色谱  2017, Vol. 35 Issue (12): 1276-1285   PDF    
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刘永涛
余琳雪
王桢月
杨秋红
董靖
杨移斌
艾晓辉
改良的QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱同时测定水产品中7种阿维菌素类药物残留
刘永涛1,2, 余琳雪1,3, 王桢月1,3, 杨秋红1,2, 董靖1,2, 杨移斌1,2, 艾晓辉1,2     
1. 中国水产科学研究院长江水产研究所, 湖北 武汉 430223;
2. 农业部水产品质量安全控制重点实验室, 北京 100141;
3. 上海海洋大学水产与生命学院, 上海 201306
收稿日期：2017-09-09
基金项目：公益性行业（农业）科研专项（201503108）；农业行业标准制修订项目（2015-152，2014-443）；中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金（2016JBF0104）
通讯联系人：艾晓辉, Tel:(027)81780298, E-mail:thincat2005@sina.com
摘要：建立了改良的QuEChERS结合高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）同时测定水产品中7种阿维菌素类药物（阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、塞拉菌素、乙酰氨基阿维菌素、莫西菌素和埃玛菌素）的分析方法。样品经0.2%（v/v）氨化乙腈提取，3 g无水硫酸镁和2 g无水硫酸钠除水剂和沉淀蛋白质，100 mg十八烷基硅烷（C18）和500 mg无水硫酸镁净化。以0.1%（v/v）甲酸乙腈（含5 mmol/L乙酸铵）-0.1%（v/v）甲酸水溶液（含5 mmol/L乙酸铵）为流动相，采用Varian Pursuit ULTRA C8色谱柱（100 mm×2.0 mm，2.8 μm）进行分离。在加热电喷雾离子（HESI）源、正离子模式下采用多反应监测模式检测，基质匹配标准曲线外标法定量。阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、塞拉菌素、乙酰氨基阿维菌素和莫西菌素在2~200 μg/L范围内、埃玛菌素在0.2~20 μg/L范围内呈线性相关，相关系数（r）均≥ 0.9972，水产品中阿维菌素类药物的加标回收率为71.6%~112.8%，相对标准偏差（RSD）为4.7%~13.1%，不同水产品的基质效应均小于15%。阿维菌素、伊维菌素、多拉菌素、塞拉菌素、乙酰氨基阿维菌素和莫西菌素的定量限均为5 μg/kg，埃玛菌素的定量限为0.25 μg/kg。该法操作简便，重复性好，适用于水产品中7种阿维菌素类药物残留量的同时测定。
关键词：高效液相色谱-串联质谱    QuEChERS    残留    阿维菌素类药物    水产品    
Simultaneous determination of seven avermectin residues in aquatic products by modified QuEChERS combined with high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LIU Yongtao1,2, YU Linxue1,3, WANG Zhenyue1,3, YANG Qiuhong1,2, DONG Jing1,2, YANG Yibin1,2, AI Xiaohui1,2     
1. Yangtze River Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Wuhan 430223, China;
2. Key Laboratory of Control of Quality and Safety for Aquatic Products, Ministry of Agriculture, Beijing 100141, China;
3. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China
Foundation item: Special Fund for Agro-Scientific Research in the Public Interest (No. 201503108); Agricultural Industry Standard System Formulation and Revision Project (Nos. 2015-152, 2014-443); Central Public-Interest Scientific Institution Basal Research Fund (No. 2016JBF0104)
Abstract: A method was established for the simultaneous determination of seven avermectin (AVMs) residues, such as avermectin, ivermectin, doramectin, selamectin, eprinomectin, moxidectin and emamectin, in aquatic products using modified QuEChERS and high-performance liquid chromatography -tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS). The samples were extracted with 0.2% (v/v) ammoniate acetonitrile, and then 3 g of anhydrous magnesium sulfate and 2 g of anhydrous sodium sulfate were added to remove moisture and precipitate proteins. The samples were purified with 100 mg of C18 and 500 mg of anhydrous magnesium sulfate. The mobile phases comprised of acetonitrile (containing 0.1% (v/v) formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate) and water (containing 0.1% (v/v) formic acid and 5 mmol/L ammonium acetate). The prepared samples were separated on a Varian Pursuit ULTRA C8 column (100 mm×2.0 mm, 2.8 μm) and determined using heated electrospray ionization (HESI) in the positive ion multiple reaction monitoring (MRM) mode. The analytes were quantified using external standard with the matrix-matched standard calibration curve method. The results showed that the solvent and matrix-matched standard curves for avermectin, ivermectin, doramectin, selamectin, eprinomectin and moxidectin in the range of 2-200 μg/L and for emamectin in the range of 0.2-20 μg/L were all linear, and the correlation coefficients (r) were ≥ 0.9972. The recoveries were 71.6%-112.8% with the relative standard deviations in the range of 4.7%-13.1%. The limits of quantification (LOQs) for avermectin, ivermectin, doramectin, selamectin, eprinomectin and moxidectin were all 5 μg/kg and for emamectin was 0.25 μg/kg. The present method is simple, repeatable, and suitable for the simultaneous determination of the residues of the seven avermectins in aquatic products.
Key words: high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS)     QuEChERS     residue     avermectins (AVMs)     aquatic products    

