氟虫腈是苯基吡唑类新型高活性杀虫剂, 具有广谱杀虫效果, 其作用为阻碍昆虫γ-氨基丁酸控制的氯化物代谢, 对昆虫有胃毒作用, 对人体毒性较低, 20世纪90年代后期在我国大范围推广和应用[1-3]。过量的氟虫腈原药对小鼠有一定的肝毒性、神经毒性等, 对水生动物、家蚕、蜜蜂等都具有较强的毒性。氟虫腈可通过环境中的还原、氧化和光解作用生成毒性更高的氟甲腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜等代谢产物[4, 5], 其结构式见图 1。
2017年8月初, 荷兰出口的“毒鸡蛋”引发的风波波及欧洲7个国家, 引起国内外对氟虫腈及其代谢产物在动物源食品特别是禽蛋类产品中残留问题的关注。国际食品法典委员会[6]规定蛋类中氟虫腈及其代谢产物残留限量是0.02 mg/kg, 欧盟[7]规定氟虫腈及其代谢产物残留限量为0.005 mg/kg, 日本肯定列表[8]中规定鸡蛋中氟虫腈最大残留限量为0.02 mg/kg。我国农业部、工信部和环保部于2009年联合发布了1157号公告[9], 将氟虫腈限定在花生和玉米等部分旱田种子包衣中使用; 在GB 2763-2016中规定了植物源性氟虫腈及其代谢产物的残留限量为0.02~0.1 mg/kg。
目前, 氟虫腈及其代谢产物的测定方法主要包括气相色谱(GC)法[10-12]、气相色谱-质谱(GC-MS)法[13-17]、液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)法[18-22]等。其中, GC和GC-MS法方法繁琐, 干扰因素较多, 适用范围有限; 而LC-MS/MS法兼具灵敏度高及抗干扰性强的优势, 广泛应用于农药和兽药残留的检测。样品提取和净化作为关键技术, 会直接影响方法的灵敏度和精密度。LC-MS/MS前处理方法多以乙酸乙酯提取为主, 用小柱净化, 但其成本高、耗时长、步骤繁琐, 操作不当容易造成损失而影响定量检测的准确性。本研究采用分散固相萃取和净化技术进行前处理, 省去固相小柱萃取等步骤, 建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)检测禽蛋中氟虫腈及其代谢产物残留的方法。本法灵敏、简便、高效, 可满足日常禽蛋质量检测需求。
超高效液相色谱-串联四极杆质谱联用仪, 配Shimadzu LC-30A高效液相色谱仪、Shimadzu LCMS-8050串联四极杆质谱仪(日本岛津公司); Milli-Q去离子水发生器(美国Millipore公司); MS3旋涡混合器(德国IKA公司)。
氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈砜和氟虫腈硫醚(纯度均不小于99%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 甲醇和乙腈(均为色谱纯)购自德国Merck公司; 冰乙酸、乙酸铵、氯化钠和无水硫酸钠(均为分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 十八烷基键合硅胶(C18-N)吸附剂和NH2-丙基乙二胺(NH2-PSA)吸附剂购自上海岛津技迩公司。
取氟虫腈、氟甲腈、氟虫腈硫醚和氟虫腈砜的标准品各10 mg, 分别用甲醇溶解转移至10 mL容量瓶中, 用甲醇定容至10 mL, 作为标准品储备溶液(质量浓度为1 000 mg/L)。分别吸取适当体积的4种标准品储备溶液置于10 mL容量瓶中, 用甲醇稀释定容, 配制成1 mg/L的混合标准品储备溶液。将上述混合标准品储备溶液用甲醇分别稀释成质量浓度为0.4、2.0、10、20、50和100 μg/L的混合标准品系列溶液。
