色谱  2017, Vol. 35 Issue (12): 1245-1250   PDF    
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潘胜东
陈晓红
何仟
李晓海
王立
周健
金米聪
超高效液相色谱-高分辨质谱确证分析泥鳅体内五氯酚代谢物
潘胜东1, 陈晓红1, 何仟2, 李晓海1, 王立1, 周健1, 金米聪1     
1. 宁波市疾病预防控制中心, 浙江省微量有毒化学物健康风险评估技术研究重点实验室, 宁波市毒物研究与控制重点实验室, 浙江 宁波 315010;
2. 中国疾病预防控制中心, 职业卫生与中毒控制所, 北京 100050
收稿日期：2017-09-06
基金项目：宁波市自然科学基金项目（2016A610178）；浙江省公共卫生应急检测关键技术重点实验室开放基金项目；宁波市领军和拔尖人才工程
通讯联系人：金米聪, E-mail:jmcjc@163.com
摘要：建立了超高效液相色谱-高分辨质谱（UPLC-HRMS）鉴定泥鳅体内五氯酚代谢物五氯酚磺酸酯的方法。将在低浓度五氯酚下暴露的泥鳅样品粉碎，采用含8%（体积分数）三乙胺的70%（体积分数）乙腈水溶液提取，经混合阴离子交换小柱萃取净化，在ACQUITY BEH C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）上分离，采用电喷雾负离子（ESI-）一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描（full mass-ddMS2）模式测定，获得代谢物的准分子离子、同位素离子和二级质谱碎片离子的精确质量数。结果表明，五氯酚在泥鳅体内的代谢以磺化为主，没有发现羟基化和葡萄糖醛酸化。代谢物主要为五氯酚磺酸酯，其含量随着暴露时间（t）的延长逐渐增加，当暴露时间为36 h时达到峰值，随后逐渐减小，当t ≥ 120 h时，五氯酚磺酸酯含量基本维持不变。该方法可用于生物体内五氯酚的代谢研究。
关键词：超高效液相色谱-高分辨质谱    五氯酚    代谢物    泥鳅    
Confirmation and analysis of the metabolites of pentachlorophenol in loaches using ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry
PAN Shengdong1, CHEN Xiaohong1, HE Qian2, LI Xiaohai1, WANG Li1, ZHOU Jian1, JIN Micong1     
1. Key Laboratory of Health Risk Appraisal for Trace Toxic Chemicals of Zhejiang Province, Ningbo Key Laboratory of Poison Research and Control, Ningbo Municipal Center for Disease Control and Prevention, Ningbo 315010, China;
2. National Institute of Occupational Health and Poison Control, Chinese Municipal Center for Disease Control and Prevention, Beijing 100050, China
Foundation item: Ningbo Municipal Science Foundation (No. 2016A610178); Opening Foundation of Key Laboratory of Key Technologies of Emergency Detection for Public Health of Zhejiang Province; Ningbo Municipal Program for Leading and Top-Notch Talents
Abstract: A method for the characterization of the metabolite pentachlorophenol hydrogen sulfate (PCP-SO3H) of pentachlorophenol (PCP) in loaches was developed based on ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS). The loach samples exposed in low concentration of PCP solution were firstly crushed, then extracted by acetonitrile-water solution (70:30, v/v) containing 8% (v/v) triethylamine and purified by mixed anion exchange solid-phase extraction (SPE) cartridges. The chromatographic separation was carried out on a Waters ACQUITY BEH C18 column (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm). The qualitative analysis of the metabolites of PCP was operated in a negative electrospray ion mode (ESI-) under full mass-data dependent MS2 (full mass-ddMS2) mode, and the data of quasi-molecular ion, isotope ions, and MS2 fragmentation ions of metabolites were obtained. The results revealed that the sulfonation was the main metabolic pathway for PCP in loaches, not the hydroxylation or glucuronate pathway. And the metabolite was found to be PCP-SO3H. Besides, with the increase of exposure time in PCP solution, the concentration of metabolite PCP-SO3H firstly increased; when the exposure time was up to 36 h, the concentration of metabolite in loach reached a maximum value; and then extending the exposure time, the concentration of PCP-SO3H gradually decreased. When the exposure time was up to 120 h, the concentration of PCP-SO3H in loaches reached a lowest value, and no significant change occurred for further time. The developed UPLC-HRMS method in this study could be used for the investigation of the metabolism of PCP in living beings.
Key words: ultra-performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry (UPLC-HRMS)     pentachlorophenol (PCP)     metabolite     loach    

