色谱  2017, Vol. 35 Issue (11): 1129-1136   PDF    
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秦富
邓全道
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QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法快速测定罗汉果中55种杀菌剂
秦富1 , 邓全道2 , 李湧1 , 黄大新1 , 汪文龙1     
1. 广西出入境检验检疫局检验检疫技术中心, 广西 南宁 530021;
2. 桂林出入境检验检疫局, 广西 桂林 541004
收稿日期：2017-07-23
基金项目：广西壮族自治区科技创新能力与条件建设计划项目（14123006-15，1598025-1）
通讯联系人：汪文龙, E-mail:1224509828@qq.com
摘要：建立了广西名优特产罗汉果中55种杀菌剂残留的QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）检测方法。试样经1%（v/v）醋酸乙腈提取后，加入无水硫酸镁脱水，并使用无水硫酸钠、N-丙基乙二胺（PSA）和C18进行净化。采用均含有0.005 mol/L甲酸铵及0.01%（v/v）甲酸的95%（v/v）乙腈水溶液和水作为流动相中的有机相和水相进行梯度洗脱，在电喷雾离子源正离子模式（ESI+）下采用动态多反应监测（DMRM）进行扫描，基质匹配外标法定量。55种杀菌剂在1.0~100.0 μg/kg范围内线性相关性良好，相关系数（R2）>0.99；方法的检出限（S/N>3）为1.0 μg/kg，定量限（S/N>10）为10.0 μg/kg；加标（10.0 μg/kg）回收率为76.96%~118.45%，相对标准偏差为3.44%~19.63%（n=6）。该法快速、准确、灵敏，适合高通量检测罗汉果中的杀菌剂残留。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    QuEChERS    动态多反应监测    杀菌剂    罗汉果    
Rapid determination of 55 fungicides in siraitia grosvenoriis by QuEChERS and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
QIN Fu1, DENG Quandao2, LI Yong1, HUANG Daxin1, WANG Wenlong1     
1. Inspection and Quarantine Technology Center of Guangxi Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Nanning 530021, China;
2. Guilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Guilin 541004, China
Foundation item: Science and Technology Innovation Capability and Conditional Construction Plan of Guangxi Zhuang Autonomous Region (Nos. 14123006-15, 1598025-1)
Abstract: A method for the determination of 55 fungicides in siraitia grosvenoriis by QuEChERS and high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS) was established. The samples were extracted with acetonitrile containing 1%(v/v) acetic acid, then dehydrated by anhydrous magnesium sulfate and purified by anhydrous sodium sulfate, N-propyl ethylenediamine (PSA) and C18. Then, 95% (v/v) acetonitrile aqueous solution (organic phase) and water (aqueous phase), both containing 0.005 mol/L ammonium formate and 0.01% (v/v) formic acid, were used as mobile phases with gradient elution. The compounds were tested by positive electrospray ion source (ESI+) and dynamic multiple reaction monitoring (DMRM) mode. Fifty-five fungicides were quantified by external standard method considering matrix effects. The correlation coefficients (R2) were greater than 0.99, which indicated that the linear dependence of the 55 fungicides were good in the range of 1.0-100.0 μg/kg. The LODs (S/N>3) and LOQs (S/N>10) of all the fungicides were 1.0 μg/kg and 10.0 μg/kg, respectively. The recoveries were in the range of 76.96%-118.45% and the relative standard deviations (RSDs) ranged from 3.44% to 19.63% (n=6). This method has the advantages of rapidity, accuracy and sensitivity for the high-throughput detection of fungicides residues in siraitia grosvenoriis.
Key words: high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     QuEChERS     dynamic multi-reaction monitoring (DMRM)     fungicides     siraitia grosvenoriis    