提取:准确称取2.0 g鸡蛋试样于50 mL聚丙烯离心管中, 加入10 mL含1%(体积分数)乙酸的乙腈, 充分均质, 提取5 min, 加入2 g氯化钠和5 g无水硫酸钠, 旋涡1 min, 以5 000 r/min的速度离心5 min, 吸取上层有机相8.0 mL, 转移至25 mL聚丙烯离心管中, 待净化。
净化:在待净化样液中加入净化剂(内含1 000 mg无水硫酸钠、250 mg C18-N及250 mg NH2-PSA), 旋涡混匀1 min, 以5 000 r/min的速度离心5 min。吸取5.0 mL上清液, 转移至试管中, 于40 ℃水浴下氮吹至近干。加入0.5 mL 1 mmol/L乙酸铵水溶液-甲醇(75:25, v/v), 旋涡混匀1 min, 溶解残渣, 用0.22 μm微孔有机滤膜过滤。
色谱柱:Shim-pack GIST C18柱(50 mm×2.1 mm, 2 μm); 柱温:40 ℃; 进样量:1 μL。流动相:A相为甲醇, B相为1 mmol/L乙酸铵溶液; 流速:0.4 mL/min。梯度洗脱程序:0~1.50 min, 25%B~5%B; 1.50~2.50 min, 5%B; 2.50~2.51 min, 5%B~25%B; 2.50~5.00 min, 25%B。
电喷雾离子源负离子(ESI-)检测方式; 多反应监测(MRM)模式; 接口温度:300 ℃; 离子源电压:3.5 kV; 加热模块温度:400 ℃; 脱溶剂气温度:250 ℃; 干燥气流速:10 L/min; 加热器流速:10 L/min; 校准方法:质量轴自动调谐校正; 其他参数见表 1。
考察了以下3组流动相在1.4节流动相梯度条件下的色谱行为:1组中A为乙腈, B为水溶液; 2组中A为甲醇, B为水溶液; 3组中A为甲醇, B为1 mmol/L乙酸铵溶液。结果显示:1组和2组的灵敏度明显偏低, 并且离子化稳定性不够, 说明在以一定比例水为流动相的条件下, 氟虫腈及其代谢产物的离子化不够完全。而3组目标峰峰形较好, 灵敏度明显比1组和2组高, 说明以甲醇和1 mmol/L乙酸铵水溶液做流动相时, 离子化程度高、稳定性好。所以最终选择流动相A为甲醇、B为1 mmol/L乙酸铵溶液。氟虫腈及其3种代谢产物的MRM谱图见图 2。
取质量浓度为0.5 mg/L的4种标准溶液, 进行母离子和子离子扫描。发现氟虫腈及其代谢产物在负离子模式下的方法稳定性和重复性较正离子模式下好, 故本方法采用负离子模式进行检测。
在负离子模式下对氟虫腈及其代谢产物进行母离子扫描, 扫描范围为m/z 350~500, 得到[M-H]-峰。确定母离子后, 调节离子源电压, 当离子源电压为3.5 kV时, 一级扫描响应最高。确定母离子及其条件后, 继续进行子离子扫描, 以得到最佳的二级质谱条件, 经仪器自带的二级质谱参数自动优化程序优化, 得到4种目标化合物的二级质谱优化参数(详见表 1)。将优化后的定量定性离子对、碰撞能量以及Q1和Q3预四极偏置电压作为氟虫腈及其代谢产物的扫描参数。
氟虫腈及其代谢产物的提取溶剂一般采用乙酸乙酯、甲醇、乙腈及一些混合溶剂, 而分散固相萃取法提取药物残留一般采用的提取溶剂为酸化乙腈, 所以本文采用含一定体积分数乙酸的乙腈作为提取剂[23, 24]。分别使用含0.5%(体积分数, 下同)、1%和2%乙酸的乙腈溶液作为鸡蛋中氟虫腈及其代谢产物的提取溶剂, 结果显示, 含1%乙酸的乙腈溶液的提取效率最好, 氟虫腈及其代谢产物的回收率均达到95%以上, 符合实验要求。