五氯酚(pentachlorophenol, PCP)作为高效廉价的杀虫剂、防腐剂和除草剂, 在世界范围内广泛使用。在国内, 五氯酚主要用于钉螺的杀灭、皮革的防腐以及养殖水体的消毒、清塘等。五氯酚具有明显的生物毒性, 特别是对水生的鱼类和贝类等毒性较大。五氯酚进入高等动物体内, 可通过血液参与机体循环输送到靶器官, 可与血液中细胞、功能蛋白等发生作用, 从而影响正常的生命活动[1]。最新研究表明五氯酚具有抑制生物代谢过程中氧化磷酸化的作用, 会造成生物的肝、肾及中枢神经系统的损害[2]。

国内外的研究[3, 4]主要集中于急性条件下五氯酚对某些生物体的致死剂量和作用, 但对于五氯酚的代谢及代谢物的确证与鉴别工作仍然存在诸多不足, 大多研究仅停留在理论推导阶段[5, 6]。Akitake等[7]采用薄层色谱法研究了金鱼体内五氯酚的代谢物为五氯酚磺酸酯(PCP-SO3H), 然而薄层色谱法存在定性能力弱的局限性。五氯酚在不同生物体内的代谢途径可能完全不同, 如:Fang等[8]推测斑马鱼体内的代谢物主要是四氯对氢醌, 却没有对其推测的代谢物进行进一步的质谱、核磁等定性分析, 缺乏可靠性; 常薇等[5]推测五氯酚主要经过肝脏代谢, 有羟基化和葡萄糖醛酸化等两种代谢途径, 主要代谢物为四氯对氢醌和四氯邻苯二酚, 但缺少对代谢物结构的进一步鉴定。因此, 采用高分辨质谱与核磁共振技术筛查和鉴定生物体内未知代谢物, 以确证生物体内的代谢途径, 是生物体内代谢研究的发展方向[9, 10]。泥鳅是淡水域常见的水生生物, 个体大小适当, 具有生命力旺盛、室内条件容易饲养等优点。本文通过泥鳅在五氯酚溶液中的暴露实验, 采用超高效液相色谱-高分辨质谱(UPLC-HRMS)技术对暴露于低浓度五氯酚溶液中的泥鳅进行代谢物的鉴定、跟踪与检测, 为进一步研究五氯酚在水生生物体内的代谢与转化提供基础的实验数据。

1 实验部分
1.1 仪器

Waters UPLC Ⅰ Class型超高效液相色谱仪(美国Waters公司); Q-Exactive Orbitrap型高分辨质谱仪(美国ThermoFisher公司); Legend RT型离心机(德国Heraeus公司)。

1.2 试剂和耗材

五氯酚标准品(含量＞99.0%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 乙腈、甲醇均为LC-MS级(美国ThermoFisher公司); 甲酸、三乙胺为HPLC级(德国Merck公司); 其他试剂均为国产分析纯。实验用水经Milli-Q纯水系统(美国Millipore公司)处理。Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)和Waters Oasis MAX固相萃取柱(150 mg/6 mL)购自美国Waters公司。

1.3 动物

200条泥鳅, 每条体重约20 g, 购自某菜场。实验前将泥鳅放在超纯水中48 h, 不喂食。

1.4 色谱及质谱条件
1.4.1 色谱条件

色谱柱:Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 进样量:5.0 μL。流动相:A相为0.1%(体积分数, 下同)甲酸水溶液, B相为0.1%甲酸乙腈溶液; 流速:0.30 mL/min。梯度洗脱程序:0~3.00 min, 20%B~90%B; 3.00~7.00 min, 90%B; 7.00~7.01 min, 90%B~20%B; 7.01~10.00 min, 20%B。