罗汉果作为葫芦科多年生藤本植物主要产于广西壮族自治区桂林市永福县和龙胜县, 是广西著名的特产植物及大宗经济作物, 同时也是国家首批批准的药食两用名贵中药材之一。罗汉果作为民间用药已有300多年历史, 不仅具有清热润肺、镇咳祛痰的功效, 还有抗氧化、降血糖、增强免疫力等作用[1]。此外, 罗汉果中含有丰富的罗汉果甜苷, 其甜味是蔗糖的300倍, 是生产甜味剂的重要原料, 是蔗糖的最佳替代品, 具有巨大的经济价值。正是因为罗汉果具有良好的药用价值和巨大的经济效益, 我国罗汉果种植面积和产量逐年增加。然而, 由于近年来罗汉果的种植面临严重的病虫危害, 导致在种植过程中使用农药的种类和数量大范围增加。杀菌剂是用于防治由各种病原微生物引起的植物病害的一类农药, 因其具有安全、广谱、内吸性强和预防效果突出等特点而被广泛应用于罗汉果的种植过程中[2]。但是超量不合理地使用杀菌剂不仅会通过食物链对生物体造成危害, 还会造成水和土壤的污染。因此, 对罗汉果中杀菌剂等农药残留的检测方法和监控技术的开发显得尤为重要。

目前, 针对罗汉果中农药残留检测方法的报道较少。王梦月等[3]建立了气相色谱同时测定罗汉果中10种有机氯农药残留的方法; 付明磊等[4, 5]先后建立了HPLC-MS检测罗汉果中10种氨基甲酸酯类农药和GC-MS测定罗汉果中8种有机氯农药残留的方法。然而, 这些方法均采用传统的固相萃取或液液萃取的前处理净化方法, 其检测范围受限, 不适用于高通量检测罗汉果中的农药残留。目前, 高通量检测蔬菜及水果中农药多残留的最有效和快速的前处理净化方法是QuEChERS法[6]。QuEChERS方法具有快速、方便、高效、经济和安全等特点, 已被广泛应用于蔬菜、水果等不同基质中的多农药残留检测[7-9]。

本研究通过优化QuEChERS方法中不同填料的组合, 对罗汉果样品进行快速前处理, 建立了高效液相色谱-三重四极杆串联质谱快速同时检测罗汉果中55种杀菌剂类农药残留的方法。该法高效、快速、灵敏、安全, 为广西名优特产罗汉果的种植生产及其出口贸易中农药残留风险的监测提供了技术手段。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Agilent 1260-6410B液相色谱-三重四极杆串联质谱仪、ZORBAX Eclipse Plus-C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm)(美国Agilent公司); XS204电子天平(瑞士Mettler toledo公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); KL512J氮气浓缩装置(北京康林科技有限公司); SA300多功能振荡器(日本Yamato公司); GM200刀式混合研磨仪(德国Retsch公司); FA25高速组织分散机(德国Fluko公司)。

杀菌剂农药混合标准品(100 mg/L)购自美国Agilent公司, 批号分别为LC23289、LC22982、LC22983、LC22984、LC23294、LC22986、LC23292和LC23293。乙腈、甲醇、环己烷、乙酸乙酯、甲酸、乙酸、乙酸铵、甲酸铵均为色谱纯, 无水硫酸钠(Na2SO4)、无水硫酸镁(MgSO4)、无水醋酸钠均为分析纯, 均购自美国Tedia公司; C18(40~63 μm)、N-丙基乙二胺(PSA, 40~63 μm)和石墨化炭黑(GCB)均购自德国CNW公司。

用甲醇将杀菌剂混合标准溶液稀释, 配制质量浓度为10 mg/L的标准储备液, 于-20.0 ℃保存; 用乙腈-水(3 : 2, v/v)溶液稀释, 分别配制质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的标准工作液。

