氟虫腈(fipronil, 结构式见图 1)又称芬普尼、锐劲特, 为苯基吡唑类杀虫剂。动物实验研究表明, 短期摄取大量氟虫腈会对神经系统造成不良影响, 长期摄取氟虫腈可能会损害肝脏、甲状腺和肾脏[1]。联合国粮农组织和世界卫生组织农药残留联席会议(JMPR)建立的氟虫腈人体安全摄入量(ADI)为每天不超过0.000 2 mg/kg体重[2]。2017年7月, 比利时有关部门发现荷兰鸡蛋含有氟虫腈, 同年8月欧洲16个国家、韩国等国家及香港、台湾地区相继在鸡蛋中发现氟虫腈, 使“毒鸡蛋”事件发酵成世界范围内的重大食品安全事件, 为我国禽蛋及蛋制品的安全敲响了警钟。
目前世界各国已对鸡蛋中氟虫腈(以氟虫腈及其代谢物氟虫腈砜(fipronil sulfone)之和计)的残留量制定了最大限量标准(MRL), 其中, 国际食品法典委员会(CAC)规定的MRL值为0.02 mg/kg[3]; 美国为0.15 mg/kg[4]; 欧盟为0.005 mg/kg[5]。
目前食品中氟虫腈的检测方法有气相色谱法(GC)[6-8]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[9, 10]、液相色谱法(LC)[11]和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)[12]。我国食品安全国家标准GB 2763-2016对谷物、果蔬、糖料、食用菌和油脂中的氟虫腈(以氟虫腈及其代谢产物氟虫腈砜、氟虫腈亚砜(fipronil sulfide)和氟甲腈(fiipronil desulfinyl)之和计)制订了残留限量标准[13], 并对茶叶、果蔬、鸡肉中的氟虫腈制订了检测标准[14-17], 也有较多文献[11-16]报道了植物性食品中氟虫腈的检测方法, 但是未见禽蛋及蛋制品中氟虫腈检测方法的文献和标准, 因此建立禽蛋及蛋制品中氟虫腈的检测方法, 对严防“毒鸡蛋”入境、保障国内禽蛋和蛋制品安全具有重要意义。本研究采用溶剂提取, PRiME HLB SPE柱净化前处理, 以乙虫腈为内标, 建立了快速、准确、灵敏度高的液相色谱-四极杆飞行时间质谱法(LC-QTOF MS)快速筛查禽蛋及蛋制品中氟虫腈的含量, 该法目前尚未见报道。该法将LC-QTOF MS灵敏高效、定性能力强的优点与改良SPE前处理快速简便的优点充分结合, 检测周期短、定性准确, 能够有效应对突发性、大批量禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的检测需求, 为执法部门提供执法依据和方法储备, 保障人民的食品安全。
1290-6545液相色谱-四极杆飞行时间质谱仪, 配有双喷射流离子聚焦电喷雾离子源(Dual AJS ESI源) (美国Agilent公司); Centrifuge 5810 R离心机(德国Eppendorf公司); KMC-1300 V触式振荡器(韩国Vision公司); 固相萃取装置(美国Supelco公司, 型号:57250-U); Oasis PRiME HLB SPE柱(300 mg/3 mL, 美国Waters公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)。鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱均从上海市场采购。
氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈标准品(纯度＞98%, 德国Dr. Ehrenstorfer公司); 乙虫腈(ethiprole)标准品(内标, 纯度＞98%, 加拿大CDN公司); 乙腈(色谱纯, 德国CNW公司); 甲酸(色谱纯, 美国Sigma-Aldrich公司); 无水乙酸铵、无水硫酸镁、氯化钠、二水合柠檬酸钠、柠檬酸二钠盐(分析纯, 国药集团化学试剂有限公司)。实验用水由Milli-Q超纯水系统制得。0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液:准确量取1 mL甲酸, 用乙腈定容至100 mL。
