茶树中的化合物具有多种生理活性, 如抗氧化、抗肿瘤、抑菌、增强免疫力、保护心血管系统等, 其中起主要作用的是茶多酚^[1-3]。儿茶素类化合物占茶多酚总量的70% ~80%, 可达到茶鲜叶干重的13% ~20%, 其组成成分会随着茶树种类、茶树发育阶段以及茶叶加工方法的不同而有明显变化^[4]。茶叶鲜叶中表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-gallate, EGCG)的含量通常是最高的, 其他的主要儿茶素类化合物包括表儿茶素没食子酸酯(epicatechin-3-O-gallate, ECG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin, EGC)和表儿茶素(epicatechin, EC)。茶树鲜叶中其他常见但含量较低的儿茶素类包括没食子儿茶素没食子酸酯(gallocatechin-3-O-gallate, GCG)、儿茶素没食子酸酯(catechin-3-O-gallate, CG)、没食子儿茶素(gallocatechin, GC)和儿茶素(catechin, C)^{[5, 6]}。此外, 在一些乌龙茶和绿茶品种中还能检测到甲基化儿茶素, 如表没食子儿茶素3-O-(3-O-甲基)没食子酸酯(epigallocatechin-3-O-(3-O-methyl) gallate, EGCG3″Me)等, 其具有很强的抗过敏活性^{[7, 8]}。通过研究儿茶素类化合物的分离纯化方法, 制备出高纯度的儿茶素类单体, 对于它们的功能活性研究具有重要意义。

目前分离儿茶素类化合物的方法主要有溶剂萃取法、离子沉淀法、柱色谱分离法等^[9-15]。溶剂萃取法和离子沉淀法所用的试剂和设备简单, 对于性质差异明显的物质可以有较好的分离效果, 但无法分离性质相近的儿茶素类化合物。Chen等^[9]使用两步AlCl₃沉淀把茶叶中总儿茶素类化合物的纯度由64.5%提高到94.7%, 但是仅作为粗提的方法, 无法分离儿茶素类单体。柱色谱分离法是一种有效的分离方法, 可以分离出纯度较高的儿茶素类单体, 选用的柱填料有聚酰胺树脂、大孔树脂、硅胶、C18等^[10-14]。Wang等^[10]分别用聚酰胺树脂和大孔树脂进行了第一次和第二次纯化, 得到的EGCG最终纯度为95.14%, 总回收率为61.59%; Jin等^[12]做了类似的工作, 得到的EGCG最终纯度为95.1%, 总回收率为63.7%; Kang等^[14]使用C18作为填料, 从5 g干茶中分离得到EGCG的质量为121.3 mg, 纯度为98%。另外, 近年来发展的模拟移动床色谱法和高速逆流色谱法可用于制备高纯度的EGCG^{[16, 17]}。Wang等^[16]采用模拟移动床色谱法分离得到EGCG的回收率为99.85%, 纯度为97.8%; Xia等^[17]采用高速逆流色谱法分离100 mg儿茶素粗提物, 得到的EGCG、EGC和EC的质量(纯度)分别为27 mg(98.8%)、14 mg(94.7%)和9.3 mg(97.5%)。但是, 这两种方法的设备成本较高, 操作复杂, 实际应用受到限制。半制备高效液相色谱(semi-preparative HPLC)有着高效、低成本的特点, 被广泛应用于天然产物的分离纯化中^[18-20]。但是由于天然产物的复杂性, 在单次的分离中想要达到良好的分离有一定的困难。所以在半制备色谱之前常用液液萃取或者离子沉淀的方法对样品进行预处理^[21]。

之前的研究多关注茶叶中EGCG的分离, 并且得到的纯度大多低于98%。本研究先采用离子沉淀法初步提取茶多酚, 去除了大部分干扰杂质, 第一次在甲醇(含0.1%(v/v, 下同)甲酸)-水(含0.1%甲酸)溶液为流动相的条件下, 采用半制备色谱法分离得到纯度＞99%的EGCG; 对低纯度物质(C、EC, 纯度＜90%)进行第二次制备, 在乙腈(含0.1%甲酸)-水(含0.1%甲酸)溶液为流动相的条件下分离纯化, 得到纯度99%以上的C、EC等。经过两步的半制备色谱法, 可同时得到纯度较高的7种儿茶素类化合物(GC、EGC、C、EGCG、EC、EGCG3″Me和ECG), 具体结构式见图 1。该方法可应用于不同茶树鲜叶中儿茶素类化合物的分离制备, 且具有快速、方便的优点, 可制备高纯度的儿茶素类单体, 用于后续的功能活性研究。

