展青霉素(patulin, PAT)又名棒曲霉素, 化学式为C7H6O4, 相对分子质量为154, 具有环内酮结构[1]。其六元环端存在羟基, 易溶于水、乙醇、丙酮及乙酸乙酯等溶剂[2]。PAT为扩展青霉等霉菌的代谢产物, 广泛存在于霉变水果中, 在酸性环境中非常稳定, 在碱性条件下活性降低, 易分解[3]。PAT是一种神经性毒素, 具有强烈的抗菌活性, 能够诱导人类细胞的DNA氧化损伤, 从而致使基因突变和诱发癌症[4]。鉴于PAT的潜在毒性, 欧盟及世界卫生组织(WHO)[5]规定苹果及苹果汁中PAT的最大限量为50 μg/kg; 我国[6]也制定了相关标准, 规定水果制品中PAT的限量标准为50 μg/kg。
PAT的测定方法有液相色谱-质谱法[7]、高效液相色谱法[8-10]、免疫学检测方法[11]及气相色谱-质谱法[12]。液相色谱-质谱法及高效液相色谱法灵敏度较高, 故2016年我国颁布的食品安全国家标准[13]采用这两种方法测定食品中的PAT。由于水果及其制品组成复杂, PAT的色谱分析存在较为严重的基质干扰。因此, 既要选择高效的色谱分离条件, 还要对样品进行前处理。固相萃取(SPE)是一种有效的处理手段, 目前, 对于PAT的测定所使用的固相萃取小柱为美国生产的Oasis HLB固相萃取小柱及MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱。Oasis HLB固相萃取小柱的吸附机理为反相吸附, 萃取时PAT及弱极性化合物被吸附在填料中, 萃取后用甲醇洗脱。MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱的填料中含有亲脂性和电荷活性成分, 可选择性吸附样品提取液中的脂类、蛋白质和碳水化合物等干扰物质, 让待测化合物通过净化柱, 达到分离纯化的目的。MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱对PAT的检测回收率优于Oasis HLB固相萃取小柱[14]。
本文将硅酸镁、硅胶、硅藻土、硫酸钙按一定比例混合制成新型固相萃取填料, 由于该填料具有极性、非极性及离子交换等多类官能基团, 对于色素、脂类、蛋白质等具有较强的吸附能力。在PAT的净化过程中, 样品中的干扰组分被吸附在小柱填料中, 而待测组分随净化液流出, 经收集、浓缩, 实现了一步净化, 操作简便, 重现性好。使用自制固相萃取小柱与超高效液相色谱(UPLC)联用测定水果及果酱中的PAT, 取得了满意的结果。
1290 Infinity Ⅱ型超高效液相色谱仪、Eclipse Plus C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Agilent公司); Visiprep DL SPE型固相萃取装置(美国SUPELCO公司); DHG-9145A型电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司); SK2200HP型超声波清洗仪(上海科导超声仪器有限公司); GT10-2型高速台式离心机(北京时代北利离心机有限公司); SHZ-ⅢB型循环水真空泵(浙江临海市精工真空设备厂); DF-Ⅱ型集热式恒温水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂); Adventurer系列AR1140型电子分析天平(上海奥豪斯仪器有限公司); MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱(配10 mL样品净化试管, 美国Romer公司)。
乙腈(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司); 甲醇(色谱纯, 天津市光复精细化工研究所); 乙醇、四氢呋喃、硫酸钙(均为分析纯, 天津市凯通化学试剂有限公司); 羟甲基糠醛(HMF)、PAT(均为分析标准品, 纯度为99%, 上海阿拉丁生化科技有限公司); 果胶酶(≥40 units/mg, 上海蓝季科技发展有限公司); 硅酸镁(纯度为100 g, 北京市亦中化工厂); 硅胶(100 g, 北京化工厂); 硅藻土(100 g, 大连红光化工厂); 高纯氮气(纯度为99.99%, 齐齐哈尔市铁锋区鑫福巨洋特种气体经销站); 果酱、苹果、梨购自当地超市, 实验用水为二次去离子水。