阿维菌素类药物(avermectins, AVMs)是由放线菌产生的一组新型、广谱、高效、安全的大环内酯类抗寄生虫药, 也是目前在食品动物中应用最广、销量最大的一类兽药[1]。阿维菌素类药物包括阿维菌素(avermectin, AVM)、伊维菌素(ivermectin, IVM)、多拉菌素(doramectin, DOR)、塞拉菌素(selamectin, SEM)、乙酰氨基阿维菌素(eprinomectin, EPR)、莫西菌素(moxidectin, MOX)和埃玛菌素(emamectin, EMM)等。AVMs在国外水产养殖业中被广泛用于大西洋鲑和海鲷等海水鱼海鲺病的防治[2-8]; 国内主要用于防治青鱼、草鱼、鲢等淡水养殖鱼类的寄生虫病[9]。虽然AVMs临床疗效较好, 但按世界卫生组织(WHO)五级分类标准, AVMs属高毒化合物[10]。AVMs是脂溶性化合物, 其在动物体内容易蓄积且残留时间较长, 增加了AVMs使用的风险。目前, 国际食品法典委员会(CAC)规定鲑、鳟肌肉和鱼片(自然比例的肌肉+皮)中EMM的最大残留限量为100 μg/kg[11]; 加拿大规定鲑科鱼类肌肉和皮中EMM的最大残留限量分别为100 μg/kg和1 000 μg/kg[12]; 欧洲药品管理局(EMEA)规定了鲑鱼肉和皮中EMM的最大残留限量为100 μg/kg[13]; 日本规定EMM在鲑科鱼类(如鲑和鳟)中最大残留限量为100 μg/kg, 其他水产品中最大残留限量为0.5 μg/kg, EPR在鲈形目鱼类(如鲣、竹荚鱼、鲭、黑鲈、海鲷和金枪鱼)中最大残留限量为60 μg/kg[14]。中国尚未制定有关水产品中AVMs最大残留限量值的标准。

目前, 国内外水产品中有关AVMs多残留检测方法的报道较少, 常用的有高效液相色谱-荧光检测法[9, 15]和高效液相色谱-串联质谱法[16-21], 上述分析方法仅涉及2~6种阿维菌素类药物的分析, 大多数方法中没有检测EMM和SEM。EMM是水产养殖业中应用较多的阿维菌素类药物, 且许多国家对其在水产品中的最大残留限量也有规定, 而涉及EMM的方法由于其定量限偏高[19], 不能满足检测的要求。因此, 建立一种灵敏、准确、快速同时测定水产品中AVMs多残留的方法对保障水产品质量安全, 进而保护人类健康是十分必要的。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Surveyor Plus-TSQ Quantum Access Max高效液相色谱-四极杆质谱仪、Thermo Xcalibur 2.1数据采集处理系统(美国Thermo Fisher Scientific公司); HITACHI 20PR-520型自动高速冷冻离心机(日本日立公司); Mettler-TOLEDO AE-240电子天平(瑞士梅特勒-托利多公司); HQ-60-Ⅱ旋涡混合器(北京北方同正生物技术发展有限公司); HGC-12氮吹仪(天津恒奥科技发展公司)。

标准品:AVM(纯度≥97.0%)、DOR(纯度≥96.0%)、EPR(纯度≥94.0%)和MOX(纯度≥87.0%)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; IVM(纯度≥96.0%)和EMM(纯度≥97.0%)均购自美国ChemService公司; SEM(纯度≥97.6%)购自欧洲药品质量管理局。

