亚氨基二乙酸(IDA)和甘氨酸(Gly)是重要的化工中间体, 广泛用于农药、化工、医药等领域。目前国内外生产IDA的方法主要有氯乙酸甘氨酸法、氨代氯乙酸法、氮川三乙酸法、氢氰酸直接合成法和二乙醇胺脱氢法等[1]。由于二乙醇胺脱氢法经济环保, 生产成本比传统工艺显著降低、收率高、产品质量好, 且副产物主要为Gly, 目前国内外生产及研究重点均采用此条工艺路线。因此, 建立一种高效、快速、精确的分析IDA和Gly的方法, 对研究二乙醇胺脱氢工艺条件的优化, 提高反应选择性和产物收率等具有重要的现实意义。
目前分析IDA和Gly常用的方法有电位滴定法[2]、紫外分光光度法[3]、液相色谱法[4]、气相色谱法[5]和离子色谱法[6, 7]等。相比其他仪器分析方法, 高效液相色谱法具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度好、重现性好等优点。但在采用C18柱为液相色谱分析柱、紫外检测器为检测器时, 由于大多数氨基酸类化合物不含生色团, 紫外吸收很弱, 为了提高检测的灵敏度, 常需要对氨基酸类化合物进行衍生反应。文献报道常用的衍生试剂有邻苯二甲醛[8, 9]、邻硝基苯磺酰氯(NBSC)[10]、异硫氰酸苯酯(PITC)[11, 12]、2, 4-二硝基氟苯(DNFB)[13]等。但大多数衍生反应存在衍生反应温度高、衍生条件苛刻、衍生试剂有毒等缺点。
本文以反应活性高、价格低廉的对甲苯磺酰氯(PTSC)为衍生试剂, 与二乙醇胺脱氢产物发生衍生反应, 欲探索一种新型、快速和准确测定IDA和Gly的定量分析方法。
Agilent1200高效液相色谱仪(配紫外检测器)、Agilent G6530A型电喷雾-三重四极杆质谱仪(美国Agilent公司); KQ2200DE型数控超声波清洗仪(昆山市超声仪器有限公司); PHS-3E pH计(上海仪电科学仪器股份有限公司)。
PTSC(分析纯, 上海市阿拉丁试剂有限公司); Gly标准品(分析纯, 天津市化学试剂研究所); IDA标准品(分析纯, 天津市光复精细化工研究所); 乙腈(色谱纯, 天津市科密欧化学试剂有限公司)。实验用水均为超纯水。
精密称取适量IDA和Gly, 置于100 mL容量瓶中, 用超纯水超声溶解并定容至刻度，配制IDA和Gly的浓度分别为0.006 mol/L和0.005 mol/L的混合标准溶液。精密称取适量PTSC, 置于50 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，配制PTSC浓度为0.015 mol/L的衍生试剂溶液, 冷藏保存, 备用。称取适量硼砂, 用超纯水溶解，配制0.001 mol/L的缓冲溶液(pH 11), 备用。
称取31.5 g二乙醇胺、25.2 g氢氧化钠、64.8 g去离子水，在6.0 g铜基催化剂的作用下于高压反应釜中脱氢反应6 h, 冷却离心，制得反应上清液。精密量取1 mL反应上清液，置于50 mL容量瓶中(调节pH值至3.0), 用超纯水定容至刻度线。
精密量取1 mL混合标准溶液(或样品溶液)和4.4 mL PTSC溶液于试管中, 并用硼砂缓冲溶液(pH 11)定容至15 mL, 混匀, 于45 ℃水浴中反应15 min后, 用0.45 μm有机滤膜过滤, 备用。
色谱柱:VP-ODS色谱柱(200 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:0.03 mol/L酸铵溶液(pH 5.5)-乙腈(87 : 13, v/v)溶液; 等度洗脱; 流速:1 mL/min; 室温; 检测波长:235 nm; 进样量:20 μL。