1.2 样品前处理
1.2.1 提取

将新鲜的罗汉果样品切碎后, 用刀式混合研磨仪制成细碎均匀的混合试样, 称取10 g试样, 置于50 mL离心管中, 加入10 mL含1%(v/v)醋酸的乙腈溶液, 用高速组织分散机匀浆提取1 min, 然后加入4 g无水硫酸镁和1 g无水醋酸钠, 混合振摇30 min, 以4 000 r/min离心5 min, 移取2 mL上清液, 置于15 mL离心管, 待净化。

1.2.2 净化

移取2 mL上清液, 加入预先充分混合均匀的混合填料(1.0 g Na2SO4、0.3 g PSA和0.2 g C18), 涡旋振荡30 s后, 以4 000 r/min离心5 min, 重复2次, 移取上清液1 mL, 于45 ℃水浴中氮吹至干, 残渣用1 mL乙腈-水(3 : 2, v/v)溶液定容, 过0.22 μm有机滤膜, 待测。

1.3 分析条件
1.3.1 色谱条件

色谱柱:ZORBAX Eclipse Plus-C18柱; 柱温:55 ℃; 进样体积:5 μL; 流动相A:含0.005 mol/L甲酸铵和0.01%(v/v)甲酸的95%(v/v)乙腈水溶液; 流动相B:含0.005 mol/L甲酸铵和0.01%(v/v)甲酸的水。梯度洗脱程序见表 1, 并设置后运行时间(post time)为4 min。

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution process
1.3.2 质谱条件

离子源为ESI源, 正离子模式; 动态多反应监测(DMRM)模式扫描; 毛细管电压为4 000 V; 脱溶剂气温度为350 ℃; 脱溶剂气流量为12 L/min; 雾化器压力为0.34×106 Pa。55种杀菌剂的DMRM质谱参数见表 2。

表 2 55种杀菌剂的质谱参数和保留时间(tR) Table 2 MS parameters and retention times (tR) of the 55 fungicides
1.4 定量方法

采用基质匹配外标法定量, 在空白罗汉果基质中添加适量的农药标准品，配制成系列标准工作溶液后进行检测, 并绘制基质标准曲线。采用Agilent MassHunter软件对检测结果进行定量分析。

1.5 统计学方法

采用统计软件SPSS 16.0对检测数据进行统计分析, 两组比较采用T检验, 多组比较采用方差分析, 当P＜0.05时, 差异具有统计学意义。

2 结果与讨论
2.1 质谱条件的优化

参照食品法典委员会(CAC)和欧盟(EU)关于分析方法评价和结果解释决议中的有关规定[10], 对55种杀菌剂进行ESI+模式下的选择离子监测(SIM)扫描。通过优化每种化合物的碰撞能量和源内碎裂电压等质谱条件, 选择响应较强、干扰较小的1个母离子和2个子离子(每个诊断离子的S/N＞3)。结果显示, 55种杀菌剂中除了恶唑菌酮和咯菌腈两种化合物的母离子加合方式为[M+NH4]+, 其余53种杀菌剂的母离子加合方式均为[M+H]+。对质谱采集的动态扫描时间进行优化来确保每个化合物能够采集到足够的点数, 以获得较理想的峰形和较高的响应值。最终成功建立55种杀菌剂动态多反应监测的质谱方法, 具体参数见表 2。