分别准确称取适量氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈和乙虫腈标准品, 用乙腈溶解并定容, 配制质量浓度为100 mg/L的氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈标准储备液和内标储备液, 于-18 ℃避光保存; 移取氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈标准储备液和内标储备液, 根据需要用乙腈逐级稀释, 配制适当浓度的标准工作液和内标工作液, 现用现配。
色谱柱:Agilent Poroshell 120 EC C18色谱柱(150 mm×3 mm, 2.7 μm); 进样量5 μL; 流动相A:水, B:乙腈。梯度洗脱程序:0~1.0 min, 2%B; 1.0~4.0 min, 20%B; 4.0~22.0 min, 60%B; 22.0~29.0 min, 95%B, 29.0~34.0 min, 2%B。流速:0.4 mL/min。
离子源:Dual AJS ESI源; 扫描方式:负离子扫描; 扫描范围:m/z 100~1 000;毛细管电压:3 500 V; 鞘气温度:325 ℃; 鞘气气流:10 L/min; 干燥气温度:280 ℃; 干燥气气流:8 L/min; 雾化气压力:270 kPa; 去簇电压:180 V; 锥孔电压:65 V; 八极杆射频电压:750 V。其他质谱参数见表 1。
新鲜鸡蛋去壳后搅拌混匀; 蛋糕和鸡蛋面用粉碎机捣碎; 蛋黄酱直接使用。称取2 g试样(精确至0.01 g)于50 mL离心管中, 加入10 mL水、20 μL 1 mg/L的乙虫腈内标工作溶液、10 mL 0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液, 剧烈振荡提取5 min, 以4 500 r/min离心10 min, 待净化。
取0.5 mL上清液加入Oasis PRiME HLB SPE柱, 弃去流出液, 再加入1 mL上清液, 收集流出液于15 mL离心管中, 取0.5 mL上述收集液, 用乙腈定容至1 mL, 过0.45 μm有机相滤膜后, 进样检测。
在优化的色谱和质谱条件下进样, 对氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈和乙虫腈进行一级质谱全扫描, 获得目标物的保留时间(保留时间偏差≤2.5%)、母离子、质量偏差(＜2×10-6)以及离子化形式([M-H]-)等信息。在安捷伦PCDL数据库软件中输入5种化合物的名称、保留时间、分子式、精确相对分子质量、CAS号以建立一级精确质量数据库。
在不同碰撞能量下对已知精确质量的目标物母离子进行测定, 采集二级谱库所需的子离子信息, 通过PCDL软件建立化合物的二级信息谱库, 包括母离子、保留时间和不同碰撞能量下的二级碎片离子质谱图。
根据氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈和乙虫腈的化学结构(见图 1), 本实验选用Agilent Poroshell 120 EC C18表面多孔填料色谱柱, 分别比较了3种不同组成的流动相:乙腈-水、乙腈-0.1%(v/v)甲酸水溶液、5 mmol/L乙酸铵水溶液-乙腈溶液(均含0.1%(体积分数)甲酸)对目标化合物的分离效果和灵敏度。结果表明, 在乙腈-水溶液体系下, 通过梯度洗脱, 氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜和氟甲腈的峰形最佳(见图 2), 故选为本方法使用的流动相。
根据化合物的特性选取乙酸乙酯、甲醇、乙腈和0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液作为提取溶剂, 对阴性鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱样品添加5.0 μg/kg混合标准溶液进行提取, 采用外标法定量, 考察提取回收率。结果(见图 3)表明, 用乙酸乙酯和甲醇提取时, 氟虫腈及其代谢物的回收率＜60%, 达不到检测要求; 用乙腈、酸化乙腈提取时, 回收率均可满足检测方法的要求, 但是采用乙腈提取鸡蛋样品时, 鸡蛋样品存在较大的基质效应(ME), 通过加入0.1%(v/v)甲酸, 能减少基质效应, 提高回收率。因此, 本研究选择0.1%(体积分数)甲酸乙腈溶液作为提取溶剂。
