色谱  2017, Vol. 35 Issue (12): 1306-1311   PDF    
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刘翠翠
毕晓彤
张爱琳
闫师杰
基于细菌纤维素的毛细管电泳法同时测定果蔬中3种苯并咪唑类杀菌剂
刘翠翠, 毕晓彤, 张爱琳, 闫师杰     
天津农学院食品科学与生物工程学院, 天津 300384
收稿日期：2017-09-07
基金项目：天津农学院科学研究发展基金（2016NZD02）；天津农学院研究生创新培育项目（2017YPY019）
通讯联系人：闫师杰, E-mail:yanshijie@126.com
摘要：建立了高效毛细管电泳同时测定果蔬中3种常见的苯并咪唑类杀菌剂（甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵）的分析方法。以细菌纤维素（BC）为电泳缓冲液添加剂来提高毛细管电泳的分离能力。系统考察了检测波长、缓冲液离子强度、缓冲液pH、分离电压及BC添加量对3种苯并咪唑类杀菌剂分离效果的影响。最终的优化条件：H3BO3/Na2B4O7缓冲液（4 mmol/L，pH 9.0）；BC添加质量分数0.3%；运行电压15 kV；分离柱温25℃；检测波长275 nm。3种苯并咪唑类杀菌剂在8 min之内可实现基线分离及准确定量。结果显示：3种苯并咪唑类杀菌剂在各自线性范围内线性关系良好，相关系数（r2）≥ 0.997；检出限为5.0~10.0 μg/L；保留时间及峰面积的日间相对标准偏差（n=5）分别为0.82%~1.0%和2.4%~2.9%。该法用于葡萄、番茄及黄瓜中3种苯并咪唑类杀菌剂的测定，加标回收率为93.5%~103.0%，RSD ≤ 8.0%。该法可作为果蔬中甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵同时检测的有效手段。
关键词：毛细管电泳    细菌纤维素    苯并咪唑类杀菌剂    甲基硫菌灵    多菌灵    苯菌灵    果蔬    
Simultaneous determination of three benzimidazole fungicides in fruits and vegetables by capillary electrophoresis based on bacterial cellulose
LIU Cuicui, BI Xiaotong, ZHANG Ailin, YAN Shijie     
Department of Food Science and Biology Engineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300384, China
Foundation item: Scientific Research and Development Foundation of Tianjin Agricultural University (No. 2016NZD02); Postgraduate Innovation Cultivation Program of Tianjin Agricultural University (No. 2017YPY019)
Abstract: A simple and rapid capillary electrophoresis (CE) method was developed for the determination of trace thiophanate-methyl, carbendazim and benomyl in fruits and vegetables. Herein, bacterial cellulose (BC) was used as additive in running buffer to improve the separation efficiency. CE experimental parameters such as detection wavelength, concentration and pH of the running buffer, separation voltage as well as the contents of BC in running buffer were systematically investigated. Under the optimized conditions, three benzimidazole fungicides could be accurate quantified in 8 min using H3BO3/Na2B4O7 (4 mmol/L, pH 9.0) containing 0.3% (mass fraction) BC for background electrolyte, 15 kV for the separation voltage, 25℃ for the column temperature and 275 nm for detection wavelength. Good linearities for the three benzimidazole fungicides were obtained with correlation coefficients (r2) ≥ 0.997. The limits of detection (LODs) of the three benzimidazole fungicides were between 5.0 and 10.0 μg/L. The relative standard deviations (RSDs, n=5) of inter-day were 0.82%-1.0% for retention times and 2.4%-2.9% for peak areas. The proposed method was further applied to determine the residues of the three benzimidazole fungicides in fruits and vegetables. The recoveries were in the range of 93.5%-103.0% with RSDs no more than 8.0%. These results indicated that the proposed method can serve as an efficient tool for the simultaneous determination of the three benzimidazole fungicides in fruits and vegetables.
Key words: capillary electrophoresis (CE)     bacterial cellulose (BC)     benzimidazole fungicides     thiophanate-methyl     carbendazim     benomyl     fruits and vegetables    