1.4.2 质谱条件

离子源:电喷雾离子(ESI)源; 扫描方式:负离子扫描; 质谱扫描方式:一级质谱全扫描加数据依赖的二级质谱扫描(full mass-ddMS2); 离子源温度:320 ℃; 电喷雾电压:-3.0 kV; 鞘气压强:276 kPa; 辅助气流速:200 L/h; 射频棱镜电压(S-lens RF level): 65%;辅助气加热温度:300 ℃。

1.5 样品处理

将在五氯酚溶液中暴露的泥鳅样品搅碎, 称取2.00 g样品于50 mL离心管内, 加入含8%三乙胺的70%乙腈水溶液10 mL, 匀浆1 min, 涡旋10 min, 以8 000 r/min的速度离心5 min, 吸出上清液于具塞试管内, 待净化。

将上述提取液加入已用5 mL甲醇和5 mL水活化与平衡的Waters Oasis MAX固相萃取柱, 控制流速为5 mL/min。分别用8 mL甲醇和8 mL水进行淋洗, 吹干后用10 mL 10%甲酸甲醇溶液洗脱, 收集洗脱液, 于40 ℃用氮气吹至近干, 用甲醇定容至1.0 mL, 供UPLC-HRMS测定。

1.6 毒性试验

挑选健康活泼、大小均匀的泥鳅80条, 分成8组, 每组10条, 采用7个浓度梯度和1个空白对照进行预试验。试验采用常温净水模式, 试验时间为96 h, 根据试验结果确定泥鳅对五氯酚耐受的最高安全浓度。分别配制0、0.01、0.10、1.0、2.0、3.0、5.0、10.0 mg/L五氯酚标准溶液, 将试验泥鳅逐个放入不同质量浓度的五氯酚溶液中, 试验期间不喂食, 将疑似死亡的泥鳅及时捞出, 放入清水中, 5 min无动静即判断死亡。连续观察试验过程中泥鳅的活动情况、体表特征等, 记录死亡与存活数量。

1.7 代谢物定性试验

选择6条经1.0 mg/L五氯酚标准溶液暴露1 h重量约20 g的泥鳅样品, 粉碎后按1.5节方法进行提取与净化, 采用UPLC-HRMS进行分析。对化合物的色谱保留时间(tR)和一级质谱(MS)与二级质谱(MS2)信息进行研究, 并采用Compound Discovery 2.0 (CD 2.0)软件对采集的数据进行综合分析, 以确证五氯酚代谢物的结构信息。

1.8 毒物动力学试验

选择20条重量约为20 g的健康泥鳅暴露于质量浓度为0.1 mg/L的五氯酚溶液中, 采用UPLC-HRMS测定不同暴露时间点(1、2、4、6、12、24、36、48、60、96、120和240 h)下泥鳅体内五氯酚及其代谢物的峰面积, 同时作空白对照试验。

2 结果与讨论
2.1 急性中毒试验

当五氯酚质量浓度≥5.0 mg/L时, 泥鳅放入溶液中即表现出烦躁体征, 快速游动, 体表发红, 1 h即出现100%死亡; 当五氯酚质量浓度为3.0 mg/L时, 1 h时有20%泥鳅死亡, 2 h时有50%死亡, 8 h时100%死亡; 当五氯酚质量浓度≤2.0 mg/L时, 泥鳅健康存活, 96 h内无死亡现象。

2.2 五氯酚残留的定性分析

五氯酚分子结构中含有5个氯原子, 且存在35Cl与37Cl两种同位素, 使得五氯酚具有不同精确质量数的同位素离子峰簇; 由于分子结构中含有-OH, 因此五氯酚在ESI质谱上表现为负离子化模式([M-H]-)。图 1为泥鳅样品体内五氯酚残留的SIM色谱图和一级质谱图, 如图所示, 五氯酚主要包括m/z 262.839 73、264.836 78、266.833 83和268.830 88这4个同位素离子峰, 实验值与理论值的精确质量数偏差均小于0.5 ppm(10-6), 且4个同位素峰之间的丰度比(3.02:5:3.04:1.05)与理论值(3:5:3:1)非常接近, 所以推断经五氯酚暴露的泥鳅体内仍然存在五氯酚原形。

