聚丙烯酰胺(PAM)是丙烯酰胺(AM)均聚物的统称, 作为一种线性高分子聚合物, PAM具有特殊的物理化学性质, 广泛应用于石油开采、废水处理、造纸矿产等行业[1-3]。在食品工业中, PAM可以作为絮凝剂、助滤剂在饮料(水处理)的加工工艺、制糖工艺和发酵工艺中使用。然而其在生产、使用的过程中会缓慢释放出AM单体, AM单体进入人体后, 在细胞色素P4502E1的作用下, 可生成活性环氧丙酰胺(glycidamide), 易与DNA上的鸟嘌呤结合, 形成加合物, 并能导致遗传物质损伤和基因突变, 故其被国际癌症研究机构(IARC)列为“可能对人致癌物质”[4, 5]。因此, 食品安全国家标准[6]明确规定了食品级PAM中的AM单体含量不得超过0.025%。严格满足标准要求, 它才可作为食品添加剂使用。
但调查发现, 由于食品级PAM价格较贵, 某些不法厂家使用工业级PAM冒充聚丙烯酸增稠剂添加在面制品中, 以起到减少糊汤、增加硬度的目的[7]。工业级PAM中AM单体含量较高, 而面制品又是我国重要的粮食食品, 大量AM单体间接摄入对人体造成了极大的危害。
目前PAM单体残留量的测定大多采用反相高效液相色谱-可变波长检测(RP-HPLC-VWD)法[8, 9], 但是AM极性强, 在C18柱上的保留能力较差, 紫外吸收较弱, 因此反相高效液相色谱法测定AM存在特异性低、干扰大的缺点, 方法灵敏度及定量准确性难以满足实际需求。为克服该缺点, 有标准和文献[10-14]采用高效液相色谱-串联质谱(HPLC-MS/MS)法, 但AM相对分子质量小, 低分辨质谱对质荷比较小的干扰物不能有效区分, 易出现假阳性。此外, 食品中AM的检测方法还有气相色谱(GC)法[15]和气相色谱-质谱(GC-MS)法[11, 16], 这些方法需要对样品进行较复杂的前处理甚至衍生化才能取得较好结果, 导致方法复杂, 且耗时长, 不利于大批量样品的测定。近期, 尽管有文献[17]报道了无衍生化GC-MS直接测定AM的方法, 但该方法需要使用特殊的磁性石墨烯溶胶杂化材料进行净化去除杂质干扰, 由于该功能材料无成熟的商业化产品, 需要实验室合成, 因而该方法难以大规模推广应用。因此, 亟须研究一种能够准确、简便测定食品级PAM中单体残留量的方法, 以强化食品级PAM的安全监管, 并应对工业级PAM违规添加时产生的安全风险。
Orbitrap-MS是一种结合静电场离子阱和四极杆技术的快速傅里叶变换新型高分辨质谱, 既具有高分辨质谱分辨率高的优点, 又具有四极杆质谱定量好的优点, 在高分辨定性优势的基础上改善了定量效果, 在小分子化合物分析上有很强的优势[18, 19]。
Hypercarb是一种以石墨化碳为固定相, 适用于高极性化合物保留和分离的色谱柱。极性化合物分子与石墨化碳表面之间除范德华力外, 还能与“离域电荷”发生偶极-偶极作用, 使化合物的保留能力进一步增强[20, 21]。
本文结合两者优点, 采用Hypercarb色谱柱分离, Q Exactive四极杆静电场轨道阱高分辨质谱平行反应监测(PRM)模式测定PAM单体残留量, 通过四极杆过滤AM化合物, 碎裂后对高分辨的二级子离子专属定量。用提取的一级质谱和二级质谱的精确质量数进行定性定量分析, 不易出现假阳性, 且满足方法确证中关于鉴定位点的要求[22]。PAM中AM单体用水直接提取, 高效简便。在最佳仪器条件下, 利用高分辨定性优势, 辅以同位素稀释法, 强化定量效果。本方法对AM单体有很强的检出能力, 适用性强。
