色谱  2017, Vol. 35 Issue (12): 1251-1256   PDF    
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杨涛
刘平
亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱法测定肝组织中羟脯氨酸
刘伟1,2, 戚胜兰4, 徐莹1,2, 肖准1,2,3, 付亚东1,2,3, 陈佳美1,2, 杨涛5, 刘平1,2,3     
1. 上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所, 上海 201203;
2. 上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点 实验室, 上海 201203;
3. 上海中医药大学上海高校中医内科学E-研究院, 上海 201203;
4. 上海中医药大学中药研究所, 上海 201203;
5. 上海中医药大学附属曙光医院心血管研究所, 上海 201203
收稿日期：2017-09-09
基金项目：国家自然科学基金重点项目（81530101）；上海市青-科技英才扬帆计划资助项目（17YF1419800）；中国博士后科学基金资助项目（2016M601643）
通讯联系人：杨涛, Tel:(021)20256778, E-mail:yangtao8579@163.com; 刘平, Tel:(021)20256526, E-mail:liuliver@vip.sina.com
摘要：采用亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱系统，建立了肝组织中胶原蛋白水解物羟脯氨酸（Hyp）的快速定量检测方法。将正常及四氯化碳肝纤维化模型小鼠的肝组织样品酸水解，经过滤、稀释后，采用Hypersil GOLD HILIC色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）分离，以水-乙腈（28：72，v/v）为流动相进行等度洗脱，最后用配有电喷雾离子源的四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱在正离子模式下进行检测。结果表明，Hyp在0.78~100.00 μg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数（R2）为0.9983，方法的定量限为0.78 μg/L，样品加标回收率为97.4%~100.9%，相对标准偏差为1.4%~2.0%（n=6）。此外，该方法与传统的氯胺T法进行比较，发现两种方法的检测结果相关性良好，Pearson相关系数为0.927；较氯胺T法，该法具有操作简便、准确度高的优点。该方法可用于肝组织中Hyp的快速定量分析。
关键词：亲水相互作用色谱    四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱    羟脯氨酸    肝组织    肝纤维化    
Determination of hydroxyproline in liver tissue by hydrophilic interaction chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry
LIU Wei1,2, QI Shenglan4, XU Ying1,2, XIAO Zhun1,2,3, FU Yadong1,2,3, CHEN Jiamei1,2, YANG Tao5, LIU Ping1,2,3     
1. Institute of Liver Disease, Shuguang Hospital Affiliated with Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
2. Key Laboratory of Liver and Kidney Disease of the Ministry of Education, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
3. E-Institute of Shanghai Municipal Education Commission, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
4. Institute of Chinese Materia Medica, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China;
5. Institute of Cardiovascular Disease, Shuguang Hospital Affiliated with Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, Shanghai 201203, China
Foundation item: Key Project of National Natural Science Foundation of China (No. 81530101); Shanghai Sailing Program (No. 17YF1419800); Project Funded by China Postdoctoral Science Foundation (No. 2016M601643)
Abstract: A method for the determination of hydroxyproline (Hyp) in liver tissue of mice by hydrophilic interaction chromatography-quadrupole/electrostatic field orbitrap high resolution mass spectrometry (HILIC-HRMS) was developed. The liver tissue samples of normal mice and liver fibrosis mice induced by carbon tetrachloride were hydrolyzed by concentrated hydrochloric acid. After filtrated and diluted by solution, the diluent was separated on an Hypersil GOLD HILIC column (100 mm×2.1 mm, 3 μm). Water-acetonitrile (28:72, v/v)were used as the mobile phases with isocratic elution. Finally, the target analytes were detected in positive model by HRMS equipped with an electrospray ionization source. The linear range of hydroxyproline was from 0.78 to 100.00 μg/L with the correlation coefficient (R2) of 0.9983. The limit of quantification was 0.78 μg/L. By detecting the spiked samples, the recoveries were in the range of 97.4%-100.9% with the relative standard deviations (RSDs) between 1.4% and 2.0%. In addition, comparison of the measurement results by this method and the chloramine T method was proceeded. It was found that the linear correlation between the two methods was very good, and the Pearson correlation coefficient was 0.927. And this method had simpler operation procedure and higher accuracy than chloramine T method. This method can be used for the quick determination of hydroxyproline in liver tissue samples.
Key words: hydrophilic interaction chromatography (HILIC)     quadrupole/orbitrap high resolution mass spectrometry (HRMS)     hydroxyproline (Hyp)     liver tissue     liver fibrosis    