图 1 泥鳅样品体内五氯酚残留的SIM色谱图和一级质谱图 Fig. 1 SIM chromatograms and MS spectra of pentachlorophenol (PCP) residue in loach samples ppm: 10-6.
2.3 代谢物的定性分析

图 2为经1.0 mg/L五氯酚溶液暴露6 h的泥鳅样品的SIM色谱图, 相比五氯酚(tR为1.86 min, 见图 1)的SIM色谱图, 除在相同保留时间(tR=1.86 min)处存在五氯酚的同位素离子峰簇外, 在tR为2.07 min处新增了一个具有相同m/z值的同位素离子峰簇。根据一般经验判断, 这可能是五氯酚的衍生物经ESI源的源内裂解产生的同位素离子峰簇, 该化合物的热稳定性较差, 容易源内裂解形成与五氯酚同位素离子m/z值相同的同位素碎片离子。如图 3所示, 采用CD 2.0软件对试验结果进一步分析, 结果显示, 该化合物可能是五氯酚磺酸酯, 根据该化合物同位素离子的精确质量数理论值(m/z 342.796 54、344.793 59、346.790 64和348.787 69)进行提取, 得到五氯酚磺酸酯的4个同位素离子峰, 且tR也为2.07 min, 对4个同位素离子精确质量数与理论值进行对比, 发现质量数偏差均小于0.5 ppm, 且4个同位素离子峰的相对丰度比(3.04:5:3.01:0.98)与理论值(3:5:3:1)非常接近。通过对五氯酚磺酸酯进行二级质谱扫描(见图 3), 结果显示, 主要的碎片离子为同位素离子, 其m/z值与五氯酚的同位素离子簇完全相同, 由此可以证实上述的推断是正确的。此外, 在质量浓度为0.1 mg/L的五氯酚溶液中暴露的泥鳅体内也检测到了相同的同位素离子峰簇, 而在对照组泥鳅样品中未检测到相关的同位素离子峰簇。

图 2 1.0 mg/L五氯酚溶液暴露6 h后泥鳅样品的SIM色谱图 Fig. 2 SIM chromatograms of loach samples exposed to 1.0 mg/L PCP solution for 6 h

图 3 五氯酚磺酸酯的一级质谱图和二级质谱图 Fig. 3 MS spectra and MS2 spectrum of pentachlorophenol hydrogen sulfate (PCP-SO3H)
2.4 五氯酚及其代谢物动力学试验

图 4a为实验组中不同暴露时间的泥鳅体内五氯酚及其代谢物的SIM色谱图, 由图可知, 当t=1 h时, 泥鳅迅速吸收养殖水中的五氯酚, 且体内主要以五氯酚原形存在; 当t=6 h, 泥鳅体内五氯酚的含量有所减少, 代谢为五氯酚磺酸酯; 当t=12 h时, 泥鳅体内五氯酚进一步减少, 代谢物五氯酚磺酸酯的相对含量已超过五氯酚; 当t=48 h时, 泥鳅体内五氯酚残留已检测不到(低于检出限), 主要以代谢物五氯酚磺酸酯的形式存在。图 4b为不同时间点泥鳅体内五氯酚及其代谢物五氯酚磺酸酯的峰面积变化曲线, 也可得到一致的试验结果:t=36 h时泥鳅体内代谢物五氯酚磺酸酯的含量达到峰值; 而t=48 h为五氯酚代谢完全的时间点, 此时泥鳅体内主要以代谢物五氯酚磺酸酯存在; 随着时间的进一步延长, 泥鳅体内代谢物的含量逐渐减少; 当t≥120 h时, 泥鳅体内代谢物五氯酚磺酸酯基本维持不变。