取硅胶、硅藻土、硫酸钙、硅酸镁按1 : 1 : 1 : 3的质量比混合, 加入适量乙醇, 研磨成匀浆。以6 000 r/min的速度离心5 min, 将沉淀转移至30 mL瓷坩埚中, 于180 ℃鼓风干燥箱中恒温干燥4 h, 冷却至室温后过200目筛网。取6 mL聚丙烯管, 将筛板装入硬管底部, 通过漏斗将500 mg填料加入垂直放置的聚丙烯管中, 轻敲管壁使填料密实, 将另一块筛板装入聚丙烯管中并压实填料, 使填料上下表面平齐, 制成固相萃取小柱。
PAT标准储备液:向1 mg的PAT标准品中加入1.0 mL乙腈, 超声振荡溶解, 质量浓度为1 g/L。PAT标准工作液:用微量注射器吸取100 μL PAT标准储备液至10 mL容量瓶中, 用乙腈稀释, 定容, 摇匀, 质量浓度为0.01 g/L。
HMF标准储备液:称取20 mg HMF标准物质于50 mL烧杯中, 用甲醇溶解后定容至100 mL, 摇匀, 质量浓度为0.2 g/L。HMF标准工作液:用移液管准确吸取1.0 mL HMF标准储备液, 用甲醇稀释后定容至10 mL, 摇匀, 质量浓度为0.02 g/L;
展羟混合标准工作液:分别移取1.0 mL PAT标准工作液和1.0 mL HMF标准工作液至5 mL试管中, 于40 ℃水浴用N2吹干, 用0.8%(体积分数, 下同)四氢呋喃水溶液溶解并定容至10 mL, 摇匀。得到质量浓度分别为1和2 mg/L的PAT和HMF混合溶液。
色谱柱为Eclipse Plus C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm), 流动相为0.8%四氢呋喃水溶液, 流速为0.5 mL/min, 柱温为30 ℃, 检测波长为276 nm, 进样量为10 μL。
使用微量注射器分别吸取PAT标准储备液1、5、10、50、100 μL至10 mL容量瓶中, 用0.8%四氢呋喃水溶液定容, 摇匀, 得到质量浓度为0.1、0.5、1.0、5.0、10.0 g/L的PAT系列标准溶液。用一次性注射器吸取上述溶液各1 mL, 经0.22 μm水相滤膜过滤后进行UPLC分析, 得到液相色谱图, 以峰高对质量浓度作标准曲线。
半固体样品使用匀浆机搅匀、固体样品经固体粉碎机粉碎后, 称取4 g样品加入50 mL具塞离心管中, 加入50 mg果胶酶和4 mL去离子水, 混合均匀, 于室温下避光过夜。
向酶解样品中加入21 mL乙腈, 涡旋振荡2 min, 超声提取30 min, 以10 000 r/min的速度离心10 min, 记录上层清液的体积。
取8 mL上层清液, 加入固相萃取小柱中, 控制流速为1 mL/min, 准确量取5 mL流出液并转移至小试管中, 于40 ℃水浴中用N2吹干, 准确加入0.5 mL 0.8%四氢呋喃水溶液, 超声溶解, 摇匀, 经0.22 μm水相滤膜过滤后供UPLC分析。
在腐烂水果中HMF常与PAT共存, 由于它们结构相近, 保留时间相差无几, 容易造成假阳性[15], 影响PAT的定量检测。本文使用UPLC分析测定混合标准工作液, 考察HMF和PAT的分离情况, 如图 1所示, HMF和PAT达到基线分离, 保留时间分别为1.643和2.228 min。UPLC使用的Eclipse Plus C18柱固定相的粒径为1.8 μm, 比一般的色谱柱填料粒径小, 因此样品中的组分与色谱柱固定相的接触面积大, 分配次数多, 柱效高。
此外, Eclipse Plus C18柱耐受压力可达130 MPa, 流动相的线速度变化对柱效的影响不明显, 故色谱柱可在较高的流速下使用并可大大缩短样品的分析时间。分别用四氢呋喃-水体系及乙腈-水体系做流动相对样品进行测定, 发现使用0.8%四氢呋喃水溶液等度洗脱时, 分离效果好。乙腈的洗脱强度不及四氢呋喃, 增加乙腈的比例可以达到与四氢呋喃作流动相相同的洗脱效果, 但样品中其他组分与PAT的保留时间差相应缩小, 影响了PAT的出峰效果, 不便于定量。使用乙腈-水梯度洗脱(0~1 min, 10%乙腈; 1~3 min, 30%乙腈; 3~6 min, 60%乙腈)能达到较好的分离效果, 但柱压随着水的比例改变而不断变化, 导致基线漂移, 不利于定量, 且梯度洗脱操作繁琐。因此本文使用0.8%四氢呋喃水溶液作流动相。