离子源:电喷雾离子源, 正离子检测模式; 干燥气温度:350 ℃；气压:0.45 MPa; 气体流速:10 mL/min; 扫描范围:m/z 50~1 200。
IDA和Gly既没有生色基团也没有荧光性, 但其分别属于一级胺和二级胺, 极易发生Hisberg反应[14]。IDA和Gly通过与苯磺酰氯化合物发生Hisberg反应, 向化合物结构中引入生色基团, 从而实现紫外吸收检测。本文以PTSC为衍生剂进行衍生反应, 其具体的反应原理见图 1。
混合标准样品按上述方法衍生化后, 采用HPLC-MS进行分析, 以验证是否成功衍生, 其色谱图和质谱图分别见图 2和图 3。从图 2可以看出, 通过标准样品的保留时间可以定性分析出峰1和峰2(图 2c)分别为PTSC和PTSC的水解产物对甲苯磺酸(PTSA)的色谱峰。结果表明, 图 2中3号峰准分子离子峰的m/z为310.036 2(见图 3a), 推测为IDA衍生产物的色谱峰(m/z为287.04); 4号峰准分子离子峰的m/z为252.031 0(见图 3b), 推测为Gly衍生产物的色谱峰(m/z为229.04)。此结果符合预期设想, 说明衍生成功。
在反相高效液相色谱中, 改善色谱峰分离度和保留时间最有效的方法是引入一种溶剂以改变流动相的极性, 因此试验重点考察了流动相的种类。首先尝试了甲醇-水系统和乙腈-水系统, 结果表明, 改变有机相和水相之间的比例无法改善样品峰的分离度和峰形, 无法满足定量要求, 因此需要加入缓冲盐进行调节。本文参考了文献[15]，选择醋酸铵(pH 5.5)-乙腈缓冲盐系统, 并对其做了进一步研究。结果表明, 该流动相系统下样品峰的峰形对称、尖锐, 增加流动相中乙腈的含量有利于缩短样品的保留时间, 但当乙腈的体积分数大于13%时, 样品部分组分重叠。因此最终确定流动相系统为醋酸铵(pH 5.5)-乙腈缓冲盐体系, 最佳流动相体积比为87 : 13。
Hisberg反应需要在碱性环境下使一级胺或二级胺与苯磺酰氯发生亲核取代反应生成苯磺酰胺。因此本文重点考察了pH值在9.0~12.0范围、衍生化反应体系温度为35 ℃、反应时间为15 min、衍生剂与标准样品物质的量之比为6 : 1时, 标准样品衍生后衍生产物峰面积的变化情况(见图 4a)。结果表明, 在pH值9.0~11.0范围内, IDA和Gly衍生产物的含量随pH值的升高而增加, 而对甲苯磺酸的含量则随之减少；在pH值为11.0~11.5时, 衍生产物的含量相对稳定；随着pH值继续提高, 对甲苯磺酸的含量明显增加, 说明碱性的增大加速了衍生剂的水解。因此, 确定衍生化反应体系的pH值为11.0。
本文在反应体系pH值为11.0、反应时间为15 min、衍生剂与标准样品物质的量之比为6 : 1时, 通过改变反应温度考察衍生产物峰面积的变化情况, 结果见图 4b。在30 ℃时, 衍生剂无明显活性, 衍生产物的含量较少; 在35~45 ℃时, 衍生产物随着温度的升高而增加; 在50~55 ℃时, 衍生产物的含量略微减小, 对甲苯磺酸的含量明显增加, 推测温度过高可能破坏了衍生剂的结构, 使其呈现不稳定状态, 活性较低, 容易水解。为了保证良好的衍生反应效率, 最终选择反应温度为45 ℃。
当反应温度为45 ℃、反应体系pH值为11.0、衍生剂与标准样品物质的量之比为6 : 1时, 考察不同反应时间(5、10、15、20和25 min)对衍生产物峰面积的影响(见图 4c)。结果表明, 反应时间对于衍生效率的影响不大, 基本能在10 min内反应完全; 反应时间过长, 衍生剂会大量水解。综合考虑, 选择反应时间为15 min, 这样既能保证反应完全, 同时也能减少水解反应。