羟脯氨酸(hydroxyproline, Hyp)是构成机体胶原蛋白的主要成分之一, 在正常胶原蛋白中的含量约13.4%, 在弹性蛋白中含量极少, 而在其他蛋白质中几乎不存在, 其具体的结构式见图 1。因此, 将不同组织中Hyp的含量作为衡量其胶原组织代谢能力的重要指标[1]。肝纤维化是多种慢性肝病共有的病理变化, 其存在与发展最终可导致肝硬化或肝癌。当肝纤维化时, 肝组织内胶原纤维沉积量显著增加, 由于Hyp为胶原纤维所特有, 因此Hyp为肝纤维化的指标, 用来判断纤维化的程度[2]。

图 1 羟脯氨酸与d5-苯丙氨酸(d5-Phe)的结构式 Fig. 1 Structures of hydroxyproline (Hyp) and d5-phenylalanine (d5-Phe)

Hyp的传统测定方法是氯胺T法[3, 4], 其原理是:先将含有Hyp多肽的蛋白质、组织、血清、腹水或尿液等在强酸作用下水解成游离的Hyp, 游离的Hyp被氯胺T氧化后再与对二甲氨基苯甲醛发生反应, 生成红色的吡咯化合物, 最后通过分光光度计比色或其他方法检测出水解液中Hyp的含量。但氯胺T法的特异性相对较差, 灵敏度低, 干扰因素较多, 在一定程度上限制了其应用。柱前衍生高效液相色谱法测定Hyp也有较多报道[5, 6], 但衍生步骤较为繁琐, 衍生条件限制因素较多, 影响了检测的准确性, 且实验耗时较长, 从而限制了其应用发展。另外, 也有利用紫外检测器或氨基酸分析仪等直接检测Hyp的报道[7], 但这些方法的检测灵敏度较低, 杂质峰干扰较大。与其他技术相比, 近年来迅速发展的高效液相色谱-串联质谱技术由于其能够提供丰富的结构信息, 并能显著提高检测的准确度及灵敏度, 因而受到广泛的关注。赵善贞等[8]开发了亲水性相互作用色谱-四极杆串联线性离子阱质谱检测含蛋白质食品中的Hyp; 夏金根等[9]利用高效液相色谱-质谱联用技术测定了胶原蛋白中的Hyp。这些方法在很大程度上提高了Hyp的检测灵敏度, 但由于复杂基质的干扰, 方法仍然存在一定的基质效应, 导致检测准确度较低; 由于采用的是低分辨质谱, Hyp的检测易受到相对分子质量相近的亮氨酸和异亮氨等内源性物质的干扰。高分辨质谱(HRMS)由于其分辨率高、灵敏度高及抗干扰能力强的特点, 目前已应用于各类生物样品[10, 11]的检测中。

本方法将动物肝组织样品酸水解、过滤及稀释后, 用亲水相互作用色谱法(HILIC)对Hyp进行简单的色谱分离, 再采用基于静电场轨道阱(orbitrap)技术的Q Exactive高分辨质谱完成定量检测。本方法前处理步骤简单, 分析检测快速、准确、灵敏度高, 可用于肝组织中羟脯氨酸的快速定量分析, 为判断肝纤维化程度提供重要参考。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Dionex Ultimate 3000高压液相色谱(带自动进样器)、Q Exactive四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪(配有第二代加热电喷雾离子化设计的离子源, H-ESI Ⅱ)、Hypersil GOLD HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm)(美国Thermo Fisher公司); Milli-Q超纯水处理系统(美国Millipore公司)。

乙腈、甲醇(色谱纯, 美国Thermo Fisher公司); 甲酸(色谱纯, 德国CNW公司); 羟脯氨酸对照品和茶氨酸对照品纯度均大于98.0%(大连美仑生物技术有限公司); d5-Phe(结构式见图 1)和d4-丙氨酸对照品纯度大于98.0%(美国Sigma公司); 柠檬酸、柠檬酸三钠、无水乙酸钠、氯胺T、二甲氨基苯甲醛、异丙醇、盐酸、高氯酸、橄榄油、四氯化碳(CCl4)(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司); 醋酸铵、甲酸铵(色谱级, 美国Sigma公司)。超纯水由Milli-Q超纯水处理系统制得。扶正化瘀方提取物由上海现代中医药股份有限公司提供。

1.2 标准溶液的配制

分别称取10.00 mg Hyp和d5-Phe, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇定容, 分别配制成1 g/L的标准储备液; 用甲醇稀释, 配制质量浓度为10 mg/L的标准中间液, 于-20 ℃储存; 用甲醇稀释, 配制质量浓度为1 mg/L的标准工作液, 于4 ℃储存。

