色谱  2017, Vol. 35 Issue (12): 1312-1316   PDF    
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陈婧
刘云霞
徐叶峰
王翌庆
代谢组学法分析骨髓抑制模型小鼠血清小分子代谢产物
陈婧, 刘云霞, 徐叶峰, 王翌庆     
杭州市第三人民医院肿瘤科, 浙江 杭州 310009
收稿日期：2017-08-02
基金项目：浙江省中医药管理局基金项目（2012ZB131）
通讯联系人：陈婧, E-mail:chen_jing214@163.com
摘要：骨髓抑制是恶性肿瘤患者化疗后常见的症状，研究骨髓抑制造成体内代谢产物的变化可以为诊断骨髓抑制病症发展状况及采用药物治疗提供思路。采用雄性BalB/C小鼠腹腔注射环磷酰胺建立骨髓抑制模型，通过气相色谱-质谱（GC-MS）对正常与造模小鼠血液代谢产物进行指纹图谱分析，然后采用主成分分析（PCA）和正交偏最小方差判别分析（OPLS-DA）对代谢组学数据进行多维统计分析。与对照组相比，骨髓抑制模型小鼠血浆中潜在的差异表达代谢标志物有15个，其中葡萄糖-1-磷酸、对硝基苯酚、乙酰苯胺、可的松、烟酰胺、马钱苷、咖啡酸、亚油酸和油酸这9种物质的表达差异有统计学意义（P < 0.05）。结果表明，代谢产物可作为骨髓抑制研究中的重要标记物，有助于揭示化疗所致骨髓抑制的发病机制，判断疾病发展阶段以及后续治疗手段的有效性。
关键词：气相色谱-质谱    代谢组学    小分子    骨髓抑制    小鼠    
Analysis on metabolites with small molecule of serum in bone marrow suppression model mice with metabolomics method
CHEN Jing, LIU Yunxia, XU Yefeng, WANG Yiqing     
Department of Oncology, the Third People's Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310009, China
Foundation item: Fund of Zhejiang Provincial Administration of Traditional Chinese Medicine (No. 2012ZB131)
Abstract: Bone marrow suppression is a common symptom in patients with malignant tumor after chemotherapy. Studying the changes of metabolites caused by bone marrow depression can provide insights for the diagnosis of bone marrow suppression disease and for the development of drug therapy. Male BalB/C mice were injected with cyclophosphamide to establish a bone marrow suppression model. Gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS) with fingerprinting was used to analyze the normal and model mice blood metabolites. Principal component analysis and orthogonal to partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) on metabolomics for data multidimensional statistical analysis was also used. Compared to the normal group in terms of the metabolic profile of bone marrow suppression mice, there were 15 endogenous metabolites in mouse plasma, nine of which were statistically significantly different, including glucose-1-phosphate, 4-nitrophenol, acetanilide, cortisone, nicotinamide, loganin, caffeic acid, linoleic acid and oleic acid (P < 0.05). These results indicate that metabolite can be used as an important marker in bone marrow suppression, which can help to reveal the pathogenesis of bone marrow suppression induced by chemotherapy and determine the disease development stage and the effectiveness of follow-up treatment.
Key words: gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS)     metabolomics     small molecule     marrow suppression     mouse    

化疗是临床治疗恶性肿瘤的重要手段, 其所致骨髓抑制也最为常见, 导致被动减量或停药, 影响化疗如期进行及化疗疗效, 严重时导致患者发生严重感染而死亡[1-3]。西医治疗骨髓抑制的常用方法[4]主要有:口服升白药, 如升白胺、利血生之类, 其升白作用并不理想; 注射新型升血药物针剂, 如重组人红细胞生成素(EPO)、重组人粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、血小板生成素、重组人白细胞介素-11等, 这些药物价格昂贵, 且有临床副反应, 远期疗效有待深入研究; 进行造血干细胞移植或者输注成分血, 风险较大, 难以反复使用及推广。因此, 为减少由于骨髓抑制导致的感染、出血等并发症的发生, 保证化疗顺利进行, 迫切需要寻找一种能够更好预防和治疗骨髓抑制的方法, 目前开发新药和寻找新靶点成为骨髓抑制研究中的热点。

