微囊藻毒素(microcystins, MCs)是一类单环七肽毒素, 主要由铜绿微囊藻(microcystis aeruginosa)等淡水藻类产生, 目前发现至少存在80多种异构体, 是蓝藻水华污染中出现频率最高、产生量最大和造成危害最严重的藻类毒素(algae toxin), 具有多器官毒性、遗传毒性和致癌性, 能够强烈抑制蛋白磷酸酶的活性, 还是强烈的肝脏肿瘤促进剂, 对肾脏、脾脏也有一定毒性[1-3]。世界卫生组织(WHO)暂定微囊藻毒素的每日耐受摄入量(TDI)为0.04 μg/(kg\5d), 我国生活饮用水国家标准只规定微囊藻毒素-LR(MC-LR)的限量值为0.001 mg/L[2]。节球藻毒素(nodularin, NOD)是由泡沫节球藻(nodularia spumigena)产生的、与微囊藻毒素相似的环状五肽结构, 其毒性强, 不仅是肿瘤促进剂, 还是直接的致癌物质[4], 目前我国生活饮用水中尚无该物质的限量标准。随着我国经济的快速发展, 工业化进展迅速, 污水排放量逐年增加, 淡水湖泊富营养化的现象日趋加重, 频繁暴发蓝藻水华, 藻细胞释放出多种毒素, 降低了饮用水的安全性, 危害人类和动物的健康[5]。因此建立一种快速、高灵敏的同时测定多种微囊藻毒素和节球藻毒素的检测方法显得十分必要。
目前, 水中MCs的检测方法主要有高效液相色谱-紫外检测法[6-10]和液相色谱-串联质谱法[11-26]等, 同时测定水中MCs和NOD的方法主要有液相色谱-串联质谱法[18, 20, 22, 23, 26]。液相色谱-紫外检测法测定水中微囊藻毒素为国家标准分析方法[27], 需用5 L水样过玻璃纤维(GF/C)滤膜, 滤液过含有5 g填料的反相固相萃取柱进行富集和净化后定容至1.0 mL(浓缩5 000倍); 滤膜上的藻细胞冻融3次后, 用100 mL 5%(v/v)乙酸水溶液提取3次, 提取液过含有500 mg填料的反相固相萃取柱进行富集和净化, 结果以滤液和滤膜上测定结果之和来表示, 但该法过程繁琐、耗时, 且灵敏度低, 定性能力差。液相色谱-串联质谱法具有灵敏度高、选择性好等优点, 特别适合水中藻类毒素多组分的同时测定, 可结合固相萃取的样品前处理方法或直接进样法。固相萃取法的检出限随样品浓缩倍数的不同而不同, 最低可达ng/L级[18], 一般更适合清洁水样中超低含量藻类毒素的监测, 样品前处理比较复杂, 高倍数的浓缩还可能产生基质效应; 直接进样分析法快速方便, 检出限多在亚μg/L级, 能够满足国标限量的要求。
本文着重对水样直接进样的条件进行了研究, 考察了4种不同种类的滤膜对12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的吸附情况, 找到了合适的滤膜和过滤条件, 同时选择不同基质的样品进行基质效应评估, 对方法的准确度、精密度及灵敏度进行了验证, 建立了直接进样-液相色谱-三重四极杆质谱同时检测水中12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素(具体结构式见图 1)的分析方法, 并将其应用于生活饮用水和地表水的检测, 取得了满意的结果。
超高效液相色谱仪由ACQUITY UPLC BSM二元溶剂管理系统、ACQUITY UPLC FTN样品管理系统和ACQUITY UPLC CM-A色谱柱管理系统组成, 由Empower 3工作站控制(美国Waters公司); QTRAP 6500三重四极杆/复合线性离子阱串联质谱仪(美国AB SCIEX公司), 由Analyst 1.6.2软件控制; 3-30 K高速冷冻离心机(德国Sigma公司); 2510超声波清洗机(美国Branson公司); Gradient A10 Milli-Q超纯水器(法国Millipore公司)。聚醚砜(polyethersulfone, PES)滤膜针式过滤器(直径13 mm, 滤膜孔径0.45 μm, 上海安谱实验科技股份有限公司)。
甲醇和乙腈为HPLC级(德国Merck公司); 甲酸为HPLC级(美国Tedia公司)。微囊藻毒素标准物质:MC-LR、MC-YR、MC-RR、MC-LW、MC-LA、MC-LF、MC-LY、MC-WR、MC-HilR、MC-HtyR、[D-ASP3]MC-RR、[D-ASP3]MC-LR和NOD(纯度均≥95%)均购自瑞士Alexis Biochemicals公司。
称取适量上述标准物质, 用甲醇配制成25 mg/L的标准储备溶液, 于-35 ℃冰箱中保存; 根据需要, 用甲醇配制成各藻类毒素的质量浓度均为1.0 mg/L的混合标准溶液。
用玻璃吸管吸取1.0 mL水样, 置于5.0 mL玻璃离心管中, 再加入1.0 mL甲醇, 混匀, 过0.45 μm聚醚砜滤膜后, 待测。
用玻璃吸管吸取1.0 mL水样, 置于4.0 mL玻璃瓶中, 冻融3次, 加入1.0 mL甲醇, 混匀, 过0.45 μm聚醚砜滤膜后, 待测。