乙腈、甲酸均为色谱纯(美国J. T. Baker公司); 质谱水(LC-MS级, 上海安谱科学仪器有限公司); 氨水、无水硫酸镁、无水硫酸钠均为分析纯(上海国药集团); 十八烷基键合硅胶(C18, 40~60 μm)、乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine, PSA, 40~60 μm)(天津博纳艾杰尔科技有限公司)。实际样品购自武汉市水产品批发市场和农贸市场。

0.2%(v/v)氨化乙腈溶液的配制:100 mL乙腈中加入0.2 mL浓氨水, 摇匀, 配制成0.2%(v/v)氨化乙腈溶液。

1.2 标准溶液的配制

分别准确称取0.01 g(精确至0.000 1 g)AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX和EMM标准品, 用适量乙腈溶解并稀释至100 mL, 分别配制质量浓度为100 mg/L的标准储备液, 于-20 ℃冰箱中保存, 备用。

分别移取1 mL AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX和EMM标准储备液, 用乙腈稀释至10 mL, 配制质量浓度为10 mg/L的单标准溶液, 于-4 ℃冰箱中保存, 备用。

分别准确移取1 mL AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX标准储备液和0.1 mL EMM标准储备液, 置于100 mL容量瓶中, 用乙腈稀释并定容, 配制含AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX 1 mg/L和EMM 100 μg/L的混合标准中间液, 于-4 ℃冰箱中保存, 备用。

用初始比例的流动相稀释混合标准中间液, 配制成AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L和EMM质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的溶剂标准工作溶液。

采用1.3节样品前处理的方法制备草鱼、南美白对虾、甲鱼、河蟹和鳗鲡空白肌肉组织样品溶液, 用空白肌肉组织样品溶液稀释混合标准中间液, 制备AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX质量浓度为2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、200.0 μg/L和EMM质量浓度为0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的空白基质匹配标准溶液, 现用现配。

1.3 样品前处理

鱼:去鳞、去皮, 沿脊背取肌肉; 虾:去头、去壳, 取肌肉部分; 甲鱼、河蟹:取可食部分。样品均质混匀, 于-20 ℃冰箱中保存, 备用。

将均质冷冻保存的肌肉样品于室温下自然解冻。准确称取样品5.0 g, 置于50 mL离心管中, 加入12 mL 0.2%(v/v)氨化乙腈, 涡旋振荡30 s, 超声提取5 min, 然后加入3 g无水硫酸镁和2 g无水硫酸钠, 涡旋振荡30 s, 然后以8 000 r/min离心5 min, 将0.2%(v/v)氨化乙腈提取液转移至25 mL比色管中, 再向残渣中加入10 mL 0.2%(v/v)氨化乙腈提取液重复提取一次, 合并提取液, 置于25 mL比色管中, 用乙腈定容至25 mL后, 摇匀, 取10 mL提取液, 置于15 mL离心管中, 加入100 mg C18粉和500 mg无水硫酸镁, 振荡30 s, 超声5 min, 以5 000 r/min离心5 min, 将提取液转移至另一只10 mL离心管中, 于50 ℃氮吹至干, 向残渣中加入1 mL乙腈-水溶液(50:50, v/v), 涡旋振荡30 s, 用高速冷冻离心机以10 000 r/min离心5 min, 取上清液, 过0.22 μm针式尼龙滤头, 待HPLC-MS/MS分析。

1.4 分析条件
1.4.1 色谱条件

色谱柱:Varian Pursuit ULTRA C8柱(100 mm×2.0 mm, 2.8 μm); 柱温:50 ℃; 流动相:A为0.1%(v/v)甲酸乙腈(含5 mmol/L乙酸铵), B为0.1%(v/v)甲酸水溶液(含5 mmol/L乙酸铵); 流速:0.25 mL/min; 进样体积:20 μL。梯度洗脱程序见表 1。

表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program
1.4.2 质谱条件

加热电喷雾离子源正离子(HESI+)模式; 离子传输毛细管温度:350 ℃; 多反应监测(MRM)模式; 喷雾电压:3 500 V; 蒸发气温度:50 ℃; 鞘气压力7 MPa; 辅助气压力:1 MPa; 碰撞气及压力:氩气, 20 Pa; Q1半峰宽:0.7 Da；Q3半峰宽：0.7 Da。母离子、加合离子、定量离子、定性离子和碰撞能量见表 2。