代谢组学是对生物体系的代谢变化进行全面研究的科学, 其通过研究生物体系代谢产物的动态变化, 快速精准地分析代谢物, 并对生物标志物进行鉴定, 从整体角度反映疾病的状态, 可用于对疾病预防及治疗效果的评价[5, 6], 目前已广泛应用于药物研发、药物毒性评价、临床诊断等领域。

本研究运用腹腔注射环磷酰胺(CTX)建立骨髓抑制模型, 模拟临床患者骨髓抑制的病理情况, 采用基于气相色谱-质谱(GC-MS)的代谢组学技术观察骨髓抑制小鼠造模后代谢轮廓的改变, 找出骨髓抑制形成过程中的生物标志物, 研究骨髓抑制形成的分子机制, 为研究骨髓抑制机理以及开发相应的药物提供理论依据。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与实验动物

7890B-5977A气相色谱-飞行时间质谱联用仪(美国Agilent公司); MicroCL17高速台式冷冻离心机(美国Fisher公司); AGS-X岛津电子万能试验机(日本岛津公司); XT-2000iv血细胞分析仪(日本Sysmex公司)。

注射用环磷酰胺(0.2 g/瓶, 江苏恒瑞医药股份有限公司); 异丙醇、乙腈、甲醇为色谱纯(上海安谱实验科技股份有限公司); 甲氧胺盐酸吡啶溶液(分析纯, 四川海诺威科技有限公司); L-2-氯-苯丙氨酸(分析纯, 百灵威科技有限公司); 双(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)、三甲基氯硅烷(TMCS)及正己烷均为分析纯(上海迈瑞尔化学技术有限公司); 水为生理盐水(四川科伦药业股份有限公司)。

BalB/C小鼠20只, 雄性, 体重(20±2)g, 无特定病原体(SPF)级, 由浙江中医药大学实验动物中心提供, 实验动物使用许可证号为SYXK(浙) 2008-0115。小鼠饲养在SPF级别动物房, 实验室内要求温度为20 ℃, 相对湿度为50%, 12 h光照和12 h黑暗环境, 自由饮食饮水。

1.2 骨髓抑制小鼠模型的建立及分组

小鼠适应性饲养7 d后, 采用随机数字表法分为对照组及模型组, 每组10只。对模型组腹腔注射环磷酰胺100 mg/kg, 隔日注射一次, 共3次, 建立骨髓抑制模型。同时对对照组腹腔注射生理盐水100 mg/kg, 隔日注射一次, 共3次。

1.3 检测指标及方法

于造模第14 d在肾动脉下方行腹主动脉穿刺采血, 血液收集于抗凝预处理后的离心管中, 混匀, 4 ℃下以10 000 r/min的速度离心10 min, 取上层血浆放置于-70 ℃冰箱内进行保存, 用于代谢组学分析。剩余部分收集于抗凝的试管中, 充分摇匀, 用于血常规检测(主要为白细胞(WBC)计数、红细胞(RBC)计数、血小板(PLT)计数、血红蛋白(Hb)含量测定)。

1.4 样品制备

取50 μL血浆置于1.5 mL离心管中, 加入10 μL内标(0.3 g/L L-2-氯-苯丙氨酸, 甲醇配制), 涡旋振荡10 s, 加入150 μL蛋白沉淀剂(甲醇-乙腈, 2:1, v/v), 再继续涡旋振荡1 min, 之后于-20 ℃下静置10 min。冰水浴超声提取5 min, 于-20 ℃下静置10 min, 以15 000 r/min的速度于4 ℃离心10 min。取150 μL上清液装入玻璃衍生瓶, 使用快速离心浓缩仪挥干。取80 μL甲氧胺盐酸吡啶溶液(15 g/L)加入玻璃衍生瓶中, 涡旋振荡2 min, 于振荡培养箱中作37 ℃肟化反应90 min; 取出后加入20 μL的正己烷和80 μL的BSTFA(含体积分数为1%的TMCS衍生试剂), 涡旋振荡2 min, 置于70 ℃反应60 min。样本取出后于室温放置30 min, 进行GC-MS代谢组学分析。