精密吸取不同体积的Hyp标准工作液, 加入相同体积的d5-Phe内标溶液, 用水-乙腈(28:72, v/v)溶液适量稀释, 配制Hyp质量浓度分别为0.78、1.56、3.13、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg/L的系列标准溶液(其中内标d5-Phe的质量浓度为10 μg/L)。

1.3 肝组织样品的收集

30只雄性小鼠C57BL/6(18~20 g)购自北京维通利华实验动物有限公司(生产许可:SCXK(京)2016-0011), 饲养于上海中医药大学实验动物中心(使用许可:SYXK(沪)2014-0008)。

将小鼠平均分成3组, 即正常组、模型组与扶正化瘀(抗肝纤维化有效中药)组, 每组10只。小鼠模型制备采用腹腔注射含10%(体积分数)CCl4的橄榄油溶液2 mL/kg, 每周3次, 共6周; 正常组腹腔注射橄榄油溶液。在造模后第4周首日起, 扶正化瘀组小鼠灌胃4 g/kg的扶正化瘀方溶液(0.4%(质量分数)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)溶液配制), 正常组和模型组灌胃相同体积的空白溶剂(0.4%(质量分数)CMC-Na溶液)。造模6周后, 处死小鼠, 收集小鼠的肝组织, 即获得正常小鼠肝组织(正常组)、肝纤维化肝组织(模型组)及肝纤维化治疗后肝组织(扶正化瘀组), 保存于-80 ℃, 待后续研究使用。

1.4 样品前处理

称取小鼠肝组织100 mg, 置于安瓿瓶中, 加入2.5 mL纯水和2.5 mL浓盐酸(36.5%~38.5%, 质量分数), 封瓶, 置于105 ℃烘箱中水解18 h, 滤纸过滤即得肝组织水解液。取10 μL水解液, 加入10 μL内标溶液(10 mg/L), 用72%(体积分数)乙腈水溶液定容至10 mL, 取稀释液1 mL, 以15 000 g离心10 min, 取上清液直接进高压液相色谱-高分辨串联质谱检测。

1.5 分析条件

色谱柱:Hypersil GOLD HILIC柱; 柱温:35 ℃; 流动相:水-乙腈(28:72, v/v); 等度洗脱; 流速:0.3 mL/min; 进样量:5 μL。

离子源:电喷雾离子源, 正离子模式; 数据采集:全扫描-单离子监控(Full scan-SIM)模式, 分辨率70 000;喷雾电压:3.5 kV; 毛细管温度:320 ℃; 加热器温度; 300 ℃; 鞘气流量:30 Arb; 辅助气流量:13 Arb; 自动增益控制(AGC): 106。

2 结果与讨论
2.1 色谱条件的优化及内标的选择

比较了常用的反相Acquity HSS T3色谱柱(100 mm×2.1 mm, 1.8 μm, 美国Waters公司)和适用于极性化合物分析的Hypersil GOLD HILIC色谱柱(100 mm×2.1 mm, 3 μm, 美国Thermo Fisher公司)。Hyp极性较强, 在反相色谱柱上几乎不保留, 在死时间出峰; 采用Hypersil GOLD HILIC色谱柱时目标物获得了较好的保留, 故选为实验所用。

考察了不同流动相中的水相(纯水、醋酸铵或甲酸铵)对分离效果的影响。结果发现, Hyp的峰形、响应强度及保留时间均没有明显变化。同时考察了不同流动相中的有机相(乙腈和甲醇)对分离效果的影响。结果表明, 有机相使用乙腈时Hyp出峰时间稍早且峰形较好。因此最终选择了水和乙腈作为流动相。

本研究尝试使用茶氨酸、d4-丙氨酸和d5-Phe作为内标，发现在流动相为水-乙腈(28:72, v/v)时, 茶氨酸的保留时间不稳定, 会发生波动(3.2~3.9 min); d4-丙氨酸的保留时间为2.10 min, 与待测物Hyp的保留时间2.17 min接近, 未达到基线分离; d5-Phe的保留时间为1.78 min, 与待测物Hyp达到了较好的基线分离(见图 2)。因此最终选择d5-Phe作为本方法的内标。本方法能够在4 min内完成一个样品的检测, 与文献[8]采用质谱法测定所需的时间(22 min)相比, 检测效率明显提高。

图 2 羟脯氨酸与d5-苯丙氨酸的提取离子流色谱图 Fig. 2 Extracted ion chromatogram of hydroxyproline and d5-phenylalanine

