近年来, 随着可支配收入的稳步增长, 我国居民在饮食方面更加注重营养和健康, 对水产品的需求量逐年增大, 促进了水产行业的快速发展。但是, 商家在水产品的生产运输、市场销售和餐饮环节, 为了治疗或预防各类疾病, 存在误用、滥用禁用(或限用)兽药的现象, 出现了食品动物产生耐药性、动物疫病控制受到影响、动物性食品中药物残留等问题, 人体长期摄入含有药物残留的水产品将在体内产生蓄积, 引起“三致作用”(即致癌、致突变、致畸形)[1]。因此, 我国、美国、日本、欧盟、国际食品法典委员会等对兽药在食品动物中的使用进行了限定[2], 兽药残留也日益受到世界各国及地区的重视。
随着科技的不断进步, 兽药残留的检测已迅速向多种类、高通量发展。色谱-质谱法因具有较高的灵敏度和选择性而成为检测复杂动物组织中兽药多残留的主流方法。目前报道的主要方法有气相色谱-质谱法(GC-MS)[3, 4]、液相色谱-三重四极杆质谱联用法(LC-Qtrap MS)[5-8]、液相色谱-离子阱质谱法(LC-Ion Trap/MS)[9-11]、液相色谱-飞行时间质谱法(LC-TOF/MS)[12-15]和液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法(LC-HRMS)[16-19]等。由于兽药种类较多, 类别间差异较大, 多种兽药残留同时提取的前处理过程相对复杂。例如GC-MS的前处理需要进行衍生化; LC-MS为了保护目标物质在提取过程中不发生分解、变性等, 在样品提取过程中往往通过加入缓冲溶液或者调pH值等手段来保证目标物的回收率以满足检测要求[6, 10, 12, 15, 20]。LC-HRMS在全扫描模式下提取目标化合物的精确质量数, 采用自动触发采集二级质谱图, 进一步提高了定性的准确性[21], 有利于使用简便的前处理方法。目前有文献报道了奶粉[16]、猪肉[17]、饲料[18]、蜂蜜[19]等基质中兽药残留的测定方法, 但在水产品兽药多残留检测方面的研究鲜有报道。
本文建立了超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱同时检测水产品中甾体类、非甾体类、四环素类、硝基呋喃类、苯并咪唑类、磺胺类、喹诺酮类、大环内酯类、硝基咪唑类等64种兽药残留的方法, 前处理简单, 结果准确, 适用于大批量水产品中多种兽药残留的监测。
UltiMate 3000Q Exactive超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪(UPLC-HRMS, 配可加热电喷雾离子源(HESI)离子源, TraceFinder 3.3EFS数据处理系统, 美国Thermo Fisher公司); Accucore RP-MS色谱柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm, 美国Thermo Fisher公司); CP2250天平(德国Sartorius公司); 涡旋混合器(德国IKA公司); MMV-1000W超声振荡器(日本EYELA公司); SIGMA 2-16K台式离心机(德国Sartorius-Sigma公司); BUCHI Synocre平行定量浓缩仪(瑞士步琪公司); Milli-Q纯水机(美国Millipore公司); 0.22 μm有机相滤膜(上海安谱公司)。
乙腈、正己烷、甲醇均为色谱纯(美国默克公司); 无水硫酸钠为分析纯(广州化学试剂厂, 使用前在650 ℃的马弗炉内灼烧4 h); 乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)吸附剂和十八烷基硅烷(C18)吸附剂(德国CNW公司); 氨基(NH2)吸附剂(天津博纳艾杰尔公司); 64种兽药(见表 1)标准品(纯度均≥90.0%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司)。
标准储备溶液:分别称取适量的上述标准品, 其中氟甲喹、吡罗昔康、舒林酸、托美丁、酮洛芬、美洛昔康、吲哚美辛、保泰松用乙腈配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备溶液; 恶喹酸先加1 mL 0.1 mol/L NaOH溶液溶解, 再加入甲醇定容到10 mL, 配制成质量浓度为100 mg/L的标准储备溶液; 其余标准品用甲醇配制成质量浓度均为100 mg/L的标准储备溶液。置于-18 ℃冰箱避光保存。
混合标准溶液:分别取上述标准储备溶液, 用甲醇配制成质量浓度为1 mg/L的混合标准溶液, 在2-4 ℃冰箱保存。临用前按需要混合稀释为标准工作溶液。
准确称取均质后的试样(2.00±0.01) g置于50 mL聚丙烯离心管中, 加入10 mL乙腈-水(80:20, v/v)溶液, 涡旋混匀30 s, 超声提取10 min, 加入4 g无水硫酸钠振摇10 min, 以4 000 r/min的速度离心5 min, 取上清液5 mL于平行定量浓缩仪浓缩至近干, 用1 mL含0.1%(体积分数, 下同)甲酸的甲醇-乙腈-水(2:2:6, v/v/v)定容, 加入4 mL乙腈饱和的正己烷，以2 000 r/min涡旋30 s, 超声5 min。放置15 min。取1.2 mL下层液转移至装有50 mg PSA吸附剂的2 mL高速离心管中, 涡旋30 s以上, 于-20 ℃冰箱中放置30 min。然后置于4 ℃离心机以14 500 r/min离心15 min。取下层液过0.22 μm的有机相滤膜, 取滤液进行分析。