表 2 7种阿维菌素类药物的母离子、加合离子、子离子和碰撞能量 Table 2 Parent ions, adduct ions, fragment ions and collision energies of the seven avermectins (AVMs)
2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化
2.1.1 色谱柱的选择

本研究比较了Hypersil GOLD C18 (150 mm×2.1 mm, 5 μm)、Waters Symmetry C18 (100 mm×2.1 mm, 3.5 μm)和Varian Pursuit ULTRA C8 (100 mm×2.0 mm, 2.8 μm)3种色谱柱分析AVMs时的分离效果。结果表明, 3种色谱柱均能将7种AVMs分离, 但EMM在2种C18液相色谱柱上均有一定的残留, 而EMM在C8色谱柱上的残留明显低于C18色谱柱。因此, 最终选择Varian Pursuit ULTRA C8色谱柱(100 mm×2.0 mm, 2.8 μm)作为分离色谱柱, 若样品中EMM的含量较高, 需将其稀释后再进行分析。

2.1.2 柱温的选择

分别将柱温设置为30、35、40、45和50 ℃, 考察柱温对分离时间和响应强度的影响。结果表明, 提高柱温可缩短AVMs的分析时间, 柱温为50 ℃时较30 ℃时分析时间减少了1 min。柱温对AVMs的响应强度也有一定影响：对SEM的影响最大, 柱温为50 ℃时, SEM的响应强度约是柱温为30 ℃时的3.5倍; 对EMM的影响最小, 柱温50 ℃时EMM的响应强度是30 ℃时的1.39倍。考虑到柱温过高会影响色谱柱的寿命, 本实验没有研究更高柱温对AVMs响应强度的影响。综合考虑, 最终选择50 ℃作为分析柱温。

2.2 质谱条件的优化

分别将配制的质量浓度为10 mg/L的AVMs单标准溶液通过注射泵分别注射到质谱仪中进行质谱条件的优化。AVMs在HESI+模式下, 主要形成[M+H]+、[M+Na]+和[M+NH4]+等加合离子(见表 3)。选择上述加合形式均可检测AVMs, 但不同加合峰离子化效率的稳定性和灵敏度等会有较大差异, 如采用[M+Na]+模式虽然离子化效率极高, 但其易受流动相中Na+含量、离子源洁净程度等因素的影响, 不适合复杂基质样品(如鳗鱼等)中AVMs的测定[17]。AVMs中AVM、DOR和IVM的[M+NH4]+加合峰响应强度最强; EMM、EPR、SEM和MOX的[M+H]+加合峰响应强度最强, 这可能是因为EMM、EPR、SEM和MOX的化学结构中含N原子, 能够形成稳定的带电离子[21]。

表 3 7种阿维菌素类药物的主要加合离子 Table 3 Main adduct ions of the seven AVMs

分析方法中7种AVMs的分离采用梯度洗脱程序, 为减少梯度洗脱程序运行时NH4+浓度的变化对[M+NH4]+加合物形成的影响, 本文在流动相的水相和有机相中均加入了5 mmol/L的乙酸铵, 使更利于AVM、DOR和IVM形成稳定的[M+NH4]+加合峰, 同时在水相和有机相中加入0.1%(v/v)甲酸以利于EMM、EPR、SEM和MOX形成稳定的[M+H]+加合离子, 另外在流动相中加入乙酸铵有利于AVMs的分离、获得更好的峰形和更高的灵敏度[22]。有报道[18, 23, 24]在负离子模式下检测AVMs, 但本研究发现在ESI-模式下, AVMs形成[M-H]-的离子化效率较低, 灵敏度低, 不利于本研究中7种AVMs残留量的测定, 特别是对于最大残留限量值较低的AVMs, 如日本规定EMM在除鲑科鱼类外的其他水产品中的最大残留限量值为0.5 μg/kg[14]。通过优化得到的AVMs的母离子、碰撞能量、定量离子和定性离子见表 2。

