近年来以氨羧类螯合剂为配体所合成的色谱固定相成为分离纯化生物大分子的常用工具[1-3]。这类配体的特点是:不固定金属离子时, 该配体具有阳离子交换特性和金属离子螯合特性; 固定了金属离子后, 能作为固定金属亲和色谱(IMAC)柱选择性地分离纯化蛋白质。常见的氨羧类配体有三羧酸乙二胺(TED)[4]、L-谷氨酸(L-Glu)[5]、L-天门冬氨酸(L-Asp)[6]和亚氨基二乙酸(IDA)[7-9]等, 其中IDA应用最为广泛。虽然这些螯合剂具有较好的阳离子交换特性, 但对金属离子的螯合强度一般, 从而限制了它们作为IMAC柱在生物大分子分离纯化中的应用。如图 1所示, 亚氨基二琥珀酸(IDS)[10]是含有5个配位原子的氨羧类螯合配体, N和O原子可为金属离子提供孤对电子, IDS的高配位数能更高效、稳定地结合金属离子。目前国内外关于IDS金属螯合特性的研究仅限于IDS在溶液中作为一种螯合试剂。研究[11]表明, 它在溶液中对大多数金属离子具有与EDTA近似甚至更好的螯合性能。由于IDS对金属离子的强螯合特性及其绿色环保特性, 该螯合剂已成为去除工业废水中重金属离子的首选试剂[12, 13]。
基于IDS的强金属螯合特性, 若能将其固定于固相硅胶(Silica)单体上, 将具备以下优势:(1)IDS-Silica固定相可采用柱操作去除溶液中的金属离子, 与液态IDS的使用方式相比, 既具备连续操作的便利性和重复使用的经济性, 又可集多次固-液相平衡满足日益严苛的环保排放要求。(2)IDS以液态使用时, 只能作为去除溶液中金属离子的螯合剂, 功能单一。若将IDS固定于硅胶单体上, 此时IDS-Silica固定相本身就是一种典型的弱酸性阳离子色谱填料, 固定金属离子后又可作为IMAC柱分离纯化各种蛋白质, 这种双功能色谱模式极大地丰富了IDS的应用范围。(3)IDS是五齿的氨羧类螯合剂, 与金属配位能力强, 通过对这一新型固定金属亲和柱的系统研究, 有可能为IMAC柱在蛋白质分离纯化时缓解金属离子的流失提供一种解决方法。
目前, 还未见到有关IDS-Silica固定相的制备和应用方面的相关报道。在本研究中, 以IDS为配体、硅胶为基质、γ-缩水甘油醚氧丙基三甲氧基硅烷(γ-GLDP)为间隔臂, 采用间接法制备了一种新型的IDS-Silica氨羧类固定相, 并通过对色谱固定相的表征、阳离子交换性能和金属螯合特性的研究, 探讨了所合成的新型氨羧类分离介质的多功能性。
ÄKTA purifier 10生物色谱制备仪(瑞典Amersham Biosciences公司); TitraMate 20型pH电位仪(瑞士Mettler Toledo公司); 124PP装填机(日本Chemico公司); ZDJ-4B型自动电位滴定仪(上海仪电科学仪器股份有限公司); ULTIMA 2电感耦合等离子体发射光谱(ICP-AES)仪(法国HORIBA Jobin Yvon公司); HC TPIIB 5电子天平(北京市宣武区天平厂)。
硅胶(粒径7 μm, 孔径30 nm, 兰州物理化学研究所); γ-GLDP(分析纯, 辽宁盖县化工研究所); 亚氨基二琥珀酸(纯度75%, 石家庄德赛化工试剂有限公司); EDTA(分析纯, 天津市华东试剂厂); 磷酸二氢钾(K2HPO4)以及其他试剂均为分析纯(西安化学试剂厂)。
牛血清蛋白质(BSA, 纯度95%)、核糖核酸酶(RNase, 纯度92%)和溶菌酶(Lys, 纯度95%)(美国Sigma公司)。用0.02 mol/L pH 6.0 K2HPO4(phosphate buffer, PB)缓冲液配制质量浓度均为2 g/L的BSA、RNase和Lys标准蛋白质混合液。