2.2 不同填料组合净化效果的比较

QuEChERS方法中用于净化的填料主要包括MgSO4、Na2SO4、C18、PSA和GCB。MgSO4和Na2SO4主要用于脱去基质中过量的水分, 同时诱导液液分层; C18主要用于除去试样中的脂肪和酯类等非极性干扰物; PSA主要吸附基质中的碳水化合物、脂肪酸、有机酸、酚类和少量的色素; GCB可以有效地去除色素、甾醇类和非极性干扰物。由于GCB对平面结构化合物具有较强的吸附作用, 许多研究在使用GCB作为净化填料时, 均发现GCB会使某些具有平面结构农药的回收率降低[11-13]。因此, 使用GCB对罗汉果试样进行净化可能会影响相关杀菌剂的回收率。为了研究分析不同填料组合对罗汉果中55种杀菌剂回收率的影响, 本研究选择Na2SO4、C18、PSA和GCB作为填料, 参照张爱芝等[9]的研究获得的最优质量比配制T1、T2、T3和T4 4组混合填料:T1=1.0 g Na2SO4, T2=1.0 g Na2SO4+0.3 g C18, T3=1.0 g Na2SO4+0.3 g C18+0.2 g PSA, T4=1.0 g Na2SO4+0.3 g C18+0.2 g PSA+0.1 g GCB。然后, 分别采用这4组混合填料对相同的罗汉果加标试样(10.0 μg/kg, 每组4个平行)进行净化处理(每2 g基质提取液加入1份混合填料)。使用乙腈-水(3 : 2, v/v)配制质量浓度为1.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的标准溶液以制作溶剂标准曲线, 不同组别的加标试样检测结果均使用该溶剂曲线统一定量分析并计算回收率。

4组混合填料的直观净化效果比较显示, 随着填料种类的增加, 其净化液越来越澄清(见图 1), 说明净化效果越好, 并提示C18、PSA和GCB在罗汉果前处理过程中都发挥了相应的吸附除杂效果。对4组填料下55种杀菌剂的回收率进行了比较, 结果见图 2。T2组与T1组比较, T2组与T1组的差异不明显; T3组与T1组比较, T3组中联苯三唑醇、多菌灵等17种杀菌剂的回收率明显高于T1组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 其他杀菌剂的回收率无明显差异; T4组与T3组比较, T4组中多菌灵、嘧菌环胺、噻菌灵等20种杀菌剂的回收率明显低于T3组, 差异具有统计学意义(P＜0.05), 只有恶唑菌酮的回收率高于T3组, 其他杀菌剂的回收率无明显差异。

图 1 4组混合填料的净化效果 Fig. 1 Purification effects of the four groups of mixed adsorbents T1: Na2SO4 (1.0 g); T2: Na2SO4+C18 (1.0 g+0.3 g); T3: Na2SO4+C18+PSA (1.0 g+0.3 g+0.2 g); T4: Na2SO4+C18+PSA+GCB (1.0 g+0.3 g+0.2 g+0.1 g).

图 2 4组混合填料净化后55种杀菌剂(10 μg/kg)的加标回收率 Fig. 2 Recoveries of the 55 spiked fungicides (10 μg/kg) after cleaning up with four mixed adsorbents * P < 0.05, compared with group T1; # P < 0.05, compared with group T3.

结果提示, 使用Na2SO4+C18+PSA (1.0 g+0.3 g+0.2 g)填料组合(T3组)的净化方案能有效提高罗汉果中55种杀菌剂的回收率, 故选为实验所用。而在净化填料中添加GCB严重影响了多菌灵、嘧菌环胺、烯唑醇、乙菌定、嘧菌胺、百克敏、嘧霉胺、噻菌灵和三环唑的回收率。由于这些杀菌剂均具有平面结构, 而GCB对平面结构化合物具有较强的亲和力进而降低了这些杀菌剂的回收率, 该研究结果与万建春等[13]的研究结果相一致。

2.3 液相色谱的分离

使用本研究优化的质谱参数及前处理方法进行加标试验, 使用乙腈-水(3 : 2, v/v)溶液作为定容溶液, 选择ZORBAX Eclipse Plus-C18柱, 采用均含有0.005 mol/L甲酸铵及0.01%(v/v)甲酸的95%(v/v)乙腈水溶液和水作为流动相的有机相和水相进行梯度洗脱。55种杀菌剂在15 min内均获得较好分离, 其峰形和信噪比均较理想。添加水平分别为1.0 μg/kg和10.0 μg/kg时的55种杀菌剂的总离子流色谱图(TIC)见图 3。