本研究中使用的离子源是带加热功能的电喷雾电离源, 将蒸发气温度分别设定为50、100、200、300和400 ℃, 比较不同蒸发气温度对AVMs响应强度的影响, 结果表明, 随着蒸发气温度的提高, EMM、EPR、SEM和MOX的响应强度反而呈缓慢下降趋势, 而AVM、DOR和IVM的响应强度则先升高后下降, 温度为200 ℃时响应强度最大。考虑到7种AVMs的同时测定, 本文最终选择了50 ℃作为加热电喷雾离子源的蒸发气温度。

在优化的色谱、质谱条件下，混合标准溶液和加标草鱼肌肉样品中7种阿维菌素类药物的色谱图见图 1。

图 1 混合标准溶液和加标草鱼肌肉样品中7种阿维菌素类药物的色谱图 Fig. 1 Chromatograms of the seven AVMs in a mixed standard solution and a spiked grass carp muscle sample
2.3 前处理方法的优化

本实验通过在空白鳗鲡肌肉组织中添加10 μg/kg的AVM、IVM、DOR、SEM、EPR和MOX和1 μg/kg的EMM, 以回收率为评价指标, 对样品前处理条件进行了优化。

2.3.1 除水剂和蛋白质沉淀剂的选择

以乙腈作为提取剂, 分别以5 g无水硫酸钠、5 g无水硫酸镁或3 g无水硫酸镁与2 g无水硫酸钠组合进行除水剂和蛋白质沉淀剂的筛选, 乙腈提取液除不加入100 mg C18粉和0.5 g无水硫酸镁外, 其余按照1.3节样品前处理的步骤进行操作。由图 2可知, 除EMM和MOX外, 其他AVMs以5 g无水硫酸镁或3 g无水硫酸镁与2 g无水硫酸钠的组合为除水剂和蛋白质沉淀剂时的回收率均优于5 g无水硫酸钠; 以3 g无水硫酸镁与2 g无水硫酸钠为除水剂和蛋白质沉淀剂时, EMM和MOX的平均回收率高于5 g无水硫酸镁组, 而AVM、IVM、DOR、SEM和EPR的平均回收率则低于5 g无水硫酸镁组, 但5 g无水硫酸镁组平行样品间回收率的差异较大。实验发现，无水硫酸镁作为除水剂和蛋白质沉淀剂时吸收样品中水分的同时放出大量的热, 且经5 g无水硫酸镁除水剂后提取液的体积明显减少, 影响测定结果的准确性; 单独采用无水硫酸钠为除水剂时样品又容易结块, 影响AVMs的提取。综合考虑, 最终选择3 g无水硫酸镁和2 g无水硫酸钠作为除水剂和蛋白质沉淀剂。

图 2 不同除水剂和蛋白质沉淀剂对7种阿维菌素类药物回收率的影响(n=6) Fig. 2 Effects of different reagents for removing water and precipitating proteins on the recoveries of the seven AVMs (n=6)
2.3.2 提取剂的选择

文献[9, 17-21, 23, 25, 26]报道的AVMs的提取剂大多为乙腈, 本文分别以乙腈、含0.2%(v/v)氨水的乙腈溶液和含0.1%(v/v)三乙胺的乙腈溶液作为提取剂进行筛选。3 g无水硫酸镁和2 g无水硫酸钠作为除水剂和蛋白质的沉淀剂, 100 mg C18粉作为净化剂, 其余步骤按照1.3节样品前处理方法进行。由图 3可知, 除EMM外, 采用含0.2%(v/v)氨水的乙腈溶液作为提取剂时, AVMs的回收率均优于乙腈或含0.1%(v/v)三乙胺的乙腈溶液。因此最终选择含0.2%(v/v)氨水的乙腈溶液为提取剂。

图 3 不同提取剂对7种阿维菌素类药物回收率的影响(n=6) Fig. 3 Effects of different extractants on the recoveries of the seven AVMs (n=6) ACN: acetonitrile.
2.3.3 净化方式的选择