取阴性样品, 按1.3节方法处理, 浓缩至近干后, 加入1.0 mL混合标准溶液复溶, 涡旋混匀, 净化, 过0.22 μm有机滤膜, 取滤液进样分析。
色谱柱:Accucore RP-MS柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm); 柱温:30 ℃; 流速:0.3 mL/min; 进样量:10 μL; 流动相:含0.1%甲酸的水溶液(A相), 含0.1%甲酸的乙腈溶液(B相); 梯度洗脱程序:0~15.0 min, 95%A; 15.0~17.0 min, 5%A; 17.0~17.1 min, 95%A; 17.1~20.0 min, 95%A。
离子源:HESI; 采集方式:全扫描/数据依赖二级扫描(Full MS/ddMS2), Top 1(前1强); 一级扫描分辨率为70 000, 二级扫描分辨率为17 500;归一化碰撞能: 20%、40%、60%;喷雾电压(+): 3 200 V; 离子传输管温度: 325 ℃; 加热器温度: 350 ℃; 鞘气(N2)流速:40 Arb; 辅助气(N2)流速:10 Arb; 动态排除: 6 s; 顶点触发: 2~6 s。64种兽药的质谱参数见表 1。
实验首先对比了色谱柱Waters Acquity UPLC BEH C18柱和Thermo Accucore RP-MS柱的分离效果, 发现对于64种目标物, 后者的分离效果、峰形等都优于前者。进一步对流动相进行了优化, 水相选用了含0.1%甲酸的水溶液[12, 18], 有机相对比了乙腈[14]、甲醇[22]、含0.1%甲酸的乙腈溶液[20]和含0.1%甲酸的甲醇溶液[6]。结果显示使用含0.1%甲酸的乙腈溶液时目标物的峰形最好。因此选用Thermo Accucore RP-MS色谱柱, 水相为含0.1%甲酸的水溶液, 有机相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。64种目标化合物的提取离子流色谱图见图 1。
先对目标物进行一级质谱全扫描, 发现其母离子强度达到设定阈值(1×106)时, 自动触发二级质谱扫描, 同时得到母离子的精确质量数以及二级质谱的全扫描信息。采用20%、40%、60% 3种不同归一化碰撞能对化合物进行碎裂, 得到一张碎片离子信息丰富的加合图。进一步优化其余条件, 动态排除对比了6、8、10 s, 发现6 s时峰形结果较好。顶点触发为2~6 s, Top 1时可获得满意的二级质谱图。
用乙腈-水(1:9, v/v)溶液将混合标准溶液稀释至100 μg/L, 在Full MS/ddMS2 (Top 1)下进行测定, 确定目标物为[M+H]+准分子离子峰。依据目标物的分子式和碎片离子信息拟合出理论精确质量数。64种目标化合物的加合方式均为[M+H]+。其分子式、标准品的纯度及质谱参数(保留时间、母离子和碎片离子的理论精确质量数)见表 1。
64种兽药涉及14类, 各类物质的化学性质有一定的差异。多兽药残留分析过程中提取和净化至关重要[23]。文献报道的提取液有乙腈水溶液[23]、含0.1%甲酸的乙腈[20]、含0.1%甲酸的甲醇[12]、乙腈[24]等, 乙腈的提取效率明显高于甲醇[25], 也有文献提出对于多种兽药的提取, 虽然加入适当的甲酸有助于提高目标物的提取效率, 但是有部分兽药在酸性条件下不稳定, 不建议在提取液中加入酸[23]。因此, 本实验仅比较了乙腈-甲醇-水(4:3:3, v/v/v)溶液和乙腈-水(7:3, v/v)溶液, 结果显示后者比前者的提取效率高(见图 2)。
进一步对比不同体积比的乙腈-水溶液后发现, 乙腈-水(6:4, v/v)溶液和乙腈-水(8:2, v/v)溶液提取效率更好且无显著差异(见图 2)。考虑到提取液中水占比高将延长后续的除水和浓缩时间, 最终采用乙腈-水(8:2, v/v)作为提取液。
实验对比了常用除水剂无水硫酸钠和无水硫酸镁的除水效果。当使用无水硫酸镁时, 四环素类化合物的回收率降低, 可能是四环素类化合物与Mg2+结合, 形成配合物[22], 土霉素、拖美汀、保泰松等目标物的回收率也明显降低。通过比较, 最后采用4 g无水硫酸钠作为除水剂。
实验对比了C18、PSA、NH2吸附剂对净化效果的影响。C18对脂肪等疏水性共提物吸附较强, 同时也可吸附非极性物质。PSA、NH2吸附剂的吸附作用机理相似, 都可用于去除极性干扰物质。加入NH2吸附剂, 硝基咪唑类药物的回收率明显低于使用C18或PSA。使用C18时除了对于特硝唑等少数目标物的回收率优于PSA外, 其余大部分的回收率均明显低于PSA。实验选择以PSA作为吸附剂, 使用量选择对比了50、80、100和120 mg, 结果显示, 当PSA吸附剂为50 mg时, 大多数目标物均可获得较好的回收率。最终选择使用50 mg的PSA作为净化用吸附剂。