Q-Exactive高效液相色谱-四极杆静电场轨道阱高分辨质谱仪、UltiMate 3000超高效液相色谱仪、M37610涡旋混合器(美国ThermoFisher公司); 2600TH超声波清洗器(上海安谱仪器公司); Synergy超纯水系统(法国Millipore公司); IKA RW20数控搅拌器(广州仪科实验室技术有限公司); 0.22 μm水相滤膜(上海安谱仪器公司)。
Hypercarb色谱柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm)、Hypersil GOLD色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.9 μm)、Accucore AQ色谱柱(50 mm×2.1 mm, 2.6 μm)、Accucore PFP色谱柱(50 mm×2.1 mm, 2.6 μm)和Accucore HILIC色谱柱(50 mm×2.1 mm, 2.6 μm)均购于美国ThermoFisher公司。
AM(纯度为99%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); AM内标(13C3-AM)(纯度为99.9%, 美国CIL公司); 甲醇(色谱纯, 美国ThermoFisher公司); 冰乙酸、甲酸、甲酸铵和乙酸铵(分析纯, 广州化学试剂厂); 实验用水为超纯水。
分别准确称取10 mg AM和13C3-AM于10 mL烧杯中, 用甲醇溶解并转移至100 mL棕色容量瓶中, 定容至刻度, 分别配制成100 mg/L的标准储备液, 置于4 ℃冰箱中保存。根据使用状况用超纯水逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
用分析天平准确称取0.1 g样品至大容量烧杯中, 加入适量同位素内标13C3-AM溶液, 以超纯水超声初步溶解后, 于数控搅拌器上高速搅拌6~8 h, 混匀, 转移溶液至容量瓶中, 定容至刻度, 经0.22 μm水相滤膜过滤后, 上机测定。
色谱柱:Hypercarb柱(50 mm×2.1 mm, 3 μm); 柱温:20 ℃; 进样体积:3 μL。流动相:A相为超纯水, B相为甲醇; 流速:0.3 mL/min。梯度洗脱程序:0~3.0 min, 100%A; 3.0~5.0 min, 0~100%B; 5.0~5.5 min, 100%B; 5.5~6.0 min, 100%B~100%A; 6.0~7.0 min, 100%A(分析时间为7 min, 其中3.5~6.5 min流出物切换至废液, 不进入质谱检测)。
离子源温度:350 ℃; 传输金属毛细管温度:320 ℃; 喷雾电压:3 000 V(正离子模式); 扫描范围:m/z 50~750;一级质谱全扫描分辨率:7 000; C-trap最大容量(AGC target): 1×106; C-trap最大注入时间:50 ms; PRM二级子离子全扫描分辨率:17 500;阶跃式碰撞能(stepped NCE): 25%±15%;二级C-trap最大容量:2×105; 二级C-trap注入时间:100 ms。化合物精确质量数及保留时间见表 1。
AM易溶于水, 其聚合物PAM属于高水溶性高分子。采用数控搅拌器高速搅拌使PAM充分溶解。搅拌剪切速率及搅拌时间不会导致PAM发生额外的机械降解[1, 23], 保证了测定结果的稳定性。
质谱检测需要避免基质效应, 共流出的基质与目标物竞争, 影响接口离子化效率, 会表现为离子抑制或增强作用[24]。高分子的溶解会发生溶胀, 故单体难用常规的萃取方法提取。此外, PAM溶液黏度大, 传统的SPE固相萃取操作净化处理不适用于高分子溶液, 容易产生堵塞残留。因此, 需要通过稀释较大倍数来降低PAM水凝胶的黏度, 同时减少样品的杂质干扰。试验采用同位素稀释法, 加入13C3-AM作为内标, 补偿ESI源电喷雾下因离子竞争作用所导致的基质效应, 消除其对定量分析结果的影响。