在确定了提取剂、除水剂和蛋白质沉淀剂的基础上, 比较了采用不同净化剂(100 mg C18粉、100 mg C18粉和500 mg无水硫酸镁、100 mg PSA粉、100 mg PSA粉和500 mg无水硫酸镁)和不同固相萃取小柱(AL-N SPE (3 mL)、Florisil SPE(3 mL)和HLB SPE(3 mL))对样品进行净化时阿维菌素类药物的平均回收率(见图 4)。采用不同净化剂对样品进行净化的步骤按照1.3节样品前处理方法进行; 采用AL-N SPE (3 mL)和Florisil SPE(3 mL)固相萃取小柱对样品进行净化的步骤:取10 mL乙腈定容后的提取液过SPE小柱, 并用3 mL乙腈洗脱SPE小柱, 收集两次的滤液, 后续步骤同1.3节样品前处理步骤; HLB SPE小柱净化步骤：取10 mL乙腈定容后的提取液，加入等体积的超纯水, 混匀后过HLB SPE小柱, 再用10 mL乙腈洗脱, 后续步骤同1.3节样品前处理步骤。由图 3可知, 采用100 mg C18粉和500 mg无水硫酸镁净化时, 大部分目标物的回收率优于其他方式。因此最终选择100 mg C18粉和500 mg无水硫酸镁作为净化剂。

图 4 不同净化剂和固相萃取小柱对7种阿维菌素类药物回收率的影响(n=6) Fig. 4 Effects of different purification reagents and SPE columns on the recoveries of the seven AVMs (n=6) PSA: primary secondary amine.

基于上述筛选结果, 最终选择了含0.2%(v/v)氨水的乙腈溶液为提取剂, 3 g无水硫酸镁和2 g无水硫酸为除水剂和蛋白质沉淀剂, 100 mg C18粉和500 mg无水硫酸镁为净化剂。

2.3.4 定容溶液的选择

AVMs易溶于有机溶剂, 微溶于水, 因此本研究采用含高比例有机相的溶液:乙腈-水(50:50, v/v)、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(50:50、70:30、80:20、90:10, v/v)、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水(50:50, v/v)溶液(含12%(v/v)二甲基亚砜)、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水(50:50, v/v)溶液(含20%(v/v)二甲基甲酰胺)、乙腈、含0.1%(v/v)甲酸的乙腈来筛选定容溶液。结果表明, 乙腈或含0.1%(v/v)甲酸的乙腈溶液能将AVMs溶解, 但AVMs的峰形较差; 乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液(50:50、70:30、80:20、90:10, v/v)、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水(50:50, v/v)溶液(含12%(v/v)二甲基亚砜)、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水(50:50, v/v)溶液(含20%(v/v)二甲基甲酰胺)可溶解样品前处理后少量残余的脂肪等杂质, 对AVMs的定量产生干扰；乙腈-水(50:50, v/v)既能将AVMs溶解, 又较其他定容溶液溶解脂肪少, 其对AVMs定量的干扰较小。综合考虑, 最终选择了乙腈-水(50:50, v/v)作为定容溶液。

2.4 线性关系、相关系数和定量限

将1.2节制备的标准工作液进样分析, 以AVMs的质量浓度为横坐标(x, μg/L)、峰面积为纵坐标(y)绘制溶剂标准工作曲线。结果表明, AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX在质量浓度为2~200 μg/L、EMM在质量浓度为0.2~20 μg/L范围内线性相关, 相关系数(r)均≥0.998 7(见表 4)。

表 4 7种AVMs在标准溶剂中的回归方程、相关系数、线性范围和定量限 Table 4 Regression equations, correlation coefficients (r), linear ranges and limits of quantification (LOQs) of the seven AVMs in standard solutions

测定添加5 μg/kg AVM、IVM、MOX、DOR、SEM、EPR和0.25 μg/kg EMM的空白样品, 用外推法计算7种阿维菌素类药物的定量限(以≥10倍信噪比计算)[27]。结果显示, 7种阿维菌素类药物的信噪比均大于10, 所以, 本方法中埃玛菌素的定量限为0.25 μg/kg, 其余6种阿维菌素类药物的定量限为5 μg/kg(见表 4)。

2.5 基质效应(ME)

将1.2节制备的水产品空白基质匹配标准溶液进样分析, 以AVMs的质量浓度为横坐标(C, μg/L)、峰面积为纵坐标(A), 绘制空白基质匹配标准工作曲线。结果表明, AVM、IVM、DOR、SEM、EPR、MOX在质量浓度为2~200 μg/L、EMM在质量浓度为0.2~20 μg/L范围内线性相关, 相关系数均≥0.997 2(见表 5)。

表 5 7种AVMs在基质匹配标准溶液中的回归方程、相关系数、线性范围和基质效应 Table 5 Regression equations, correlation coefficients, linear ranges and matrix effects (MEs) of the seven AVMs in matrix-matched standard solutions