将10 g硅胶放入盛有50 mL 1.0 mol/L HCl的烧杯中, 用超声波振荡2~3 min。过滤并用水洗至中性, 将湿硅胶放入盛有100 mL 1.0 mol/L HNO3的烧杯中加热回流1 h。将溶液冷却, 用4号砂芯玻璃坩埚抽滤并用水洗至中性, 于90~100 ℃干燥4 h后待用。
取40 mL H2O置于圆底烧瓶中, 加入4.6 g IDS, 溶解后用1 g NaOH调节pH至10.0~11.0, 逐滴加入2 mL γ-GLDP, 放置1 h, 在65 ℃下不断搅拌反应12 h。
在IDS-GLDP中逐滴加入6 mol/L HCl使其pH为4.0。分别称取经酸处理的硅胶1.0、1.5、2.0、3.0和4.0 g加入其中, 超声2~3 min, 于90~95 ℃搅拌反应2 h, 冷却后过滤并依次用水、10%(v/v)HAc和水洗至中性, 于60 ℃干燥后即可得到IDS-Silica固定相。
称取1~2 mg干燥后的IDS-Silica固定相粉末, 用KBr粉末进行压片处理, 在400~4 000 cm-1范围内, 采用傅立叶红外光谱仪进行测试。
取上述合成好的IDS-Silica固定相1 g, 用20 mL异丙醇作溶剂混合后灌入装填柱中, 在40 MPa压力下自动装填20 min, 将其匀浆装入50 mm×4.6 mm不锈钢柱中。
准确称取1 g干燥的不同比例的IDS-Silica固定相(Silica与IDS的质量比分别为1.0:4.6、1.5:4.6、2.0:4.6、3.0:4.6和4.0:4.6), 分别用0.01 mol/L HCl浸泡12 h。抽滤后加入20 mL H2O和5 mL 1 mol/L的NaCl, 用0.1 mol/L的HCl调节pH至2.0。用0.010 0 mol/L的NaOH标准溶液进行酸碱电位滴定, 根据公式(1)计算出IDS的键合量qIDS:
c: NaOH标准溶液的浓度(mol/L); V1:空白滴定所消耗NaOH的体积(mL); V2:滴定IDS-Silica固定相所消耗NaOH的体积(mL); m:称取IDS-Silica固定相的质量(g); 3: NaOH与IDS酸碱滴定的物质的量比为3:1。
pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液:500 mL 10 mmol/L NaAc溶液用HAc调节pH至5.0。
5 mmol/L CuSO4的NaAc-HAc缓冲液(pH 5.0):将0.08 g CuSO4溶于100 mL pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液。
0.05 mol/L FeCl3、NiCl2、ZnSO4、CoCl2和Ca(NO3)2的NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5.0):将一定量的FeCl3、NiCl2、ZnSO4、CoCl2和Ca(NO3)2分别加到100 mL pH 5.0 NaAc-HAc缓冲溶液中。
将装填好的IDS-Silica柱(50 mm×4.6 mm)连接于色谱系统。先用H2O冲洗柱子, 再用pH 5.0 NaAc-HAc缓冲液平衡色谱柱。然后以0.5 mL/min的流速将5 mmol/L CuSO4的NaAc-HAc缓冲液(pH 5.0)注入色谱柱, 直至饱和。静置30 min, 再依次用H2O和0.02 mol/L的PB缓冲液洗去未螯合的金属Cu2+(以Na2S检验), 最后用H2O洗去填料上残余的PB缓冲液。
用0.05 mol/L EDTA溶液洗涤固定的金属Cu2+, 依次换用0.05 mol/L FeCl3、NiCl2、ZnSO4、CoCl2和Ca(NO3)2的NaAc-HAc缓冲溶液(pH 5.0), 重复上述步骤, 完成金属Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+和Ca2+的固定。
