种包装材料中均含有荧光增白剂, 其中FWA 393、FWA 378以及FWA 184这3种荧光增白剂的检出率较高。其检出的原因可能是由于食品包装在制作过程中使用被荧光增白剂污染的回收纸张为原料; 或是人为非法在纸浆或油墨中添加荧光增白剂。

3 结论

本实验建立了高效液相色谱-荧光检测分析法测定食品接触材料中的脂溶性非质子化的荧光增白剂, 该方法前处理简单, 回收率高, 精密度好, 适用于食品包装材料中荧光增白剂的检测。对市场上销售的12种食品包装材料中的荧光增白剂进行了分析, 发现所购得的包装材料均检出荧光增白剂, 其中FWA 378、FWA 393、FWA 184检出率较高。该方法的建立和使用可为食品接触材料的安全监督提供一定的技术支持。

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