1.5 GC-MS分析条件

用无分流模式将1 μL衍生化后的提取物注入7890B-5977A气相色谱-飞行时间质谱联用仪中。样品经非极性的DB-5MS毛细管柱(30 m×250 μm, 美国J & W Scientific公司)分离后进入质谱检测。载气为高纯氦气, 载气流速为1.0 mL/min。程序升温流程:50~125 ℃, 15 ℃/min; 125~210 ℃, 5 ℃/min; 210~270 ℃, 10 ℃/min; 270~305 ℃, 20 ℃/min; 305 ℃维持5 min。EI源温度为230 ℃, 进样口温度为260 ℃, 电压为-70 V, 扫描范围为m/z 50~600, 采集速度为20谱/s, 于5 min后开始采集。

1.6 数据分析和统计检验

首先应用ChromaTOF(v 4.34, 美国LECO公司)软件对GC-MS的原始数据进行预处理, 通过对样本进行分析获得所有的代谢物。然后通过峰面积归一化法对样本质谱峰的响应强度进行归一化, 获取数据矩阵。应用SIMCA-P+14.0软件包(Umetrics公司, 瑞典)导入归一化后的数据矩阵。再利用主成分分析(PCA)方法分析全过程是否稳定以及各样本间的总体分布情况, 用正交偏最小方差判别分析(OPLS-DA)分析区别各组间代谢物的差异轮廓, 找出组间的差异代谢物。在OPLS-DA分析中, 设立变量权重值(VIP)大于1的变量为差异变量, 获取差异代谢物。

2 结果和讨论
2.1 骨髓抑制模型小鼠血三系及血红蛋白的变化

在造模第14 d, 检测了血三系(白细胞、红细胞、血小板)及血红蛋白的变化, 与对照组比较, 模型组白细胞数、红细胞数、血小板数、血红蛋白含量均明显减少, 差异有统计学意义(P＜0.05), 结果见表 1, 说明造模成功。

表 1 对照组和模型组小鼠外周血细胞及血红蛋白量的比较 Table 1 Comparison of the numbers of peripheral blood cells and hemoglobin (Hb) between normal group and model group of mice
2.2 对照组与模型组小鼠血清样本GC-MS轮廓谱

在对照组与模型组中各随机选取一个样本作为质控样本, 两组小鼠血清的GC-MS总离子流色谱图如图 1所示, 质控样本质谱峰的保留时间和相应强度重复性都非常好, 说明前处理方法和仪器分析系统均稳定可靠。

图 1 (a) 对照组和(b)模型组样本GC-MS总离子流图 Fig. 1 Total ion chromatograms of the samples in (a) normal group and (b) model group by GC-MS
2.3 骨髓抑制模型小鼠血浆GC-MS谱模式识别分析及差异代谢物筛选