采用Silica:IDS质量比为1.5:4.6合成的IDS-Silica柱和固定了金属Cu2+的IDS-Cu(Ⅱ)-Silica柱对BSA、RNase和Lys标准蛋白质混合物进行色谱分离实验。
色谱条件:色谱柱为IDS-Silica柱(50 mm×4.6 mm)和IDS-Cu(Ⅱ)-Silica柱(50 mm×4.6 mm)。流动相:A相为0.02 mol/L pH 6.0 PB缓冲溶液, B相为0.02 mol/L pH 6.0 PB缓冲溶液+0.5 mol/L pH 6.0 NaCl溶液。线性梯度洗脱程序:20 min内B相从0增至100%。流速:1 mL/min; 检测波长:280 nm; 进样量:10 μL。
用0.05 mol/L EDTA将固定在IDS-Silica填料上的金属Cu2+、Fe3+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+洗脱下来, 洗脱液收集在50 mL容量瓶中, 定容至刻度线, 采用ICP-AES法测定固定相上键合金属离子的浓度。
将测得的金属离子质量浓度带入公式(2), 即可求得固定金属离子在IDS-Silica固定相上的键合量qMetal ion:
式中, Cm:金属离子的键合质量浓度(mg/L); V:定容体积(50 mL); m:称取IDS-Silica固定相的质量(g); M:金属离子的摩尔质量(g/mol)。
固定相通常由3部分组成, 即基质、间隔臂和配体。作为基质与配体的偶联剂, 间隔臂不仅可活化基质, 还可为配体提供较大的空间自由度。此外, 间隔臂的长度及化学结构会影响到配体与目标分子间的作用力, 从而导致目标分子的色谱行为发生变化[14]。间隔臂一般选择末端具有能与配体形成共价键的活性基团, 如环氧基。γ-GLDP毒性低, 亲水性好, 偶联配基后结构稳定。因此本研究采用Silica为基质, γ-GLDP为间隔臂, IDS为配体, 按照图 2的合成路线制备出IDS-Silica固定相。
IDS配体在硅胶基质上的键合可分为直接法和间接法。直接法是在酸性介质条件下, 硅胶首先与间隔臂γ-GLDP反应生成环氧硅胶, 再在碱性条件下与IDS键合。该法的最大缺陷是第一步反应的产物环氧硅胶在碱性条件下会发生溶失, 造成IDS键合量偏低, 从而不利于IDS-Silica固定相的制备。为了克服上述不足, 本研究采用间接合成法, 在碱性条件下先让IDS与γ-GLDP反应生成IDS-GLDP, 再在酸性条件下与硅胶键合, 从而避免了硅胶的溶失, 提高了IDS在硅胶基质上的键合量。
为了考察IDS在硅胶基质上的键合情况, 对合成的IDS-Silica固定相进行红外光谱扫描, 结果如图 3所示, IDS-Silica红外光谱图中3 476 cm-1处的强宽峰为羟基和羧基的伸缩振动吸收峰; 2 996和3 046 cm-1处的峰是甲基的对称和反对称伸缩振动吸收峰; 2 869和2 931 cm-1处的峰是亚甲基的对称伸缩振动和反对称伸缩振动吸收峰; 1 989和1 873 cm-1处的峰可能是γ-GLDP中的C-O受到硅胶和IDS的作用而产生的反对称伸缩振动峰; 1 730和1 631 cm-1处的峰是羧基中C=O的伸缩振动峰; 1 406 cm-1处的峰是C-H的弯曲振动吸收峰; 1 262 cm-1处的峰是C-N的伸缩振动吸收峰; 1 004 cm-1处左右是Si-O-Si和C-O的伸缩振动峰; 840 cm-1处的峰是Si-C的振动吸收峰。红外光谱结果表明, 通过间隔臂γ-GLDP, 配体IDS已成功键合在硅胶基质上。