此外, 采用亲水相互作用色谱-高分辨质谱法在提取离子时可以排除许多干扰。如胶原蛋白水解之后会生成多种氨基酸, 其中亮氨酸(分子式:C6H13NO2)和异亮氨酸(分子式:C6H13NO2)在采用低分辨质谱的情况下与Hyp(分子式:C5H9NO3)的相对分子质量均是131, 其准分子离子峰([M+H]+)的m/z均为132。在采用高分辨质谱的情况下, 亮氨酸和异亮氨酸准分子离子峰([M+H]+)的m/z均为132.102, Hyp准分子离子峰([M+H]+)的m/z为132.066, 当设定误差值为10×10-6时, Hyp的提取离子范围为132.064~132.067, 完全排除了亮氨酸和异亮氨酸的干扰, 因此在液相色谱条件优化时可不用考虑Hyp与二者基线分离的问题。

2.2 质谱条件的优化

为了得到Hyp的最佳质谱响应, 提高其灵敏度, 实验中利用流动注射法对其质谱参数进行了优化。由于Hyp的结构中既有亚氨基又有羧基, 因此正离子模式和负离子模式下都应有较好的响应。但经过比较, 发现其在正离子模式下的响应更好。

本实验采用全扫描-单离子监控模式, 待测物Hyp与内标d5-Phe的一级、二级质谱图见图 3。Hyp与d5-Phe准确分子离子峰[M+H]+的m/z分别为132.066和171.118。本实验考察了不同毛细管电压(2.0、2.5、3.0、3.5和4.0 kV)下Hyp的响应, 发现在毛细管电压为3.5 kV时, Hyp的响应达到最大, 选为本文实验所用条件。根据各质谱参数对Hyp响应的影响情况, 适当调节了其他参数, 最后确定了最优的质谱条件, 详见1.5节。

图 3 羟脯氨酸与d5-苯丙氨酸的质谱图 Fig. 3 Mass spectra of hydroxyproline and d5-phenylalanine
2.3 基质效应(ME)的考察

由于酸水解后的正常肝组织本身就存在相当浓度的Hyp, 因此无法使用正常阴性样品加标的方式评价Hyp的基质效应。为了考察方法的基质效应, 首先确定了内标的基质效应, 通过向稀释100、200、500、1 000、2 000倍的样品中加入适当浓度的d5-Phe, 并与相同浓度d5-Phe标准溶液比较, 发现在稀释100、200倍的样品中d5-Phe存在明显的离子抑制现象, 在稀释500倍及以上的样品中其离子抑制现象消失。同时发现稀释500、1 000和2 000倍的样品中最终检测出Hyp质量浓度的RSD为1.6%, 提示高比例稀释样品可以降低Hyp检测的基质效应。

为进一步确定Hyp检测是否具有基质效应, 首先利用标准曲线计算稀释样品中Hyp的含量(C始), 随后向不同稀释倍数的样品中加入与样品含量相当的Hyp标准溶液(C加), 测定此时Hyp的含量(C测), 平行进样6次, 利用公式ME=(C测-C始)/C加×100%, 计算Hyp的基质效应。最终获得稀释500、1 000和2 000倍样品的基质效应分别为91.2%、97.5%和101.5%, 表明样品稀释500倍及以上时, Hyp的检测基质效应较小, 满足生物样品检测的需要, 最终确定了1.4节所述的水解样品经稀释1 000倍后进样。与文献[8]报道的采用质谱法检测Hyp的基质效应(12.5%~98.2%)相比, 本方法的基质效应较小，结果令人满意。但本文依然采用基质匹配结合内标法进行定量分析, 确保结果的准确性。

2.4 方法学验证
2.4.1 线性关系与定量限

对加有内标的Hyp系列标准溶液进行检测, 每个浓度做6份平行样品, 以Hyp与d5-Phe峰面积的比值为纵坐标(Y)、Hyp的质量浓度为横坐标(X, μg/L)绘制标准曲线, 得到线性方程:Y=0.200 5X+0.192 4, 相关系数(R2)为0.998 3, 线性范围为0.78~100.00 μg/L。

Q Exactive属高分辨质谱, 其提取的准分子离子色谱图基线噪声非常小, 因此无法采用S/N计算方法的定量限(LOQ)。将Hyp标准溶液逐级稀释后, 发现Hyp在0.78~100 μg/L范围内线性均良好, 可较为准确的定量, 以此确定Hyp的LOQ为0.78 μg/L。与其他文献报道的LOQ为1 mg/L[8]和2.3 μg/L[9]相比, 本方法的LOQ更低。

2.4.2 精密度

取质量浓度为0.78、6.25和100.00 μg/L的Hyp标准溶液, 连续进样6次, 测定, 其峰面积的RSD分别为1.2%、1.8%和1.0%, 表明仪器日内精密度良好；取上述Hyp标准溶液, 在连续3天不同时段进样, 测定, 其峰面积的RSD分别为1.5%、1.3%和1.2%, 表明仪器日间精密度良好。