采用公式ME=[1-(水产品基质匹配标准曲线的斜率/标准工作曲线斜率)]×100%考察方法的基质效应[28]。如果值为负值, 则基质对信号有增强作用; 如果为正值, 则基质对信号有抑制作用。结果表明, 水产品基质对阿维菌素类药物的质谱响应强度均呈抑制作用, 且均小于15%(见表 5), 结果令人满意[29]。

2.6 方法回收率和精密度

在草鱼、南美白对虾、河蟹、甲鱼和鳗鲡空白肌肉组织中添加5.0、10.0、50.0 μg/kg的AVM、IVM、MOX、DOR、SEM、EPR和0.25、0.5、5 μg/kg的EMM, 每个水平做6个平行样品, 按照1.3节进行样品前处理，以1.4节的分析条件进行测定, 7种阿维菌素类药物的加标回收率为71.6%~112.8%, 相对标准偏差(RSD)为4.7%~13.1%, 具体见表 6。

表 6 水产品中7种阿维菌素类药物的加标回收率和相对标准偏差(n=6) Table 6 Recoveries and relative standard deviations (RSDs) of the seven AVMs spiked in aquatic products (n=6)
2.7 实际样品分析

将该方法用于池塘和湖泊养殖淡水鱼(草鱼、黄颡鱼、团头鲂、鲫、鲤、乌鳢、翘嘴鲌等11个品种, 31个样品)中阿维菌素类药物的检测, 结果并未检出阿维菌素类药物残留。分析原因可能是有:(1)阿维菌素类药物属高毒化合物[15], 其中阿维菌素和伊维菌素对鱼属剧毒药物[30-32], 因此阿维菌素类药物在水产养殖业中的使用浓度很低; (2)有报道[33]称阿维菌素性质不稳定, 对光线特别敏感, 会迅速氧化失活; (3)样品采集时间段内可能没有使用阿维菌素类药物进行鱼体寄生虫病的防治。

3 结论

本文通过前处理和质谱条件的优化, 建立了同时检测水产品中7种阿维菌素类药物残留的高效液相色谱-串联质谱法。本方法操作简便, 回收率高, 基质效应低, 适用于水产品中7种阿维菌素类药物残留的同时测定, 对于其他大环内酯类药物的提取和检测也具有较高的参考价值。