图 1

Fig. 1

图 1 7种儿茶素类化合物的结构式 Fig. 1 Chemical structures of the seven catechin compounds

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

Prep 150LC制备型液相色谱仪(配有2998型二极管阵列检测器)、SYNAPT G2-Si超高效液相色谱-四级杆飞行时间串联质谱仪(UPLC-QTOF MS, 配有ACQUITY二极管阵列检测器)(美国Waters公司); JNM-ECZ400S/L1核磁共振仪(日本JEOL公司); R-215旋转蒸发仪(瑞士BUCHI公司); Freezone 77540冷冻干燥仪(美国Labconco公司); KQ-300GDV超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

GC、EGC、C、EGCG、EC、ECG标准品均购自美国Sigma公司, 纯度≥98%。制备型液相色谱仪分析用甲醇和甲酸(色谱纯)购自德国Merck公司; 超高效液相色谱-高分辨质谱联用仪分析用甲醇和乙腈(质谱纯)购自美国Sigma公司; 核磁共振仪用氘代丙酮(acetone-d₆)购自美国Cambridge Isotope Laboratories; 实验用纯水由Milli-Q超纯水器(美国Millipore公司)制备。样品前处理用甲醇、甲酸、氯仿、碱式醋酸铅、碳酸氢钠和乙酸乙酯均为分析纯, 购自中国国药集团化学试剂有限公司。茶叶鲜叶(铁观音、肉桂、福鼎大白)采集于福建农林大学茶山(2016年11月1日), 其中铁观音和肉桂为乌龙茶品种, 福鼎大白为白茶品种。

1.2 标准溶液的配制

称取6种目标化合物GC、EGC、C、EGCG、EC和ECG的标准品各10.0 mg, 分别用甲醇(色谱纯)定容至10 mL, 配制1.0 g/L各化合物的标准储备液。分别移取6种标准储备液各50 μL, 混合, 加入700 μL甲醇(色谱纯), 配制质量浓度为50 mg/L的混合标准溶液, 用于SYNAPT G2-Si UPLC-QTOF MS分析。

1.3 多酚粗提物的制备

取100 g茶叶鲜叶在冰冻状态下粉碎, 加入1 L甲醇超声提取两次, 过滤后合并滤液, 于30 ℃低压旋蒸除去甲醇, 用0.2 L水复溶, 然后转移至分液漏斗中, 每次加入0.2 L氯仿萃取, 静置分层, 弃去下层氯仿层, 重复萃取3次。向水溶液中加入饱和碳酸氢钠, 调节pH至7.0, 加入10 g碱式醋酸铅粉末, 搅拌10 min, 以12 000 g离心10 min, 保留沉淀。向沉淀中加入200 mL水, 再加入5 mL甲酸, 调节pH至3.0, 使沉淀大部分溶解。将溶解的沉淀转移至分液漏斗中, 每次加入50 mL乙酸乙酯, 萃取3次, 合并上层乙酸乙酯层。转移乙酸乙酯层至旋蒸瓶中, 蒸干大部分乙酸乙酯和甲酸, 再经冷冻干燥得到多酚粗提物。加水复溶多酚粗提物, 经0.22 μm有机滤膜过滤, 供制备型HPLC分离纯化。

1.4 分析条件

1.4.1 制备级色谱条件

色谱柱:XBridge Prep C18柱(150 mm×19 mm, 5 μm, 美国Waters公司); 流速:16 mL/min; 检测波长:280 nm; 进样量:100 μL。

第一步制备条件:流动相A为0.1%甲酸水溶液; 流动相B为含0.1%甲酸的甲醇溶液。梯度洗脱程序为0~20.0 min, 5%B~40%B; 20.0~20.1 min, 40%B~100%B; 20.1~30.0 min, 100%B; 30.0~30.1 min, 100%B~5%B; 30.1~40.0 min; 5%B。取上述1.3节中的滤液经多次进样、收集目标峰, 合并相同保留时间的组分, 冻干称重。