样品经含1%乙酸的乙腈溶液提取后, 提取液经由含一定比例的无水硫酸钠、C18-N和NH2-PSA组成的净化剂进行处理, 以减小样品的基质效应(ME)。无水硫酸钠、C18-N和NH2-PSA是常用的分散固相萃取净化吸附剂, 其中无水硫酸钠(一般用量为500~1 500 mg)主要用于除去样液中的水分, 以保证其他吸附剂的吸附能力; C18-N(一般用量为100~500 mg)用于除去脂肪类杂质; NH2-PSA(一般用量为100~500 mg)主要吸附色素、金属离子、有机酸等。如表 2所示, 本研究对3种净化剂组分的用量配比进行正交试验优化, 无水硫酸钠、C18-N及NH2-PSA用量分别作为因素A、B、C, 每个因素取3个水平, 按照L9(33)正交表试验, 比较50 μg/L加标水平下各因素组合的回收率和净化效果, 来选择最佳配比组合。结果表明, 使用1 000 mg无水硫酸钠、250 mg C18-N以及250 mg NH2-PSA组成的净化剂可以获得良好的净化效果。
基质效应会对方法灵敏度、精密度以及准确度造成影响[21-24]。前处理净化过程采用优化后的净化剂比例, 较好地去除了样品中的脂肪、蛋白质等, 能消除部分基质带来的干扰, 此外, 本研究通过优化色谱分离条件较好地降低了基质效应。基质效应可以用基质标准曲线的斜率与溶剂标准曲线的斜率比进行评估。基质标准曲线配制如下:分别取6份空白样品各2.0 g(检测结果为阴性的鸡蛋、鸭蛋、鹌鹑蛋)于50 mL聚丙烯离心管中, 分别加入适量质量浓度为1 mg/L的混合标准品储备溶液。按1.2节制备基质标准曲线, 配制成质量浓度为0.4、2.0、10、20、50和100 μg/L的基质标准品系列溶液。按1.4节条件进行分析, 分别得到以鸡蛋、鸭蛋和鹌鹑蛋为基质的基质标准曲线, 用所得的基质标准曲线斜率与溶剂标准曲线斜率的百分比进行评估。一般情况下, 基质效应值在85%~115%之间不存在明显的基质效应, 本文基质效应值在95.6%~102.9%之间, 所以本检测方法较好地降低了基质效应, 保证了定性、定量结果的准备、可靠。
取1.2节中已配制的混合标准品系列溶液, 分别进样1 μL, 以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标进行线性关系考察, 结果见表 3。氟虫腈及其3种代谢产物在各自线性范围内线性关系较好(相关系数r2均不小于0.998 9)。
取2.0 g空白样品(检测结果为阴性的鸡蛋), 加入适当稀释的混合标准品储备溶液, 按1.3节制备供试品溶液。以信噪比为3和10时的含量分别为氟虫腈及其3种代谢产物的检出限与定量限, 结果氟虫腈及其代谢产物的定量限均为0.2 μg/kg, 详见表 3和图 3。
如表 4所示, 取空白样品(检测结果为阴性的鸡蛋)各2.0 g, 分别加入适量的混合标准品溶液, 使最终含量分别为0.5、5.0和20 μg/kg, 按样品制备方法制备供试品溶液, 检测含量, 每个水平平行试验6次, 计算回收率。氟虫腈及其3种代谢产物的平均回收率为95.09%~103.26%, 相对标准偏差为0.8%~3.9%。
利用本文建立的前处理和色谱、质谱条件对杭州市市售20批次鸡蛋、10批次鸭蛋和5批次鹌鹑蛋中氟虫腈及其3种代谢产物进行了检测。结果显示, 氟虫腈及其3种代谢产物均未检出。
本研究建立了分散固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定禽蛋中氟虫腈及其代谢产物残留的分析方法, 优化了色谱、质谱条件及提取和净化条件。该方法无需复杂的样品前处理, 有效降低了基质效应, 提高了分析方法的选择性和灵敏度。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1211-1215
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2017,
Vol. 35 Issue (12): 1211-1215
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