在上述条件下进行衍生, 通过改变衍生剂的浓度控制反应体系中衍生剂与标准样品物质的量的比在4 : 1~9 : 1之间。由图 4d可知, 随着衍生剂用量的增加, 衍生产物和对甲苯磺酸的峰面积逐渐增加，当物质的量之比达到6 : 1时, 衍生产物的峰面积接近稳定; 继续加大衍生剂的物质的量时, 过量的衍生剂大量水解, 无法对衍生反应起到促进作用。为了保证衍生反应完全, 在选择衍生剂的物质的量时, 应使衍生剂过量，但是过量的衍生剂会造成浪费。综合考虑, 最终选择衍生剂与IDA和Gly的物质的量之比为6 : 1。
分别配制900、1 200、1 500、1 800、2 100 mg/L的IDA系列标准溶液和20、40、60、80、100 mg/L的Gly系列标准溶液, 按1.3节描述进行衍生。在优化后的色谱条件下进行测定, 得到IDA和Gly的线性方程, IDA和Gly的峰面积(y)和对应的质量浓度(x, mg/L)呈良好的线性关系, 相关系数(R2)均大于0.999(见表 1)。以S/N=3计算方法的检出限, IDA和Gly的检出限分别为0.089 7 mg/L和0.026 2 mg/L。
选取已知浓度的样品, 分别加入3个水平的IDA和Gly的混合标准溶液进行加标回收试验, 每个添加水平重复进样5次。IDA的3个添加水平分别为99.600 4、200.400 1和250.700 3 mg/L; Gly的3个添加水平分别为10.200 1、20.100 4和30.100 1 mg/L。结果表明，IDA的平均回收率为98.7% ~99.3%, RSD为0.89% ~1.23%; Gly的平均回收率为98.0% ~99.5%, 相对标准偏差(RSD)为0.95% ~1.11%。由此可知实验建立的分析方法准确性高；方法所用仪器精密度高，数据准确可靠。
将冷藏保存1 d与2 d的衍生反应液进样分析, 发现衍生产物的峰面积无明显变化, 说明该衍生产物在2 d内具有良好的稳定性, 在此期间可进行进一步的定量分析研究。
图 5为精密量取1.2.2节反应上清液1 mL, 按本文所述方法获得的色谱图, 测得反应液中IDA的含量为85 495.0 012 mg/L, Gly的含量为1 435.0 031 mg/L。与混合标准样品衍生色谱图(图 2c)对比可知, 样品衍生后多出了两个峰, 分别为1号峰和6号峰, 推测样品中有其他含一级胺或二级胺的副产物如羟乙基甘氨酸或亚氨基二乙醛等物质的存在, 需利用高效液相色谱-质谱联用分析确认。
图 6为反应液参照文献[16]利用离子色谱法获测得的色谱图, 测得IDA的含量为85 667.0 021 mg/L, Gly的含量为1 441.0 104 mg/L。将本文方法与离子色谱法测定的结果进行对比, 可以看出, IDA和Gly含量的相对误差分别为0.2%和0.4%。因此本文所建立的方法结果可靠, 可对样品进行准确的定量分析。
本研究建立了一种以PTSC为衍生剂的柱前衍生高效液相色谱测定二乙醇胺脱氢产物中IDA和Gly的定量分析方法。利用高效液相色谱-质谱联用对衍生产物进行了定性分析, 研究并确定了最佳的衍生条件。该法具有操作简便、反应条件温和、稳定性好、分析快速和准确性高等特点, 能够满足IDA和Gly的定量分析要求, 可对二乙醇胺催化脱氢制备IDA的科研和生产工艺条件的优化提供指导。
2017,
Vol. 35 Issue (11): 1165-1170
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2017,
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