图 4 泥鳅样品中五氯酚及其代谢物五氯酚磺酸酯随时间变化的(a)SIM色谱图和(b)峰面积曲线 Fig. 4 (a) SIM chromatograms and (b) peak area curves of PCP and its metabolite PCP-SO3H in loach samples with the time varying
2.5 代谢途径

采用UPLC-HRMS对泥鳅体内五氯酚的代谢物进行确证与分析。通过full mass-ddMS2模式对五氯酚不同暴露时间的泥鳅样品进行跟踪监测。结果表明, 泥鳅体内五氯酚的主要代谢物为五氯酚磺酸酯, 经液相色谱和高分辨质谱条件的反复优化, 均未发现泥鳅体内含有其他代谢物, 如五氯酚葡萄糖苷酸和四氯对氢醌等, 因此, 五氯酚在泥鳅体内的代谢以磺化为主, 未发现羟基化和葡萄糖醛酸化作用。五氯酚在泥鳅体内的代谢途径见图 5。试验结果与Akitake等[7]采用金鱼进行五氯酚暴露研究推测的代谢途径相似, 他们采用薄层色谱进行代谢物的定性分析, 在金鱼体内也只检测到五氯酚磺酸酯, 未检测到五氯酚葡萄糖苷酸和四氯对氢醌。然而, 薄层色谱存在定性分析的局限, 本研究采用UPLC-HRMS很好地弥补了这一不足, 可为水生生物的五氯酚暴露研究提供技术支撑。

图 5 五氯酚在泥鳅样品中的代谢途径 Fig. 5 Metabolic pathway of PCP in loach samples Glu: glucuronide; TCHQ: tetrachlorohydroquinone.
3 结论

本研究建立了UPLC-HRMS定性分析泥鳅体内五氯酚及其代谢物的方法, 并用于五氯酚暴露的泥鳅体内代谢物的鉴定、跟踪与检测, 考察了不同暴露时间的泥鳅体内五氯酚及其代谢物的变化情况, 发现代谢物主要为五氯酚磺酸酯, 可为进一步研究五氯酚在水生生物体内的转化提供技术支撑。

参考文献
[1] Liang Q, Zhu X H, Wu G H. Chinese Fishery Quality and Standards, 2012, 2(1): 71.
梁倩, 朱晓华, 吴光红. 中国渔业质量与标准, 2012, 2(1): 71.
[2] Zhang M, Gu Y F, Gu Y, et al. Environmental Chemistry, 2005, 24(3): 302.
张民, 顾宇飞, 顾颖, 等. 环境化学, 2005, 24(3): 302.
[3] Basack S B, Oneto M L, Verrenga G N R, et al. Environ Contam Toxicol, 1997, 58(3): 497. doi: 10.1007/s001289900362
[4] Nie J L, Liu F, Zhou C Y, et al. Research of Environmental Sciences, 2001, 14(3): 6.
聂晶磊, 刘锋, 周春玉, 等. 环境科学研究, 2001, 14(3): 6.
[5] Xu W Q, Fan B L, Chen M, et al. Chinese Journal of Pharmacology and Toxicology, 2011, 25(6): 596.
许文青, 樊柏林, 陈明, 等. 中国药理学与毒理学杂志, 2011, 25(6): 596.
[6] Zhou L X, Chen X H, Jin M C. Journal of Hygiene Research, 2014, 43(2): 338.
周丽新, 陈晓红, 金米聪. 卫生研究, 2014, 43(2): 338.
[7] Akitake H, Kobayashi K. Bull Japan Soc Sci Fish, 1975, 41(3): 321. doi: 10.2331/suisan.41.321
[8] Fang Q, Shi X, Zhang L, et al. J Hazard Mater, 2015, 283(3): 897.
[9] Dong Y, Yu Z M, Li H Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(8): 811.
董宇, 俞忠明, 李洪玉, 等. 色谱, 2016, 34(8): 811.
[10] Bi Y F, Wang Y L, Ye N, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(7): 704.
毕言锋, 王亦琳, 叶妮, 等. 色谱, 2015, 33(7): 704.