按照1.4.2节进行试验, 以峰高(y)对质量浓度(x, mg/L)进行线性回归分析, 在0.1~10 mg/L范围内, 线性回归方程为y=15.909x+0.341 4, 相关系数(R2)=1。根据公式(1)计算仪器检出限:
式中D为仪器检出限(μg/L); N为基线噪声(mV); Q为接近于检出限的被测物质量浓度(μg/L); I为被测物信号响应值(mV)。计算得到PAT的仪器检出限为15.25 μg/L。
PAT的方法检出限(F, μg/kg)计算公式(2)如下:
式中M为回收率(%); V为样品离心后上层清液的体积(mL); 10为浓缩倍数; 4为样品质量(g)。计算得到PAT的方法检出限为10.22 μg/kg。10倍基线噪声对应的PAT的方法定量限为34.03 μg/kg。
分别取10份4 g新鲜果酱于50 mL具塞离心管中, 其中5份加入50 mg果胶酶, 另外5份不加果胶酶。分别加入4 mL 0.125 mg/L PAT标准液, 混合均匀, 按1.5节方法进行提取、净化, 流出液经0.22 μm水相滤膜过滤后用UPLC分析。通过线性回归方程计算流出液中PAT的质量浓度; 加入果胶酶后样品中PAT的回收率由59.22%提升至93.24%(n=5)。
果胶酶本质上是聚半乳糖醛酸水解酶, 果胶水解后主要生成小分子的半乳糖醛酸, 使样品提取液黏度下降便于提取, 可大大提高样品中PAT的提取效率, 提升PAT测定的灵敏性。
取两份4 g已发霉的果酱, 按1.5节方法进行提取, 其中一份不净化, 样品提取液均浓缩至0.5 mL, 经0.22 μm水相滤膜过滤后使用超高效液相色谱仪进样分析, 结果见图 2。经过自制固相萃取小柱净化的样品杂质峰高均不同程度降低, 保留时间大于16 min的组分尤为明显。PAT的峰高基本保持不变, 附近的干扰组分峰消失。
本文自制固相萃取小柱的填料由具有极性、非极性及离子交换等多类官能基团的填料复合而成。硅胶分子式为mSiO2·nH2O, 属于非晶态物质, 其吸附性能和含水量有关, 硅胶分子中富含硅醇基, 可以通过氢键作用力吸附样品中的水和极性物质。硅酸镁是具有蒙脱石结构的多孔材料, 极性小且比表面积大, 具有吸附色素、脂类等非极性化合物的功能。经过焙烧后的硫酸钙脱水为烧石膏, 可以吸水并使蛋白质盐析。硅藻土的主要成分是SiO2, 表面布满纳米级单层孔隙, 可吸附大分子蛋白质。在试验中, 未经过净化的样品浓缩液经久置会出现沉淀, 而净化过的样品不会出现该现象。
使用本方法测定了样品中PAT的含量, 将PAT的峰高代入标准曲线, 可计算出萃取浓缩后样品中PAT的质量浓度C(mg/L)。根据公式(3)计算样品中PAT的含量w(mg/kg):
式中:m为样品质量(g); V为提取液的体积(mL); 10为浓缩倍数。样品中PAT的测定结果如表 1所示, 发霉的样品中均含有PAT, 且PAT的含量随样品放置时间的增加而急剧升高。由于果酱中含有防腐剂, PAT含量较低。
在分析方法适用的浓度范围内, 高浓度区加标回收率较高, 与本底值接近的低浓度区的加标回收率较低。当样品中待测物含量接近检出限时, 加标量应控制在标准曲线的低浓度范围; 当样品中待测物含量小于检出限时, 以检出限的量作为待测物含量进行加标。样品加标回收率的计算公式为:
式中P为加标回收率(%), mt为仪器测出的总质量(g), m0为样品原有质量(g), madd为加入标准物的质量(g)。
在线性范围(0.1~10 mg/L)内进行加标回收试验。取1 mL发霉梨的提取液(PAT质量浓度为1.068 mg/L)作为样品, 分别向其中添加不同浓度的PAT标准溶液并混合均匀, 经自制固相萃取小柱净化、N2吹干后用0.8%四氢呋喃水溶液定容至0.5 mL, 经UPLC检测, 样品加标色谱图见图 3。将自制固相萃取小柱与MycoSep 228 AflaPat多功能净化柱进行对比, 每个浓度的加标样品平行测定5次, 加标回收率见表 2。
本文使用以硅酸镁、硅胶、硅藻土、硫酸钙制备的固相萃取小柱对水果制品提取液进行了净化, 大大降低了UPLC测定PAT时的基体干扰。自制小柱工艺简单, 价格低廉, 净化效果与MycoSep 228 AflaPat净化柱相当。使用SPE-UPLC联用测定PAT, 结果准确, 检出限低。
2017,
Vol. 35 Issue (11): 1160-1164
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