分析柱:ACQUITY UPLC BEH 300 C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 保护柱:VanGuard BEH 300 C18柱(5 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温:45 ℃; 流动相:(A)含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液和(B)0.2%(v/v)甲酸水溶液。梯度洗脱程序:0~2.0 min, 27%A~40%A; 2.0~3.0 min, 40%A~43%A; 3.0~4.0 min, 43%A~95%A; 4.0~6.0 min, 95%A; 6.0~6.1 min, 95%A~27%A; 6.1~8.0 min, 27%A。流速:0.4 mL/min; 进样体积:10 μL。
离子源:电喷雾离子源, 正离子模式; 离子源温度(TEM): 400 ℃; 监测模式:多反应监测(MRM); 离子化电压(IS): 5 500 V; 气帘气(CUR)压力:277 kPa(40 psi); 喷雾气(GS1)压力:414 kPa(60 psi); 辅助加热气(GS2)压力:483 kPa(70 psi); 碰撞气(CAD): Medium; 质谱峰驻留时间(dwell time): 10 ms。其他质谱参数详见表 1。
在电喷雾正离子模式下对质谱的测定条件进行优化, Q1扫描时微囊藻毒素类物质可见单电荷离子峰([M+H]+)和双电荷离子峰([M+2H]2+), 而节球藻毒素则只有单电荷离子峰([M+H]+)。分别对每种微囊藻毒素的单电荷离子[M+H]+和双电荷离子[M+2H]2+进行分析, 通过子离子扫描得到目标化合物的碎片离子信息, 然后再对去簇电压、碰撞能量等参数进行优化, 使得分子离子对的信号达到最强。结果显示, 微囊藻毒素类物质以双电荷离子[M+2H]2+作为母离子的分子离子对的响应值均比单电荷离子[M+H]+的分子离子对的响应值要高, 故选择双电荷离子[M+2H]2+作为母离子的分子离子对。节球藻毒素以单电荷离子峰([M+H]+)作为母离子进行优化。每种待测物选择响应最高的两对分子离子对, 以响应较强的子离子作为定量离子, 另一个子离子作为定性离子。再设定合适的峰驻留时间确保色谱峰的采样点数在15~20, 从而得到较好的定量重复性。优化后的测定条件见1.3.2节。
比较了ACQUITY UPLC 100 mm×2.1 mm规格的BEH C18 (1.7 μm)、HSS T3 (1.8 μm)和BEH 300 C18 (1.7 μm)3种色谱柱对13种待测物分离效果的影响。结果表明, 采用ACQUITY UPLC BEH 300 C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)时, 目标物的峰形最好, 响应值最高, 故选为实验所用。
本研究对流动相组成进行优化，分别考察了甲醇-水、乙腈-水及在有机相和(或)水相中加入甲酸或乙酸铵缓冲盐的分离效果。结果显示, 采用乙腈(含0.1%(v/v)甲酸)-水(含0.2%(v/v)甲酸)的流动相系统时目标化合物的离子化效果最好。本文同时对流动相梯度洗脱程序和柱温等条件进行了优化, 最终使得各待测物的色谱保留时间适当, 待测物间的分离度较好, 优化后的色谱条件见1.3.1节。
微囊藻毒素和节球藻毒素的性质极其稳定, 易溶于水、甲醇和乙醇等极性溶剂。常见的样品前处理方法主要有固相萃取法[6-12, 15, 19]和直接进样分析法[14, 18, 20-22, 24-26]。固相萃取法有磁性纳米粒子固相萃取法[10]、离线反相固相萃取法[6-8, 11, 12]和在线反相固相萃取法[9, 17-19]等。固相萃取法虽能富集待测物, 去除杂质, 但与直接进样法相比, 操作繁琐, 因此本文选用直接进样法结合液相色谱-串联质谱法。文献报道的直接进样分析法，有的采用聚醚砜滤膜[24]、亲水性聚丙烯(hydrophilic polypropylene, GHP)滤膜[25]过滤并测定MC-LR; 有的选用GHP滤膜直接过滤并测定9种MCs[14]; 有的选用聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)滤膜过滤并测定7种MCs[26]。Pekar等[22]采用PVDF滤膜时, 发现滤膜对MC-HiLR、MC-LA、MC-LF、MC-LY和MC-LW有吸附作用。
本文考察了亲水性聚丙烯滤膜、尼龙滤膜、聚醚砜滤膜和亲水聚四氟乙烯滤膜等4种滤膜对12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的吸附情况。结果显示, 分别采用4种滤膜直接过滤水样后12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素均无法同时达到满意的回收率, 特别是脂溶性较大的MC-LW、MC-WR、MC-LF、MC-LA和MC-LY, 可能是滤膜对目标物有吸附作用。甲醇具有解吸附作用, 在水样中加入甲醇, 其回收率有所改善。实验同时考察了采用不同滤膜时甲醇的体积分数对目标物回收率的影响(见图 2a-d)。当水样中甲醇的体积分数达到50%及采用聚醚砜和尼龙滤膜时13种藻类毒素的回收率均能达到满意的结果, 回收率分别为94.9%~114.1%和90.4%~116.5%，考虑价格因素, 试验选用国产聚醚砜滤膜进行过滤。因此本法先将水样用等体积的甲醇稀释, 再用聚醚砜滤膜过滤。