甲基硫菌灵(thiophanate-methyl)、多菌灵(carbendazim)和苯菌灵(benomyl)均属苯并咪唑类杀菌剂, 主要用于蔬菜、水果、谷物等真菌病害的防治、粮食储藏和种子处理等过程[1]。3种苯并咪唑类杀菌剂对人体有不同的毒理学效应。其中, 甲基硫菌灵具有基因毒性和生殖毒性[2, 3]; 苯菌灵残留过量可引起哺乳动物染色体及肝细胞的微管骨架发现变化[4]。甲基硫菌灵和苯菌灵可降解或代谢为多菌灵, 多菌灵残效期长, 具有蓄积毒性[4, 5]。国家标准GB 2763-2016规定甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵在不同果蔬样品中的最大残留限量为0.1~5.0 mg/kg; 蔬菜、水果中甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵的测定主要基于紫外分光光度法(GB/T 5009.188-2003)和高效液相色谱法(SN/T 0162-2011), 其中甲基硫菌灵和苯菌灵残留限量的检测均以多菌灵计。这不免为农产品中多菌灵来源的判定及农产品安全风险的评估带来不确定性[6]。因此, 开发甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵3种苯并咪唑类杀菌剂同时检测的方法对农产品农药残留严格监管及其代谢组学研究具有重要意义。

目前, 苯并咪唑类杀菌剂多残留检测技术主要为高效液相色谱法[7, 8]，但采用高效液相色谱同时检测甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵的方法还未见报道。毛细管电泳(CE)技术具备分离模式多、分析效率高、样品及有机试剂消耗少等特点, 已被广泛应用于食品中污染物的检测。毛细管区带电泳是较为常用的电泳分离模式, 为了提高分离效率, 往往向电泳缓冲液中加入添加剂, 比如:离子液体、表面活性剂、聚合物材料、糖类大分子等[9-13]。细菌纤维素(bacterial cellulose, BC)是由葡萄糖以β-1, 4-糖苷键连接而成的高分子化合物, 具有超细网状纤维结构、比表面积大、氢键结合能力强等优越性能[14]。Lin等[15]以BC为原料制备羧甲基功能化BC吸附滤膜, 以牛血清蛋白为模型考察其吸附性能, 结果证明该吸附滤膜可以通过羧甲基取代度和静电相互作用两种方式调控对蛋白质的吸附行为。Wang等[16]制备了新型聚乙烯亚胺涂层BC膜, 并成功用于水溶液中重金属离子Cu2+、Pb2+的富集。BC在分离科学领域表现出优越性能。本研究旨在结合CE分析效率高及BC吸附能力强的特点, 构建基于细菌纤维素的毛细管电泳法, 为食品中甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵残留的同时检测提供新途径。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

P/ACE MDQ毛细管电泳仪配二极管阵列检测器(美国贝克曼库尔特有限公司); 毛细管(75 μm, 河北永年光纤厂); FE20 pH计(瑞士Mettler-Toledo公司); XHF-DY高速分散器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

BC(片状, 海南亿德食品有限公司); 氢氧化钠(NaOH, 分析纯)、盐酸(分析纯)、硼酸(H3BO3, 分析纯)、硼砂(Na2B4O7, 分析纯)和N, N-二甲基甲酰胺均购自天津市化学试剂一厂。标准品:甲基硫菌灵(粉末, 纯度97.5%)、多菌灵(粉末, 纯度99%)和苯菌灵(粉末, 纯度99%)均购自上海阿拉丁试剂公司。实验用水为二次去离子水。

1.2 溶液的配制

分别准确称取甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵标准品10 mg, 置于10 mL容量瓶中, 用N, N-二甲基甲酰胺溶解定容至刻度, 配制质量浓度为1 000 mg/L的单标准储备液, 于4 ℃储存, 备用。

将上述储备液用二次去离子水逐级稀释, 配制质量浓度为0.005、0.020、0.025、0.05、0.1、0.2、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 mg/L的单标准工作液。

用二次去离子水分别配制不同浓度的H3BO3和Na2B4O7溶液, 并按照需要配制不同pH值的电泳缓冲液。

1.3 细菌纤维素处理

采用酸水解法对BC进行预处理[17]。称取3.0 g干燥BC, 置于250 mL烧杯中, 加入150 mL蒸馏水, 以2 500 r/min匀浆3 min, 然后以4 000 r/min离心10 min, 除去上清液。在沉淀中加入100 mL 50%(v/v)的硫酸溶液, 于50 ℃水解5 h后, 转移至1 000 mL烧杯中, 加入500 mL蒸馏水终止反应, 然后静置过夜, 除去上层清液, 对下层产物进行离心(10 000 r/min, 10 min), 用二次去离子水洗涤至中性, 冷冻干燥备用。

