乳糖(lactose)是一种双糖, 由一分子β-D-半乳糖和一分子α-D-葡萄糖在β-1, 4-位形成糖苷键后相连, 分子式为C12H22O11, 相对分子质量为342.3。乳糖有两种端基异构体:α-乳糖和β-乳糖, 在水溶液中可互相转化。α-乳糖很容易结合一分子结晶水。乳糖作为一种药用辅料, 以填充剂或稀释剂的形式广泛应用于片剂、胶囊、颗粒剂和冻干产品中。目前, 有方法[1-3]采用氢型糖柱或钙型糖柱进行乳糖等糖类目标物的分离, 虽然氢型糖柱或钙型糖柱稳定性优于氨基色谱柱, 但是该类型色谱柱的选择性有限, 其对糖类目标物的分离选择性不如氨基色谱柱[4-10], 因而国家标准[11]和2015版《中华人民共和国药典》[12]仍然推荐使用氨基色谱柱。2015版《中华人民共和国药典》[12]在“有关物质”和“含量测定”项目中对色谱条件有以下规定:以氨基键合硅胶色谱固定相为填充剂, 以乙腈-水(70:30, v/v)为流动相, 示差检测器检测, 柱温为45 ℃, 检测器温度为40 ℃。然而在实际检测过程中发现，采用市面上利用硅胶和三官能团烷氧基氨丙基硅烷化试剂键合所得的普通氨基键合硅胶色谱固定相进行该项目的测定时, 经常会遇到以下问题[13-15]: (1)柱效达不到所规定的16 500块/m的理论塔板数; (2)蔗糖和乳糖不能达到基线分离; (3)乳糖峰面积的RSD值不能满足2.0%以下, 无法对其进行准确定量。究其原因, 可能是普通氨基键合硅胶色谱固定相存在氨基, 容易在酸性条件下质子化, 且固定相在高比例水相色谱条件下容易水解脱落等。
本文基于乳糖在测定过程中存在的上述问题, 进行了氨基固定相键合工艺的研究, 开发了新型异丙基团侧链保护的氨基色谱固定相。该新型氨基键合硅胶色谱固定相通过筛选合适的氨丙基硅烷化试剂制备而得, 克服了目前市场上常用的多官能团键合工艺的弱点[16]。合成的固定相增强了氨基基团在硅胶表面的键合稳定性, 使其耐水性和稳定性都大大提高, 氨基基团更不容易从硅胶表面脱落, 从而解决了2015版《中华人民共和国药典》中乳糖含量测定方法存在的众多问题。
Agilent 1260高效液相色谱仪(美国Agilent公司); FT-IR 650红外光谱仪(天津港东科技发展股份有限公司); JP-020S超声波清洗器(深圳市洁盟清洗设备有限公司); XW-80A涡旋混合振荡器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。
硅胶(5 μm, 12 nm)、甲苯和甲醇(分析纯)(浙江月旭材料科技有限公司); 3-氨丙基三乙氧基硅烷、3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷和3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷(纯度均为95%, 阿拉丁试剂有限公司); 乳糖和蔗糖对照品(纯度均大于99.0%, 中国食品药品检定研究院); 乙腈(HPLC级, 德国Merck公司); 实验用水为娃哈哈超纯水(杭州娃哈哈集团有限公司)。其余试剂均为国产分析纯。
混合对照品溶液:各取乳糖和蔗糖对照品适量, 加水超声溶解并稀释成质量浓度均为l.0 g/L的混合对照品溶液。
按照十八烷基键合硅胶的键合方式[17], 准确称取10.0 g硅胶、5.0 g 3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷和100 mL甲苯, 置于250 mL三口瓶中, 于110 ℃下搅拌回流反应12 h, 反应结束后分别用甲苯、甲醇洗涤所得的固体粉末, 过滤并收集滤饼, 于100 ℃真空干燥条件下烘干, 即得异丙基侧链保护的氨基色谱固定相。将制备的色谱固定相命名为1号氨基色谱固定相，其制备过程中的化学反应示意图见图 1。
分别以3-氨丙基二甲基乙氧基硅烷和3-氨丙基三乙氧基硅烷为硅烷化试剂，制备2号和3号氨基色谱固定相。
以正己烷-异丙醇(9:1, v/v)溶液为匀浆剂，将上述3种氨基键合硅胶色谱固定相进行色谱柱的装填, 装填压力为40 MPa, 装填完成后得到1~3号氨基色谱柱(规格为300 mm×4.6 mm, 5 μm)。
色谱柱:1~3号氨基键合硅胶色谱柱; 柱温:45 ℃; 流动相:乙腈-水(70:30, v/v); 流速:1.0 mL/min; 等度洗脱; 进样量:10 μL; 示差检测器检测池温度:40 ℃。
对3种氨基色谱柱进行碳载量测试，结果表明, 1号、2号和3号氨基键合硅胶色谱固定相的碳载量分别为3.0%、4.3%和5.2%。究其原因, 3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷由于存在较大基团的位阻效应, 与硅胶的反应程度最低, 因而其制备固定相的碳载量最低[18]; 3-氨丙基三乙氧基硅烷是三官能团的活性试剂, 与硅胶的反应程度相比于其他两种硅烷试剂的程度高, 因而碳载量最高。