同时考虑到高速离心法可有效去除样品溶液中的颗粒性物质, 还考察了采用高速离心法时不同体积分数的甲醇对目标物回收率的影响(见图 2e)。在Eppendorf管中加入12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的加标水溶液, 于4 ℃以15 000 r/min离心5 min后进行测定。结果发现, 12种微囊藻毒素的回收率均小于74%, 节球藻毒素的回收率为97.7%。原因可能是Eppendorf管为聚丙烯材质, 具有一定的亲脂性, 会吸附MCs。在水样中加入甲醇, 目标物的回收率有所提高, 水样中甲醇的体积分数达到30%~50%时, 12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的回收率为86.2%~111.7%。但对于含有藻类的实际水样, 高速离心后测得结果明显高于采用聚醚砜滤膜过滤时的结果(见图 3), 可能是高速离心导致藻细胞破裂, 使得藻类毒素向水中释放, 这与文献[26]报道结果一致。
研究发现，实验过程中尽量避免水样与塑料器材(容器、移液枪头等)接触, 以免藻类毒素被吸附, 可使用玻璃器具(容器、移液管、吸管等)代替。
原水可能含有藻细胞, 当藻细胞破裂或衰老时释放进入水中的毒素称为胞外毒素(extracellular toxins)；藻细胞内的毒素为胞内毒素(intracellular toxins)。若水样直接过滤测定, 测得结果为胞外藻毒素的含量, 若经过冻融处理使得藻细胞破裂, 再进行测定，结果为水样中总毒素的含量, 即胞外毒素和胞内毒素的含量之和[6, 22]。因此本实验采用膜过滤直接进样法测定胞外藻毒素, 冻融处理后膜过滤直接进样法测定总毒素。
本研究考察了样品的基质效应(matrix effect, ME), 分别量取不含微囊藻毒素和节球藻毒素的自来水和河水(浑浊度56 NTU), 加入一定量藻类毒素的混合标准溶液, 使得各藻类毒素的质量浓度均为2.0 μg/L, 用甲醇等体积稀释，过滤膜后进样分析, 以每种藻类毒素的峰面积与混合标准溶液(1.0 μg/L)中相应藻类毒素的峰面积之比来评估样品的基质效应。结果表明, 各藻类毒素的基质效应均在85%~112%之间, 显示没有明显的基质效应[28]。对于严重水华的样品, 由于大量藻渣堆积, 藻细胞代谢产生的有机物质使得样品基质较为复杂[29], 采用直接进样法可能会有基质效应的影响。沈斐等[13]提出了通过稀释样品或减少进样量的方法来消除或降低微囊藻毒素的基质效应。
用50%(v/v)甲醇水溶液将12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素混合标准溶液配制成合适浓度的系列标准溶液, 进样测定, 采用MultiQuant定量软件进行数据处理, 以定量离子对的峰面积(y)对系列标准溶液的质量浓度(x, μg/L)进行回归(权重取1/x), 13种待测物的线性范围和回归方程见表 2。结果表明, 在各自的线性范围内, 13种目标物的线性关系良好, 相关系数(r)均≥0.994。
在空白样品中加入低水平的13种待测物, 以两对分子离子对的信噪比均≥3时对应的质量浓度作为方法的检出限(LOD), 以信噪比≥10时的质量浓度作为定量限(LOQ), 测得的检出限和定量限见表 2。超过测定上限的样品应稀释后再进行测定。
分别对自来水和河水样品进行加标回收试验, 每个水平做6份平行试验, 其回收率和精密度结果见表 3。结果表明, 目标化合物的加标回收率为79.5%~123%, RSD为1.0%~20%(n=6), 符合痕量分析的要求。
本研究共检测了10份自来水厂出厂水和2份水库水。10份出厂水中均未检出13种藻类毒素; 2份水库水中1份检出MC-LR(0.34 μg/L)、MC-RR(0.50μg/L)和MC-YR(0.03 μg/L), 另1份检出MC-LR(0.050 μg/L)和MC-RR(0.050 μg/L), 其余藻类毒素均未检出, 结果均符合国标限量要求。
本文建立了生活饮用水和地表水中12种微囊藻毒素和1种节球藻毒素的超高效液相色谱-三重四极杆质谱的检测方法。通过样品前处理条件的考察和优化及对样品基质效应的评估, 证明了水样直接进样分析的可行性; 通过对色谱分离和质谱检测等条件的优化, 得到了较高的检测灵敏度。方法学验证结果表明, 该法快速、简便, 灵敏度高, 准确度和精密度好, 可应用于实际样品的检测。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1286-1293
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