参考文献
[1] Chen J, Luo Y H. Guizhou Animal Science and Veterinary Medicine, 2007, 31(4): 9.
陈静, 罗永煌. 贵州畜牧兽医, 2007, 31(4): 9.
[2] Armstrong R, MacPhee D, Katz T, et al. Can Vet J, 2000, 41(8): 607.
[3] Stone J, Sutherland I H, Sommerville C, et al. J Fish Dis, 2000, 23(3): 185. doi: 10.1046/j.1365-2761.2000.00233.x
[4] Bright D A. Use of Emamectin Benzoate in the Canadian Finfish Aquaculture Industry:A Review of Environmental Fate and Effects.[2017-08-18]. http://publications.gc.ca/collections/Collection/En4-51-2005E.pdf
[5] Johnson S C, Treasurer J W, Bravo S, et al. Zool Stud, 2004, 43(2): 229.
[6] Westcott J D, Hammell K L, Burka J F. Aquac Res, 2004, 35(8): 784. doi: 10.1111/are.2004.35.issue-8
[7] Bravo S, Sevatdal S, Horsberg T. Aquaculture, 2008, 282: 7. doi: 10.1016/j.aquaculture.2008.06.011
[8] Gustafson L, Ellis S, Robinson T, et al. J Fish Dis, 2006, 29(10): 621. doi: 10.1111/jfd.2006.29.issue-10
[9] Wang W L, Liu Y H, Zu X J, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2015, 34(4): 475.
王文兰, 刘艳辉, 祖岫杰, 等. 分析试验室, 2015, 34(4): 475.
[10] Ma J G, Zhou C, Li Y, et al. Ecotoxicol Environ Saf, 2014, 101: 31. doi: 10.1016/j.ecoenv.2013.12.009
[11] Codex Alimentarius. Maximum Residue Limits (MRLs) and Risk Management Recommendations (RMRs) for Residues of Veterinary Drugs in Foods. (2015-08-11)[2017-08-18]. http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/sh-proxy/en/?lnk=1&url=https%253A%252F%252Fworkspace.fao.org%252Fsites%252Fcodex%252FStandards%252FCAC%2BMRL%2B2%252FMRL2e.pdf
[12] Health Canada. List of Maximum Residue Limits (MRLs) for Veterinary Drugs in Foods. (2017-08-02)[2017-08-18]. https://www.canada.ca/en/health-canada/services/drugs-health-products/veterinary-drugs/maximum-residue-limits-mrls/list-maximum-residue-limits-mrls-veterinary-drugs-foods.html
[13] European Food Safety Authority. EFSA J, 2012, 10(11): 2955. doi: 10.2903/j.efsa.2012.2955
[14] The Japan Food Chemical Research Foundation. Maximum Residue Limits (MRLs) List of Agricultural Chemicals in Foods. (2017-07-31)[2017-08-18]. http://www.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/agrdtl.php?a_inq=11900
[15] Xu Y J, Ren C B, Liu H H, et al. Chinese Fishery Quality and Standards, 2011, 1(1): 70.
徐英江, 任传博, 刘慧慧, 等. 中国渔业质量与标准, 2011, 1(1): 70.
[16] Zhou X J, Zhou X Y, Shao H H, et al. Journal of Anhui Agricultural Sciences, 2014, 42(22): 7406.
周秀锦, 周向阳, 邵宏宏, 等. 安徽农业科学, 2014, 42(22): 7406. doi: 10.3969/j.issn.0517-6611.2014.22.041
[17] Gao H P, Zhang J L, Li Y F, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2008, 29(6): 337.
高华鹏, 张健玲, 李永夫, 等. 质谱学报, 2008, 29(6): 337.
[18] GB/T 22953-2008
[19] Rafidah I, Ghanthimathi S, Fatimah A B, et al. Anal Methods, 2013, 5(16): 4172. doi: 10.1039/c3ay40444g
[20] Wang F M, Chen J H, Cheng H Y, et al. Food Addit Cont:Part A, 2011, 28(5): 627. doi: 10.1080/19440049.2011.563367
[21] Zhang W J, Lian G Y, Guo X X, et al. Food Science, 2012, 33(18): 226.
张文娟, 连庚寅, 郭晓喜, 等. 食品科学, 2012, 33(18): 226.
[22] Silva G R, Lima J A, Souza L F, et al. Talanta, 2017, 171: 307. doi: 10.1016/j.talanta.2017.05.012
[23] Ozdemir N, Kahraman T. J Food Drug Anal, 2016, 24(1): 90. doi: 10.1016/j.jfda.2015.07.004
[24] Wu Z R, Li J S, Zhu L L, et al. J Chromatogr B, 2001, 755(1/2): 361.
[25] Li X, Zhang Y Q, Ai L F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(6): 590.
李欣, 张瑶琴, 艾连峰, 等. 色谱, 2015, 33(6): 590.
[26] Bandeira N M G, Ribeiro L C, Rizzetti T M, et al. J Braz Chem Soc, 2017, 28(5): 878.
[27] Zou Y, Shao L Z, Chen S M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(8): 801.
邹游, 绍琳智, 陈思敏, 等. 色谱, 2017, 35(8): 801.
[28] Yang Y J, Yin J, Yang Y, et al. J Chromatogr B, 2012, 901(2): 93.
[29] Zhang B, Chen J, Jiang Q, et al. Biomed Chromatogr, 2017, 31(4): 1.
[30] Zhang Q D, Pan Z H, Liu W H, et al. Modern Agricultural Science and Technology, 2007(24): 153.
张启迪, 潘宗海, 刘文华, 等. 现代农业科技, 2007(24): 153. doi: 10.3969/j.issn.1007-5739.2007.24.105
[31] Zhang Y D, Wang D L, Lai Y P, et al. Chinese Journal of Management Science, 2008, 29(8): 25.
赵于丁, 王冬兰, 来有鹏, 等. 中国科学与管理, 2008, 29(8): 25.
[32] Cao Y, Zhu B K, Wang J W. Freshwater Fisheries, 2010, 40(3): 56.
曹岩, 朱邦科, 王剑伟. 淡水渔业, 2010, 40(3): 56.
[33] Yang X L, New Handbook of Fishery Drugs[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2005: 251
杨先乐. 新编渔药手册[M]. 北京: 中国农业出版社, 2005: 251