合成反应过程中, 反应物的浓度、反应物用量配比、反应温度以及反应时间都会影响IDS-Silica固定相的合成。在反应物的浓度、反应温度等其他反应条件已优化的前提下, 重点考察了IDS配体与硅胶基质用量比对固定相合成的影响。按照Silica与IDS质量比为1.0:4.6、1.5:4.6、2.0:4.6、3.0:4.6和4.0:4.6的配比, 合成了5种不同的IDS-Silica固定相, 采用酸碱电位滴定法测定了固定相上配体IDS的键合量, 结果见图 4。所有滴定曲线均只有一个突跃。这是因为IDS是一个四元弱酸[15], IDS的酸碱离解常数Ka分别为Ka1=1.10×10-3; Ka2=1.45×10-4; Ka3=1.48×10-5; Ka4=7.59×10-11。由其Ka值可知, 该酸中的4个质子只有3个可以被直接滴定, 且有3个等当点; 由于其Ka值差别较小, 3个可以被滴定的质子无法实现分步滴定, 因此有一个突跃。此外, Silica与IDS分别为1.5 g和4.6 g时, 固定相的突跃明显要优于其他配比制成的固定相, 说明当硅胶的用量为1.5 g时, IDS在固定相上的键合量最大。为了进一步论证该结论, 根据图 4中的滴定曲线, 按照公式(1)计算出了不同比例下IDS的键合量, 结果如表 1所示。
由表 1可知, 当硅胶的用量小于1.5 g时, 随着用量的增加, IDS的键合量增大; 当硅胶的用量大于1.5 g时, 随着用量的增加, IDS的键合量反而减小。综上所述, 基质、间隔臂和配体的最适配比为m(Silica):V(γ-GLDP):m(IDS)=1.5 g:2.0 mL:4.6 g, 后续试验所用的固定相均按照该比例合成。
由图 1配体分子结构式可知, IDS是一个四元弱酸(H4L)。由IDS的离解常数(pKa1=2.96±0.05; pKa2=3.84±0.02; pKa3=4.83±0.05; pKa4=10.12±0.04)[15]可知, 在流动相溶液中, IDS的存在形式为:H4L、H3L-、H2L2-、HL3-。当流动相缓冲溶液的pH为6.0时, HL3-为IDS的主要存在形式。因此, IDS可近似看作一个三元的弱阳离子交换剂。此外, 配体中的N原子和O原子可作为配位原子为金属离子提供孤对电子, 从而固定金属离子。因此, 用IDS作配基不固定金属离子时可作为阳离子交换剂分离一些在溶液中带正电荷的蛋白质; 固定金属离子后可作为金属螯合柱分离一些对金属螯合配体有亲和力的蛋白质。
图 5为蛋白质在未固定金属Cu2+的IDS-Silica柱和固定了金属Cu2+的IDS-Cu(Ⅱ)-Silica柱上的色谱图。可知当未固定金属Cu2+时, 3种蛋白质BSA(等电点pI=4.9)、RNase(pI=8.7)和Lys(pI=11.0)在IDS-Silica柱上表现为BSA不保留, RNase和Lys的保留时间按照各自等电点递增的顺序依次增大, 并且3种蛋白质得到了有效的分离。这是因为当流动相pH值为6.0时, 酸性蛋白质BSA带负电荷, 不与同样带负电荷的IDS(主要以HL3-形式存在)发生静电吸附作用, 因而在1 min内流出, 表现为不保留; 碱性蛋白质RNase和Lys均带正电荷, 且随着等电点的增加正电性增强, 更容易与带负电荷的IDS发生静电吸附, 因而保留时间按照等电点递增的顺序增大。上述结果表明, 不固定Cu2+的IDS-Silica柱显示出典型的阳离子交换特征。若在IDS-Silica裸柱上引入金属Cu2+, BSA、RNase和Lys在IDS-Cu(Ⅱ)-Silica柱上均不被洗脱, 这是固定金属Cu2+与蛋白质发生亲和配位的结果。因此, 需要进一步通过使用一定浓度的竞争剂(如甘氨酸, Gly和咪唑, Imid)对蛋白质进行较好的洗脱与分离。