图 3 55种杀菌剂在加标水平为(a)1.0 μg/kg和(b)10.0 μg/kg时的总离子流色谱图 Fig. 3 Total ion chromatograms (TIC) of the 55 fungicides spiked at (a) 1.0 μg/kg and (b) 10.0 μg/kg in standard solutions
2.4 基质效应的评价

基质效应(matrix effect, ME)是指在样品测试过程中, 目标化合物以外的其他物质直接或间接影响质谱检测的现象。基质中的共流出组分会影响分离并干扰目标化合物的离子化, 引起目标化合物检测信号的减弱或增强, 最终影响定量的准确性。因此对基质效应进行评价并降低基质效应是至关重要的, 降低基质效应的有效途径主要是通过优化前处理方法来减少基质成分进入检测体系。目前一般采用空白样品前处理净化后添加标准品的方法[14, 15]来评定基质效应, ME=(B-A)/A×100%(A和B分别为溶剂和基质标准曲线的线性方程斜率)。︱ME︱＜10%提示基质效应较小, 可用溶剂标准曲线进行定量; 10%＜︱ME︱＜50%提示基质效应较大, 需要用基质标准曲线进行定量以消除基质效应对结果的影响; ︱ME︱＞50%提示基质效应很强, 严重影响定量, 需要重新优化样品前处理方法。

本研究首先将空白罗汉果样品按预定的前处理方法进行提取、净化和定容后获得空白基质提取液。然后分别使用该提取液和定容液将55种杀菌剂混合标准储备液配制成1.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/L的系列标准工作液, 在相同条件下进行检测, 最后分别建立基质标准曲线和溶剂标准曲线。要求每种化合物满足两条标准曲线的线性相关系数R12和R22均>0.98, 并计算55种杀菌剂在罗汉果样品中的ME值。结果显示, 55种杀菌剂的ME值均在±10% ~±50%之间(见表 3), 提示在本研究中使用基质匹配外标法均可以准确定量55种杀菌剂的残留量。

表 3 55种杀菌剂的基质效应、线性方程、相关系数、回收率和相对标准偏差 Table 3 Matrix effects (MEs), linear equations, correlation coefficients (R2), recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the 55 fungicides
2.5 线性关系、准确度、检出限和定量限

在罗汉果试样中分别按1.0、5.0、10.0、20.0、50.0和100.0 μg/kg的加标水平添加55种杀菌剂的混合标准溶液, 进行加标试验, 每个添加水平设置6个平行样, 在相同条件下进行提取、净化和检测, 并用基质匹配外标法进行定量和统计分析。结果显示, 55种杀菌剂在1.0~100.0 μg/kg范围内线性相关性良好, R2>0.99;加标水平为10.0 μg/kg时的加标回收率为76.96% ~118.45%, 相对标准偏差为3.44% ~19.63%。以满足信噪比(S/N)＞3的最小加标水平作为方法的检出限(LOD), 以满足S/N＞10并且添加回收率的RSD(n=6)≤20%的最小加标水平作为定量限(LOQ)[10]。结果显示, 55种杀菌剂的LOD均为1.0 μg/kg, LOQ均为10.0 μg/kg。提示本方法检测罗汉果中55种杀菌剂残留的灵敏度、准确度和精密度均能满足欧盟指令《食品和饲料中农药残留方法验证和质量控制程序》[16]的要求。

3 结论

本研究以广西名优特产罗汉果为样本, 以其种植过程中常使用的55种杀菌剂为分析对象, 成功建立了能够同时检测罗汉果中55种杀菌剂残留的QuEChERS-高效液相色谱-串联质谱法。该方法快速、准确、灵敏, 适合高通量检测罗汉果中的杀菌剂残留, 且能为罗汉果种植生产及出口贸易中杀菌剂类农药残留的监测提供可靠的技术手段, 为制定广西名优特产罗汉果中农药残留检测地方标准提供理论依据。

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