通过对照组与模型组小鼠血清GC-MS谱PCA分析得到得分图(见图 2a), 进行模型验证。可以看出, 正常小鼠和骨髓抑制模型小鼠血液代谢谱出现明显差异。考虑到干扰因素对非药物作用可能的影响, 进一步进行组间分离, 确立关键差异代谢物, 应用OPLS-DA方法分析样本血浆代谢全谱, 摒弃无关信息。图 2b为代谢物全谱数据的OPLS-DA得分图, 该模型主成分R2Ycum=0.948(R2Ycum表示模型累计稳定程度), 说明模型具有较高的稳定性。用OPLS-DA法分析对照组与模型组血浆样本的二维分布, 结果显示, 模型组主要位于第一、四象限, 对照组主要位于第二、三象限, 两组间基本无交叉重叠, 具有明显的分离趋势, 说明给药后小鼠血浆代谢物发生了明显的变化, 这种代谢物可被认为是环磷酰胺对小鼠骨髓代谢产生影响的生物标记物。对照组和模型组小鼠血浆中内源性差异代谢物为23个, 其中2个代谢产物在对照组中未被检出, 但在模型组中被检出, 4个差异代谢物在模型组未被检出, 但在对照组中存在, 结果见表 2。其中肌酸含量上升, 可能是骨髓抑制导致三羧酸循环抑制造成的结果[7]; 3-吲哚乙腈为色氨酸的代谢产物, 其与乳酰胺的含量低于检测限可能与细胞膜的合成代谢减弱有关[8]; O-磷酸丝氨酸为常见的甘油磷脂类物质, 通常位于细胞膜的内层, 含量偏低可能意味着脂类代谢增强[9]; 腺嘌呤作为核酸的组成成分, 参与RNA及DNA的合成[10]。另外葡萄糖-1-磷酸、对硝基苯酚、乙酰苯胺、可的松、烟酰胺、马钱苷、咖啡酸、亚油酸和油酸9个指标差异有统计学意义(P＜0.05), 这些代谢物的水平在模型组均表现为增高趋势。其他研究[11-13]也证实了这些代谢物与骨髓抑制具有相关关系, 如烟酰胺、咖啡酸等具有抗肿瘤的功能, 对骨髓造血有一定的抑制作用[14, 15]。葡萄糖-1-磷酸是一种重要的糖基磷酸盐, 是糖代谢中重要的中间产物, 还是合成糖核苷酸的中间体, 而糖核苷酸就是糖基转移酶在催化各种糖激化反应中重要的糖基供体[16]。有研究[17-19]报道葡萄糖-1-磷酸在血管扩张及输血中起着重要的作用, 其铂配合物可用于癌症的治疗, 故其含量升高可能与骨髓造血功能受到抑制而消耗较少的核苷酸有关。对硝基苯酚是芳香族化合物硝基苯的代谢产物, 能破坏红细胞, 并使血红蛋白迅速转化为高铁血红蛋白, 这是一种相当稳定的化合物, 在组织中不能电离, 不能有效供氧, 可造成组织器官缺氧, 从而使红细胞数和血红素量减少[20]。可的松及咖啡酸主要影响糖代谢, 其含量升高可能与骨髓细胞受到抑制后能量代谢异常, 糖酵解和线粒体的呼吸作用减弱相关[21]。烟酰胺是尼克酸的前体, 参与大量的生物反应, 为脂质代谢、组织呼吸的氧化作用和糖原分解所必需[22]。Cetkoviccvrlje等[23]的研究表明, 小剂量的烟酰胺可抑制一氧化氮的产生, 激活ATP酶(ATPase), 增加线粒体内ATP的产生, 加快细胞能量代谢；大剂量烟酰胺可能使细胞产生大量具有细胞毒性的一氧化氮, 影响线粒体生物内ATP的合成, 导致细胞能量代谢降低, 使细胞失去活力或死亡。骨髓细胞受到抑制时, 其合成代谢功能减弱, 而马钱苷对抑制状态下的骨髓细胞的合成代谢功能具有一定的改善作用[24]。油酸和亚油酸是组成细胞膜的主要成分, 其含量升高可能与造血干细胞的坏死和凋亡具有一定的关系[25]。

图 2 对照组和模型组的(a)PCA和(b)OPLS-DA得分图 Fig. 2 (a) Principal component analysis (PCA) and (b) orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) score diagrams in normal group and model group

表 2 对照组和模型组小鼠血浆中内源性差异代谢物含量的指标数据(n=23) Table 2 Data of the contents of endogenous differential metabolites in mouse plasma of normal group and model group (n=23)
3 结论

本文通过代谢组学方法对骨髓抑制小鼠血清进行研究, 运用腹腔注射环磷酰胺建立骨髓抑制模型, 采用基于GC-MS代谢组学技术观察骨髓抑制小鼠造模后代谢轮廓的改变, 通过GC-MS对正常与造模小鼠血液代谢产物进行指纹图谱分析, 采用PCA和OPLS-DA对代谢组学数据进行多维统计分析, 找出了15个潜在的差异表达代谢标志物。这些代谢标志物有助于更好地揭示骨髓抑制的发病机理, 对骨髓抑制的预防与治疗具有重要的意义, 可在实际工作中作为参照物, 有助于早期快速发现骨髓抑制恶化。此外, 骨髓抑制患者血清代谢物的检测方法具有相对简便、快捷的优势, 因此上述研究具有较大的实际意义。

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