常规C18柱一般都是疏水色谱柱, 对极性强的样品普遍保留较弱, 调低有机相比例又会造成疏水塌陷, 而AM具有极性强、水溶性好的特点, 考虑到AM在色谱柱上的保留问题, 分别尝试了市面上分析极性化合物时使用较普遍的色谱柱。比较各色谱柱在同等柱长和柱内径下(50 mm×2.1 mm)得出的保留因子(k)值(k=(tR-tm)/tm, tR为AM的保留时间, tm为死时间, 以强溶剂作为样品进样后, 基线的首个显著波动时间近似为死时间), 选出最合适的分析柱(见表 2和图 1)。
由图 1可知, 反相色谱柱Hypersil GOLD、Accucore AQ以及Accucore PFP对AM的保留能力较差, k不足0.2(流动相水和甲醇的体积比为9:1)。
Accucore HILIC是正相色谱柱, 固定相为亲水硅胶, 由于亲水相互作用对极性化合物有较好的保留。在水-甲醇(9:1, v/v)的流动相比例下, k只有0.11。优化流动相条件, 流动相比例设为乙腈-水(95:5, v/v)时, k可达到0.46。但与Hypercarb色谱柱相比, 仍存在较大劣势。
Hypercarb色谱柱的固定相是石墨化碳, 因石墨化碳表面易极化, 形成“离域电荷”, 极性化合物官能团通过与Hypercarb色谱柱表面的“离域电荷”发生偶极-偶极作用, 增大了极性化合物的保留[20, 21]。选择Hypercarb色谱柱为实验分析柱, 在水-甲醇(9:1, v/v)流动相比例下, AM单体的保留因子为0.84, 而以纯水作为流动相时, 保留因子达到了2.26, 说明AM在Hypercarb色谱柱上有很好的保留。
在质谱ESI源正离子模式下, 一般流动相加酸可以改善喷雾离子化效率, 提高方法灵敏度; 流动相加缓冲盐可以改善化合物的峰形, 使峰形对称、尖锐。因此尝试加入不同流动相添加剂, 比较化合物的峰面积以及保留时间的变化。图 2为流动相添加剂对AM在Hypercarb和Hypersil GOLD色谱柱上保留时间及峰面积的影响。
由图 2a可知, 流动相加酸会影响AM的保留时间。由于流动相电荷对Hypercarb色谱柱与极性化合物之间的偶极作用产生竞争效应, 酸度越大, 极性化合物的k越小[20, 21]。流动相添加剂会抑制AM的出峰响应强度, 以纯水作流动相, AM峰面积更高。由图 2b可知, Hypersil GOLD与Hypercarb色谱柱相比, 在流动相中加酸有利于峰响应强度的增强, 不影响化合物的保留时间, 符合一般正离子模式下流动相加酸的规律。结果表明, 使用Hypercarb色谱柱进行分析, 当流动相为水-甲醇体系时, AM的响应值更高, 且化合物的保留时间更为稳定。
其次, 比较了不同流动相配比对AM出峰的影响, 发现水相比例越高, AM的保留越强; 当以100%水相作为流动相时, AM仍有较好的色谱峰形。因此, 采用梯度洗脱方式, 以100%水相为初始比例, 在AM洗脱后再增大有机相比例洗脱弱极性杂质。
除了考察流动相组成外, 还比较了Hypercarb色谱柱柱温对AM保留能力的影响。随着柱温的提升, AM的保留时间大幅减少。为避免目标物过早出峰被样品强极性杂质干扰, 结合实验仪器自身条件, 柱温严格设定为20 ℃。
通过以上优化, AM及13C3-AM标准化合物出峰较好, 峰形对称(见图 3)。