低纯度的物质(＜90%, 经SYNAPT G2-Si UPLC-QTOF MS分析), 可经过第二步制备再次纯化。流动相条件:流动相A为0.1%甲酸水溶液, 流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱程序:0~20.0 min, 5%B~20%B; 20.0~25.0 min, 20%B~100%B; 25.0~35.0 min, 100%B; 35.0~35.1 min, 100%B~5%B; 35.1~45.0 min, 5%B。多次进样, 收集目标峰, 合并相同保留时间的组分, 冻干称重。

1.4.2 分析级色谱条件

色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3柱(100 mm×4.6 mm, 1.8 μm, 美国Waters公司); 流动相A为0.1%甲酸水, 流动相B为含0.1%甲酸的乙腈溶液; 流速为0.3 mL/min; 柱温为40 ℃。梯度洗脱程序:0~20.0 min, 1%B~99%B; 20.0~23.0 min, 99%B; 23.0~23.1 min, 99%B~1%B; 23.1~26.0 min, 1%B。检测波长为270 nm; 进样量为1 μL。

1.4.3 质谱条件

电离模式:ESI^-; 离子源温度:120 ℃; 脱溶剂气(N₂)流量:800 L/h; 脱溶剂气温度(N₂): 400 ℃; 锥孔电压:30 V; 毛细管电压:2.0 kV; 锥孔反吹气流量50 L/h; 扫描范围:m/z 50~1 200;扫描时间:0.2 s。

2 结果与讨论

2.1 前处理条件的考察

在茶叶的甲醇提取液中, 除了儿茶素类化合物外, 干扰物质叶绿素和咖啡碱的含量也较高。利用叶绿素、咖啡碱易溶于氯仿, 而儿茶素难溶于氯仿的性质差异, 用氯仿-水作为液液萃取的溶剂, 去除叶绿素、咖啡碱和其他的脂溶性成分, 以减少杂质的共沉淀。氯仿-水液液萃取后的水相利用饱和碱式醋酸铅将所有的多酚沉淀, 用甲酸复溶沉淀, 再利用乙酸乙酯萃取, 可将绝大部分的儿茶素类化合物萃取到乙酸乙酯层而将其他杂质留于水层, 有利于后续制备级HPLC色谱的分离。

2.2 儿茶素类化合物在制备色谱上的分离纯化

图 2为铁观音鲜叶中儿茶素类化合物第一步的制备色谱图, 采用甲醇-水作为流动相分离各目标化合物(峰1至峰7)。经SYNAPT G2-Si UPLC-QTOF MS分析, 与标准品的保留时间进行对比, 可以定性检测除峰6之外的其他儿茶素类化合物(见图 3)。采用面积归一法计算, 制备得到的GC(峰1)、EGC(峰2), EGCG(峰4)和ECG(峰7)的纯度分别为96.0%、95.7%、99.0%和99.5%。另外3种化合物, C(峰3)、EC(峰5)、峰6的纯度分别为33.5%、79.5%和88.7%, 结果并不令人满意。这是由于在较大进样量下, 它们与相邻峰的分离度较低造成的。所以, 第二步的制备过程中采用不同的流动相体系(乙腈-水)对C、EC和峰6物质进行分离, 结果见图 4。第二步的分离后, 3种物质的纯度分别提高到99.3%、99.8%和93.5%。

图 2

Fig. 2

图 2 铁观音鲜叶中儿茶素类化合物第一步的制备色谱图 Fig. 2 Preparative chromatogram of catechin compounds from fresh leaves of Tieguanyin tea by the first step 1. GC; 2. EGC; 3. C; 4. EGCG; 5. EC; 6. unknown; 7. ECG.