如图 6所示, 当引入金属Mn+时, IDS-Silica固定相与金属Mn+形成金属螯合固定相IDS-Mn+-Silica。为了进一步考察IDS-Silica固定相的金属离子螯合特性, 采用离线前沿色谱与ICP-AES相结合的方法, 测定了Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+等金属离子在IDS-Silica柱上的键合量, 结果见表 2。可以看出, IDS-Silica填料与不同金属离子键合时, 金属离子与配体IDS的键合量大小满足:Fe3+＞Cu2+＞Ni2+＞Zn2+＞Co2+＞Ca2+。金属离子与配体键合量的大小通常与配合物的稳定性相关:配合物的稳定性越高, 则键合量越大。金属离子与配体稳定性的大小又与金属离子的半径和电荷数相关:金属离子所带电荷越多, 半径越小, 中心离子的电场强度越大, 越容易形成螯合物, 且螯合物越稳定[16]; 当金属离子具有相同电荷时, 半径越小, 键合作用越强, 与配体形成的螯合物越稳定。在考察的金属离子当中, Fe3+、Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+的离子半径分别为65、69、72、74、74和100 pm, 其中Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+、Ca2+均为二价金属离子, 因此半径越小越有利于金属离子的键合。Fe3+的电荷数为三价, 与其他金属离子不同, 且半径小于其他金属离子, 故Fe3+与IDS的键合量最大。由此可知, 试验结果与理论分析一致。
此外, 我们还将金属Cu2+在IDS-Silica柱上的键合量与其在IDA-Silica柱、L-Glu-Silica柱[5]和L-Asp-Silica柱上的键合量[6]进行了比较, 结果见图 7。
通常情况下, 配体与金属离子的络合稳定常数越大, 金属离子在配体上的键合量就越高。由图 7可知, 在相同的键合条件下, 金属Cu2+在IDS-Silica柱、IDA-Silica柱、L-Asp-Silica柱和L-Glu-Silica柱上的键合量依次减少, 并且金属Cu2+在IDS-Silica柱上的键合量明显要优于其他氨羧类配体。这是由于IDS是一个含有5个配位原子的五齿螯合剂, 而IDA、L-Asp和L-Glu均为三齿螯合剂。理论上, 螯合剂的齿数越多, 与金属离子形成的金属络合物的稳定性就越大。试验结果表明, 金属Cu2+在不同配体硅胶柱上的键合量顺序与金属Cu2+在其上络合稳定常数的变化规律一致, 即:lg KIDS-Cu(Ⅱ)=13.10[17]＞lg KIDA-Cu(Ⅱ)=10.62[5, 6]＞lg KL-Asp-Cu(Ⅱ)=8.57[6]＞lg KL-Glu-Cu(Ⅱ)=8.20[5]。由此可见, IDS具有较强的金属螯合能力和稳定性, 对今后IDS作为配体制备高强度IMAC柱奠定了基础, 为解决IMAC中金属离子的流失提供了保障。
IDS是一种用于工业废水中去除重金属离子的常用绿色螯合剂, 其对金属离子的强螯合性可与EDTA相媲美。为了提高IDS对废水中金属离子的去除效率, 在本研究中, 按照自行设计的合成方法将IDS螯合剂键合到硅胶单体上, 成功地制备出一种新型的多齿配体-硅胶色谱介质。论证了该新型色谱介质的多功能性, 初步探讨了IDS-Silica对金属离子的强螯合特性。后续的研究将充分利用上述优良特性, 进一步研究IDS-Silica柱用于食品、石油化工、纺织工业、造纸等多个工业领域废水中重金属离子的去除, 并与IDS螯合剂的去除效果进行对比, 论证IDS-Silica柱的有效性, 拓展该新型色谱介质的应用领域; 进一步研究固定了金属离子后的IDS-Mn+-Silica, 即新型IMAC柱在蛋白质质分离纯化过程中稳定性的研究, 以期缓解甚至克服长期困扰研究人员的IMAC柱上固定金属离子流失的问题。
2017,
Vol. 35 Issue (11): 1113-1119
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