对3种氨基键合硅胶色谱固定相进行了红外光谱表征，其FT-IR光谱图见图 2。从图 2中可以看出, 800 cm-1和1 100 cm-1处为Si-O键的红外吸收峰, 3 441 cm-1处为H2O中OH-的吸收峰, 说明3种氨基色谱固定相均含有Si-O键, 且均有红外吸收; 在2 928 cm-1和2 857 cm-1处分别出现CH2-对称伸缩振动峰, 这表明硅胶表面成功键合了氨丙基硅烷试剂；在1 385 cm-1处出现的吸收峰为异丙基基团(CH3)2CH-的特征吸收峰, 证明异丙基官能团成功键合到硅胶表面。
采用1~3号氨基键合硅胶色谱柱分析乳糖和蔗糖混合对照品溶液，乳糖和蔗糖的质量浓度均为1.0 g/L，其色谱图分别见图 3a~3c。
采用1号、2号和3号氨基色谱柱进行该项目的测定时, 其乳糖色谱峰的理论塔板数分别为29 476、21 036和33 864块/m, 均满足2015版《中华人民共和国药典》对柱效(理论塔板数16 500块/m)的要求。对乳糖和蔗糖混合对照品溶液进一步进行测定, 连续进样5针，发现采用1号(见图 4a~4e)、2号(见图 4f~4j)和3号(见图 4k~4o)氨基色谱柱时，乳糖峰面积的RSD分别为1.14%、2.53%和2.72%。只有采用1号氨基色谱柱时，乳糖峰面积的RSD小于2015版《中华人民共和国药典》规定的2.0%。而且采用1号氨基色谱柱时，蔗糖和乳糖也能达到基线分离，分离度为3.03。因而综合判断, 经过改进的稳定性更好、耐水性更强的1号异丙基团侧链保护的氨基色谱柱适合2015版《中华人民共和国药典》项下乳糖含量测定的要求。
根据2.2节的色谱柱性能评价结果可知，使用1号异丙基侧链保护的氨基色谱柱测定乳糖时, 其峰面积稳定性最好, 原因可能是固定相表面异丙基空间位阻的保护作用, 在酸性条件和高比例水相条件下更不容易水解[19], 其结构见图 1。采用3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷试剂, 不仅不会存在反应结束后硅烷化试剂本身会存在未反应的Si-OH基团, 而且由于硅烷化试剂结构上异丙基基团的位阻作用, 即使硅胶表面有大量未反应的Si-OH基团, 也会对Si-OH基团有较多的屏蔽作用, 这样使Si-OH基团和乳糖目标物分子的非特异性吸附作用大大降低, 使得该色谱柱对乳糖分离具有一系列满意的色谱行为。
使用2号氨基色谱柱测定乳糖时, 其峰面积不够稳定(其固定相结构见图 5a)。这可能是因为硅烷试剂不能完全和硅胶表面的Si-OH进行反应, 反应结束后硅胶表面仍有大量的Si-OH基团存在, 造成乳糖峰面积不稳定、峰形拖尾等一系列色谱行为；使用3号氨基色谱柱(其固定相结构见图 5b)时, 3-氨丙基三乙氧基硅烷试剂属于活性较高的三官能团活性试剂, 反应结束后仍有残余未反应的Si-OH基团在固定相的表面, 由于空间位阻的影响, 很难像图 5c所示形成三键键合反应所得的固定相结构, 因而3号氨基色谱柱在和乳糖目标分子的作用过程中, 由于未反应的Si-OH基团(包括硅胶表面未反应的Si-OH和硅烷试剂所含的未反应的Si-OH)会造成较多的非特异性吸附问题[16, 20], 表现的色谱行为即为色谱峰的面积不稳定、保留时间不稳定、色谱峰拖尾因子较大等。
按1.3节中色谱固定相的合成方法, 连续合成3批异丙基侧链保护的氨基色谱固定相, 3个批次固定相的碳载量参数分别为3.0%、3.2%和3.1%, 初步说明键合的色谱固定相重复性较好。将3批固定相装填成相应的色谱柱, 用于乳糖的测定, 发现其测定乳糖时的理论塔板数均大于16 500块/m, 乳糖和蔗糖均能够达到基线分离, 且乳糖峰面积的RSD值均小于2.0%, 证明合成的固定相具有良好的重复性。
将制备的异丙基侧链保护的氨基色谱柱与另外两种商品化氨基色谱柱进行对比(见表 1)。两种商品化色谱柱的信噪比分别为10.0和15.2, 小于本文制备的异丙基侧链保护的氨基色谱柱的信噪比(31.2), 可见商品化色谱柱灵敏度不如异丙基侧链保护的氨基色谱柱的灵敏度。此外, 两种商品化色谱柱测定乳糖时, 其峰面积的RSD值大于2015版《中华人民共和国药典》规定的2.0%。因而从灵敏度和乳糖峰面积的RSD值的指标来看, 本文制备的异丙基侧链保护的氨基色谱柱优于商品化氨基色谱柱。
通过连续进样的方式考察异丙基侧链保护的氨基色谱柱的使用寿命, 结果发现:采用异丙基侧链保护的氨基色谱柱对乳糖和蔗糖进行分析, 进样次数达到200针后柱效没有明显下降, 峰形也没有明显异常(见图 6)。
本文利用3-氨丙基二异丙基乙氧基硅烷试剂合成了异丙基侧链保护的氨基键合硅胶色谱柱, 按照2015版《中华人民共和国药典》的要求对乳糖进行了测定。系统适用性试验结果表明:乳糖与蔗糖的分离度、理论塔板数和峰面积的RSD均完全满足2015版《中华人民共和国药典》的规定。因此, 本文合成的异丙基侧链保护的氨基色谱柱能够作为2015版《中华人民共和国药典》方法中乳糖含量测定的质控色谱柱。
2018,
Vol. 36 Issue (2): 94-99
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