平行称取同一只正常组小鼠肝组织6份, 每份50 mg, 按1.4节方法处理后进行检测, Hyp含量测定结果分别为:382.24、375.12、375.09、379.11、364.75和365.27 μg/g, RSD为1.9%, 表明该方法的重复性较好。

2.4.3 加样回收试验

平行称取正常组小鼠肝组织3份, 每份50 mg(其中Hyp的含量为373.6 μg/g, 约为18.68 μg)。分别加入18.68 mg/L的Hyp标准溶液0.5 mL、1.0 mL和1.5 mL, 按1.4节方法处理后进行加标回收试验。每个试样平行处理6份, 可得低、中、高加标水平下的平均回收率(n=6)分别为97.4%(RSD=1.4%)、98.3%(RSD=1.6%)和100.9%(RSD=2.0%)。表明该方法的准确度较高。

2.4.4 稳定性

取质量浓度为0.78、6.25和100.00 μg/L的Hyp标准溶液, 分别在室温下放置0、12、24、48和72 h后进行分析, 其峰面积的RSD分别为1.4%、1.6%和1.2%, 表明Hyp标准溶液在室温下3天内稳定性较好；取上述Hyp标准溶液，分别于4 ℃放置0、1、3、5和7 d后进行测定, 其峰面积的RSD分别为2.3%、1.9%和2.0%, 表明Hyp标准溶液在4 ℃下一周内稳定性较好；取上述Hyp标准溶液, 分别于-80 ℃放置0、7、14、21和28 d后进行测定, 其峰面积的RSD分别为2.1%、1.8%和2.8%, 表明Hyp标准溶液在-80 ℃下1个月内稳定性较好。

取3份处理好的正常组小鼠肝组织样品在室温下放置0、12、24、48和72 h后进行分析, 其峰面积的RSD分别为1.7%、2.0%和1.4%, 表明小鼠肝组织样品中的Hyp在室温下3天内稳定性较好；取上述肝组织样品于4 ℃放置0、1、3、5和7 d后进行分析, 其峰面积的RSD分别为2.6%、2.1%和1.8%, 表明小鼠肝组织样品中的Hyp在4 ℃下一周内稳定性较好；取上述肝组织样品于-80 ℃放置0、7、14、21和28 d后进行分析, 其峰面积的RSD分别为3.0%、2.5%和2.3%, 表明小鼠肝组织样品中的Hyp在-80 ℃下1个月内稳定性较好。

2.5 与传统氯胺T法检测结果的比较

将1.3节收集的样品, 按照1.4节方法处理后, 利用本实验建立的分析方法测定小鼠肝组织中Hyp的含量。与此同时, 采用传统的氯胺T法[12]测定1.3节收集的样品中Hyp的含量, 结果见表 1。发现亲水相互作用色谱-高分辨质谱法测定不同处理组肝组织中Hyp的平均含量均比氯胺T法测定的结果高, 这可能与氯胺T法操作繁琐, 过程中目标化合物易损失有关，还可能与样品中其他物质干扰及其氧化反应的特异性差有关。而本实验建立的亲水相互作用色谱-高分辨质谱法仅需将水解好的样品经过简单的稀释即可检测, 单个样品仪器检测时间仅需4 min, 大大缩短了检测时间, 简化了实验操作步骤, 提高了实验的准确性及可靠性。对两种方法的测定结果进行相关性分析(结果见图 4), 发现两种方法测定的结果存在极显著的线性相关, Pearson相关系数为0.927。

表 1 采用不同方法检测小鼠肝组织中Hyp的含量(x±SD, n=10) Table 1 Contents of hydroxyproline in liver tissue of mice by different methods (x±SD, n=10)

图 4 本方法与氯胺T法[12]测定结果的比较 Fig. 4 Comparison of the measurement results by this method and chloramine T method[12]

此外, 采用亲水相互作用色谱-高分辨质谱法和氯胺T法测定不同处理组小鼠肝组织Hyp含量均发现, 与正常组相比, 肝纤维化(模型组)小鼠肝组织中Hyp含量显著增加; 与模型组相比, 经扶正化瘀方治疗后的小鼠肝组织中Hyp含量显著降低, 提示扶正化瘀方对肝纤维化具有显著的治疗作用。

3 结论

本研究建立了亲水相互作用色谱-四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱快速定量分析肝组织中Hyp含量的分析方法。该方法简单、快速、灵敏, 准确度及精密度良好, 可用于肝组织中羟脯氨酸的快速定量分析。

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