1.4 样品前处理
1.4.1 提取

参考文献[18]方法对样品进行前处理和净化。具体步骤如下:称取5.0 g样品(番茄、葡萄、黄瓜), 置于250 mL具塞三角瓶中, 加入30 mL二氯甲烷, 以160 r/min振荡提取2 h, 然后以10 000 r/min离心10 min, 移取上清液, 于30 ℃旋转蒸发浓缩至1 mL, 待净化。

1.4.2 净化

在玻璃层析柱(300 mm×15 mm)中由下至上依次装入2 cm无水硫酸钠、5.0 g硅胶和0.2 g活性炭的混合物、2 cm无水硫酸钠。用15 mL丙酮-正己烷(1:9, v/v)活化柱子, 待液面降至上层无水硫酸钠层时进行上样, 然后用10 mL甲醇-丙酮(1:1, v/v)进行洗脱, 收集洗脱液, 于35 ℃旋转蒸发至近干, 用甲醇定容至1 mL, 过0.45 μm有机滤膜, 待测定。

1.5 电泳条件

毛细管(内径:75 μm; 有效长度:50 cm)使用前先进行活化, 分别用1.0 mol/L NaOH溶液、1.0 mol/L盐酸和去离子水各冲洗3 h; 两次运行之间, 毛细管依次用甲醇冲洗1 min, 去离子水冲洗2 min, 分离缓冲溶液冲洗3 min。分离电压为15 kV; 分离温度为25 ℃; 压力进样为3.45 kPa (0.5 psi), 10 s; 波长为275 nm; 运行缓冲液为4 mmol/L H3BO3-Na2B4O7 (pH 9.0)；细菌纤维素添加质量分数为0.3%。

2 结果与讨论
2.1 检测波长的选择

检测波长直接影响分析物的色谱峰强度及方法的灵敏度。紫外全波长扫描结果显示:甲基硫菌灵最大吸收波长为210 nm和269 nm; 多菌灵最大吸收波长为210 nm和282 nm; 苯菌灵最大吸收波长为210 nm和285 nm。为保证3种待测物均有较好的响应, 同时降低杂质的干扰, 最终选择275 nm作为3种苯并咪唑类杀菌剂的检测波长。

2.2 缓冲液pH的选择

分离缓冲液的pH值是影响分析物分离效果及电渗流大小的关键因素。本实验考察了不同pH值(8.5、9.0和9.5)对甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵分离效果的影响。如图 1所示, 随着pH值的升高, 分析物的保留时间有所缩短, 这可能是毛细管内壁硅羟基的解离程度增加, 电渗流增大的原因。当pH值为9.0时，3种苯并咪唑类杀菌剂的分离度最大, 峰形最佳。因此, 选择9.0作为分离缓冲液的最佳pH值。

图 1 分离缓冲液的pH值对3种苯并咪唑类杀菌剂分离效果的影响 Fig. 1 Effects of pH values of running buffer on separation of the three benzimidazole fungicides Running buffer: 4 mmol/L borate buffer (H3BO3-Na2B4O7) containing 0.3% (mass fraction) bacterial cellulose (BC); separation voltage: 15 kV; pressure injection: 3.45 kPa for 10 s; detection wavelength: 275 nm. Peak identifications: 1. thiophanate-methyl; 2. carbendazim; 3. benomyl.
2.3 分离缓冲液离子强度的选择

分离缓冲液的离子强度是电泳过程中影响分析物迁移行为的又一关键因素。如图 2所示, 当分离缓冲液浓度分别为2、4和6 mmol/L时, 3种苯并咪唑类杀菌剂均能达到基线分离，但随着分离缓冲液浓度的增加, 保留时间稍有延长, 这可能是由于双电层厚度减小, 导致电渗流减小。此外, 随着缓冲液浓度的增加, 焦耳热增加, 导致峰形变宽。综合考虑分析时间和峰形效果, 选择4 mmol/L作为分离缓冲液的最佳浓度。

图 2 分离缓冲液的浓度对3种苯并咪唑类杀菌剂分离效果的影响 Fig. 2 Effects of concentrations of running buffer on separation of the three benzimidazole fungicides Running buffer: borate buffer (pH 9.0) containing 0.3% (mass fraction) BC. Other CE conditions were the same as that in Fig. 1. Peak identifications: 1. thiophanate-methyl; 2. carbendazim; 3. benomyl.
2.4 分离电压的选择