图 3

Fig. 3

图 3 第一步制备条件下7种儿茶素类化合物的色谱图 Fig. 3 Chromatograms of the seven catechin compounds by the first preparative step

图 4

Fig. 4

图 4 铁观音鲜叶中低纯度儿茶素类化合物(a)C、(b)EC和(c)图 2中峰6第二步的制备色谱图 Fig. 4 Preparative chromatograms of low-purity catechin compounds (a) C, (b) EC and (c) peak 6 in Fig. 2 from fresh leaves of Tieguanyin tea by the second step

2.3 峰6物质的鉴定

为了鉴定峰6的结构, 进行了SYNAPT G2-Si UPLC-QTOF MS和¹H NMR分析, 结果分别见图 5和图 6。对比峰6和EGCG的质谱图, 峰6母离子[M-H]^-的m/z为471.093 2, 而EGCG母离子[M-H]^-的m/z为457.077 3, 二者相差14.015 9, 也就是一个亚甲基-CH₂-; 碎片离子的m/z 183.029 8与EGCG的碎片离子的m/z 169.014 3同样相差14.015 6;二者存在共同的碎片离子(m/z 305.066 3), 表明亚甲基位置在没食子酸部分。故推测峰6为O-甲基化的EGCG。另外, 峰6的¹H NMR结果(溶剂为氘代丙酮)(见图 6)与文献^[22]对EGCG3″Me在同样测定条件下报道的¹H NMR结果完全一致, 所以可以确定峰6为EGCG3″Me。

图 5

Fig. 5

图 5 (a)峰6和(b)EGCG标准品的二级质谱图 Fig. 5 MS2 spectra of (a) peak 6 and (b) EGCG standard

图 6

Fig. 6

图 6 二次纯化后峰6的1H NMR图 Fig. 6 1H NMR spectrum of the peak 6 after the second-purification OME: proton chemical shift of the methyl group. The proton numbers are the same as that in EGCG3″Me of Fig. 1. The solvent is acetone-d6.

2.4 不同品种茶叶中儿茶素类化合物的产率比较

为了验证以上分离纯化方法在不同茶树品种中的可行性, 对肉桂和福鼎大白的茶叶鲜叶应用相同的方法进行了儿茶素类化合物的制备。如表 1所示, 在100 g茶叶鲜叶中, 儿茶素类化合物的产率在铁观音中最高(1 936 mg), 福鼎大白(1 416 mg)和肉桂(1 177 mg)相对较低。产率的不同可能是由于不同品种间儿茶素类总含量差异导致的。在这3个品种中, EGCG、ECG和EGC的含量占儿茶素总量的87% ~95%, 是茶叶鲜叶中最主要的3种儿茶素类化合物; EC和GC的含量次之, 而C的含量最低。此外, EGCG3″Me的含量表现出品种特异性:乌龙茶品种(铁观音和肉桂)较高, 而白茶品种(福鼎大白)较低。经过两步半制备色谱纯化之后, 除了福鼎大白中的EGCG3″Me纯度(81.5%)较低外, 几乎所有儿茶素单体都能达到较高纯度, 表明了此方法的通用性。

表 1 (Table 1)

表 1 3个品种茶叶中目标儿茶素化合物的产量和纯度 Table 1 Yields and purities of the target catechin compounds from three tea cultivars Compound Tieguanyin Rougui Fudingdabai Amount/mg Purity/% Amount/mg Purity/% Amount/mg Purity/% GC 11 96.0 27 97.3 6 97.1 EGC 231 95.7 223 95.5 176 95.3 C 3a) 99.3a) 4a) 99.7a) 1a) 99.7a) EGCG 1382 99.0 621 99.2 878 99.6 EC 45a) 99.8a) 75 93.2 107 93.3 EGCG3″Me 31a) 93.5a) 52 96.0 3a) 81.5a) ECG 233 99.5 175 98.3 245 98.1 Total 1936 1177 1416 a) amounts and purities were obtained after the second semi-preparative HPLC purification. Other values were obtained from the first semi-preparative HPLC.

表 1 3个品种茶叶中目标儿茶素化合物的产量和纯度 Table 1 Yields and purities of the target catechin compounds from three tea cultivars

3 结论

采用液液萃取法、离子沉淀法粗提茶多酚, 可简单快速地去除大部分杂质, 结合半制备色谱, 可以得到高纯度的GC、EGC、C、EGCG、EC、EGCG3″Me和ECG。经过两步半制备色谱后, 7种儿茶素单体均能达到较高纯度。用两步法分离纯化不同的儿茶素单体, 可以有效节约成本。此方法应用在3种不同的茶叶中, 均有相似的结果, 表明了本方法的通用性。本文的方法为儿茶素标准品的制备提供了参考, 并为其功能活性和药理作用的研究提供了物质基础。

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