AM的准分子离子峰为[M+H]+(m/z 72.044 39), 目标物相对分子质量较小, 结构简单。对于此类小分子化合物, 碰撞能设为阶跃式, 即在25%能量基础上加减15%, 即有3个碰撞能量对目标物进行碰撞, 最终加合获得二级谱图。为在定量分析上有更好的重现性, 选取PRM模式实现高通量的结果分析。AM和13C3-AM的二级质谱图见图 4。对于较明显的碎片离子进行分子拟合, 高分辨下进行同位素匹配, 选出特征碎片, 推断分子裂解方式(见图 5和图 6)。由图 4和图 5得出, [C3H3O]+(m/z 55.017 86)作为特征离子是AM化合物的定性及定量离子, 且高分辨质谱下同时能找到该离子的A1以及A2同位素峰, 满足了图 6中MS2的裂解规律。
欧盟委员会决议[22]规定:当采用普通低分辨质谱法进行分析时, 低分辨质谱-多级质谱母离子可获得1个鉴定位点, 多级质谱产物离子可获得1.5个鉴定位点。对于AM这类化合物, 质谱方法确证需有4个鉴定位点, 因此在确定母离子的基础上至少需要两个子离子。低分辨质谱法[10-14]通常将碎片[CH2ON]+(m/z 44)作为辅助定性离子, 但该碎片离子相对分子质量小, 质谱出峰响应较差, 背景噪声大, 干扰严重, 易出现假阳性。而高分辨质谱-多级质谱母离子是2个鉴定位点, 多级质谱产物离子是2.5个鉴定位点, 采集一个特征离子[C3H3O]+(m/z 55.017 84)同时作为定量及定性离子, 鉴定位点数就达到了4.5。相比之下, 高分辨质谱法鉴定位点数更多, 弥补了低分辨质谱易出现假阳性的缺点。
将目标物及内标物标准储备液用去离子水稀释, 配制成AM质量浓度分别为2、5、10、20和50 μg/L的标准工作液, 其中内标13C3-AM的质量浓度均为50 μg/L。按1.4节条件进行测定, 计算峰面积, 用最小二乘法进行回归分析, 得到在2~50 μg/L范围内AM的线性回归方程为y=8.60×10-4+1.61×10-2x(y: AM峰面积与内标13C3-AM峰面积的比值, x: AM质量浓度与内标13C3-AM质量浓度的比值), 相关系数(r2)=0.999 8。以信噪比为3时确定检出限(LOD)为1.5 μg/kg, 信噪比为10时确定定量限(LOQ)为5 μg/kg。
选取其中一个本底值较小的6号食品级PAM样品进行加标回收试验, AM加标水平为0.4、2.0和10.0 mg/kg, 13C3-AM内标加标水平为2.0 mg/kg。以上各加标水平样品按1.3节和1.4节方法进行处理和测定, 重复6次, 计算方法回收率以及相对标准偏差, 结果见表 3。
PAM由AM自由基聚合而成, 其聚合方法分为本体聚合、溶液聚合、悬浮聚合、乳液聚合等[25], 成品形式多样, 因此各PAM的单体残留量有较大差别。对从市面上购买的6种不同生产厂家的PAM进行了检测。测定结果表明, PAM中AM的残留范围为0~0.43%, 部分产品超过国标残留限量[6], 相关产品在食品应用上存在一定的安全风险。
本文通过Hypercarb色谱柱分离, 建立了使用四极杆静电场轨道阱高分辨质谱平行反应监测模式检测PAM中单体残留量的方法, 具有前处理步骤简单, 分析时间短, 环境友好等优点。平行反应监测扫描模式同时筛取AM母离子以及碎裂后子离子的精确质量数, 根据二级碎片同位素分布推断化合物的质谱断裂方式。与国标[6]相比, 低检出限、高准确性的特点大幅提升了方法的检出能力。化合物总鉴定点达4.5, 可以进行确证分析[22]。该PAM单体残留测定法可作为快检和确证检测技术使用, 为食品添加剂的质量监管提供了技术支持。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1294-1300
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