高电压能够提高电场强度，从而直接缩短分析时间。但电压升高同样增加热效应, 最终导致柱效和分离度降低。本实验选择15 kV作为最佳分离电压。

2.5 细菌纤维素添加量的选择

为了证明BC对3种苯并咪唑类杀菌剂分离效果的改善作用, 考察了不同BC添加量对分离效果的影响。如图 3所示, 未添加细菌纤维素时, 3种苯并咪唑类杀菌剂的色谱峰基本重叠; 当添加质量分数为0.1%的BC时, 目标物的分离度得到了明显改善, 但多菌灵和苯菌灵仍不能达到基线分离; 继续增加细菌纤维素的添加量至质量分数为0.3%, 多菌灵和苯菌灵基本达到基线分离, 分离度为1.76，但进一步增加BC的添加量, 并不能改善分离效果, 反而会导致重复性的降低。另外, 随着BC添加量的增加, 分析物保留时间延长, 这可能是由于BC表面的羟基经过硫酸处理发生酯化反应, 使BC表面带有负电荷, 其电迁移速度指向阳极, 当目标物通过疏水、氢键等与BC相互作用时, 减缓了目标物的迁移速度。综合考虑, BC的最佳添加量为质量分数0.3%。

图 3 BC的质量分数对3种苯并咪唑类杀菌剂分离效果的影响 Fig. 3 Effects of mass fraction of BC on separation of the three benzimidazole fungicides Running buffer: 4 mmol/L borate buffer (pH 9.0). Other CE conditions were the same as that in Fig. 1. Peak identifications: 1. thiophanate-methyl; 2. carbendazim; 3. benomyl.
2.6 方法学评价
2.6.1 线性关系和检出限

对3种苯并咪唑类杀菌剂标准工作液进行与样品相同的提取、净化过程, 然后进样分析。以分析物的峰面积为纵坐标(Y)、对应的质量浓度为横坐标(X, μg/L)进行线性拟合, 得到3种苯并咪唑类杀菌剂的线性范围和相关系数(r2)。通过3倍信噪比(S/N)得到本方法对3种苯并咪唑类杀菌剂的检出限(LOD), 结果见表 1。甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵在各自的线性范围内线性关系良好, 相关系数≥0.997, 检出限≤10.0 μg/L。

表 1 3种苯并咪唑类杀菌剂的回归方程、相关系数、线性范围及检出限 Table 1 Regression equations, correlation coefficients (r2), linear ranges and limits of detection (LODs) of the three benzimidazole fungicides
2.6.2 精密度

配制0.1 mg/L的甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵标准溶液，同一日内, 连续测定11次, 计算3种苯并咪唑类杀菌剂峰面积和保留时间的相对标准偏差(RSD), 得到日内精密度；配制0.1 mg/L的甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵标准溶液，连续测定5天, 计算3种苯并咪唑类杀菌剂峰面积和保留时间的RSD, 得到日间精密度，计算结果见表 2。3种苯并咪唑类杀菌剂峰面积和保留时间的日内和日间精密度均较小, 证明该方法定量重复性较好。

表 2 3种苯并咪唑类杀菌剂的日间和日内精密度 Table 2 Intra-day and inter-day precisions of the there benzimidazole fungicides
2.6.3 样品测定及加标回收率

实验检测的果蔬样品(番茄、葡萄、黄瓜)均购自当地超市, 经本方法检测, 均为阴性。

分别称取空白果蔬样品5.0 g, 添加1、10和50 mg/L 3个不同水平的标准溶液100 μL(相当于样品添加含量为20、200和1 000 μg/kg)。加标样品经提取、净化后测定回收率, 结果见表 3。3种苯并咪唑类杀菌剂的加标回收率均≥93.5%, RSD均≤8.0%。

表 3 果蔬样品中3种苯并咪唑类杀菌剂的加标回收率(n=3) Table 3 Recoveries of the three benzimidazole fungicides spiked in fruit and vegetable samples (n=3)
3 结论

本文以BC为添加剂, 建立了同时测定杀菌剂甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵的毛细管电泳法。该方法灵敏度高, 重复性好, 已成功用于葡萄、黄瓜、番茄样品中3种苯并咪唑类杀菌剂的检测。该方法可为果蔬中甲基硫菌灵、多菌灵和苯菌灵的同时检测提供理论依据。

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