提取液浓缩近干后需要复溶。有文献报道使用0.1%甲酸的乙腈-水(1:4, v/v)[20]和1%甲酸乙腈-1%甲酸水(4:6, v/v)[22]进行复溶, 本文对比了0.1%甲酸乙腈-水(6:4, v/v)、0.1%甲酸乙腈-水(7:3, v/v)、0.1%甲酸乙腈-水(8:2, v/v)、甲醇-水(6:4, v/v)、甲醇-水(7:3, v/v)、甲醇-水(8:2, v/v)、0.1%甲酸水-甲醇-乙腈(8:1:1, v/v/v)、0.1%甲酸水-甲醇-乙腈(6:2:2, v/v/v), 实验结果显示, 当使用0.1%甲酸水-甲醇-乙腈(6:2:2, v/v/v)为复溶液时, 目标物的回收率平均水平最高(见图 3)。
基质效应(matrix effect, ME)是由基质中的共提干扰物(非目标化合物)与目标化合物竞争电离所致, 单独采用10 μg/L的加标水产品对基质效应进行了计算, 按照公式:ME=(1-样品基质中添加相同含量化合物的响应值/纯溶剂中化合物的响应值)×100%, ME结果为正值表示增强, 负值表示抑制, 绝对值越大ME越强[22]。通过实验对鱼、虾、贝进行了评估, 虾和贝的基质效应干扰整体水平大于鱼类, 结果见附表 1(http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/sp1708021-supporting%20info-Table%20S1.pdf)。
在优化条件下, 以鲩鱼基质为例, 添加目标兽药混合标准溶液至理论添加量(10 μg/kg)。按1.3节进行前处理, 比较初始流动相和空白基质溶液配制的系列梯度标准溶液的定量结果。结果表明, 基质匹配法能更有效地消除基质效应的干扰。
利用空白基质溶液逐级稀释配制不同质量浓度的混合标准溶液:400、200、100、50、25、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 2、0.078 1、0.039 0 μg/L。在优化后的仪器条件下进行测定, 以各化合物在质谱中的响应面积(y)为纵坐标, 质量浓度(x, μg/L)为横坐标进行线性拟合, 得到各化合物的线性范围及其对应的相关系数(r2), 各化合物的r2均不小于0.996 7(见附表 1: http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/sp1708021-supporting%20info-Table%20S1.pdf)。
《GB/T 27404-2008实验室质量控制规范食品理化检测》中方法的测定低限(CL)按照公式:CL=3Sb/b计算(其中Sb为空白值标准偏差, b为方法校准曲线的斜率)。对于高分辨质谱, 因操作过程中空白样品的测量值无法获取, 不能通过计算得到CL。同时, 使用目标物的精确质量数提取, 大部分目标化合物色谱图的基线噪音极低, 不适于用3倍信噪比(S/N=3)、10倍信噪比(S/N=10)来确定检出限(LOD)和定量限(LOQ)。因方法验证时各化合物的加标回收试验结果满足食品理化检测方法确认的技术要求, 故本方法的定量限为各化合物的最低加标浓度。
在空白水产品基质鲩鱼、南美对虾、北极贝中分别添加低、中、高3个水平的混合标准溶液, 每个添加水平重复测定6次, 目标化合物的回收率为56.2%~126.4%, RSD为1.3%~29.8%, 满足实际检测的要求, 结果见附表 1(http://www.chrom-China.com/UserFiles/File/sp1708021-supporting%20info-Table%20S1.pdf)。
采用所建立的方法, 对从市场购得的24份水产品进行检测。在冻罗非鱼片、冰鲜鳙鱼头、鳌山鱼肉、黄骚根鱼肉、鲮鱼肉、南美对虾、鳗鱼肉等7份样品中检出4-甲酰氨基安替比林, 其中冻罗非鱼片5.144 μg/kg, 冰鲜鳙鱼头23.626 μg/kg, 南美对虾1.412 μg/kg。4-甲酰氨基安替比林是安乃近代谢物, 在农业部公告第235号的附录2中, 仅规定了牛、猪、马的肌肉、脂肪、肝、肾中4-氨甲基-安替比林(安乃近另一个代谢物)的最高残留限量为200 μg/kg。水产品中检出有可能来自环境的污染或养殖户使用的兽药为复配制剂。图 4为阳性冰鲜鳙鱼头的提取离子流色谱图和质谱图。
本研究使用超高效液相色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱, 建立了同时检测水产品中64种兽药残留的方法。该方法检测成本低, 周期短, 稳定性好, 准确度高, 适用于日常对大批量水产品中兽药残留的快速筛查。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1266-1275
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2017,
Vol. 35 Issue (12): 1266-1275
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