目前报道的氟虫腈及其代谢物的净化方法有QuEChERS法[13, 16]、固相萃取法[14, 17]、固相微萃取法[15]和弗罗里硅土层析法[11], 固相萃取法使用的萃取柱类型有石墨化炭黑柱、中性氧化铝柱和PRiME HLB柱。由于固相微萃取装置昂贵、选择性差, 弗洛里硅土层析柱装柱繁琐, 不利于实际应用, 因此实验分别选择QuEChERS法、石墨化炭黑柱、中性氧化铝柱和PRiME HLB柱对加标5.0 μg/kg混合标准溶液的鸡蛋提取液进行净化, 以基质匹配外标法定量, 比较回收率。结果发现, QuEChERS法、中性氧化铝柱和石墨化炭黑柱除脂效果一般, 净化液较混浊, 回收率较低。PRiME HLB柱能去除样品中大多数的磷脂, 减少基质效应(见图 4), 因此本方法选择PRiME HLB柱净化。
分别取1 mL 100 mg/L的这5种化合物的标准工作液, 利用流动注射泵进样, 在负离子模式下进行一级质谱全扫描。由于氟虫腈及其代谢物等的化学结构中均含有NH2基团, 因此在负离子模式下较易失去H而形成准分子离子。实验通过一级质谱全扫描得到氟虫腈母离子[M-H]-(435.938 7)、氟虫腈砜母离子[M-H]-(451.933 6)、氟虫腈亚砜母离子[M-H]-(419.943 8)、氟甲腈母离子[M-H]-(387.971 7)和乙虫腈母离子[M-H]-(395.982 6)。依据所建立的方法和一级特征离子信息库, 可在没有标准物质的情况下实现对样品的分析, 利用精确质量数、保留时间、相对丰度比等相关信息实现对目标化合物的快速定性及准确定量。
对5种化合物的母离子施加10、20、30、40和50 eV的碰撞能量，采集二级质谱图, 根据不同碰撞能量下母离子碎裂程度, 选择能得到碎片离子分布均匀、响应良好的二级质谱图下的碰撞能量为最佳碰撞能量。氟虫腈、氟虫腈砜、氟虫腈亚砜、氟甲腈和乙虫腈的最佳二级碰撞能量分别为30、20、20、30和30 eV。在上述碰撞能量下得到的二级质谱图见图 5。实验选择基质干扰少、选择性高的两对子离子作为定性、定量离子(见表 1)。
在Targeted MS/MS采集模式下, 输入疑似目标物的母离子、保留时间及最佳碰撞能量, 测定结果用二级质谱库检索, 根据欧盟2002/657/EC指令[18], 当二级质谱中有两个及两个以上的特征离子匹配, 则可确证其为目标物。
基质效应普遍存在于质谱分析中, 基质对ESI源往往具有明显的离子化抑制作用, 影响检测灵敏度的准确度与定量准确性。目前消除基质效应的手段主要有优化前处理条件、添加同位素内标、优化色谱分离条件、修正质谱分析参数[19-21]。本实验取鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱空白样品，分成两组。第一组按1.3节进行前处理, 第二组不经过PRiME HLB SPE小柱净化，其余前处理步骤按1.3节进行，制备成两组空白样品溶液。分别用两组空白样品溶液配制成质量浓度为1、2和5 μg/L的基质匹配标准工作溶液，同时用乙腈配制相同浓度的试剂标准工作溶液，比较PriME HLB SPE小柱净化对样品基质效应的影响。另外，分别以内标法和外标法对第一组样品进行定量分析。按公式(1)计算ME:
其中, B为基质匹配标准工作溶液中化合物的质量浓度(μg/L); C为空白基质样品中化合物的质量浓度(μg/L); A为试剂标准工作溶液中化合物的质量浓度(μg/L)。当ME大于100%时, 表明存在离子化增强效应; 当ME小于100%时, 表明存在离子化抑制效应, 结果偏离100%越多表明离子化增强或离子化抑制效果越强, 具体计算结果见表 2。
由表 2可以看出, 未经PRiME HLB SPE小柱净化的鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱样品都存在离子化抑制作用。其中鸡蛋的离子化抑制作用相对较小, ME大于70%。蛋糕和鸡蛋面样品中离子化抑制效应相对较强, ME小于70%, 可能是因为油脂含量高加强了离子化抑制效应, 这与报道过的基质组分对基质效应的影响结论类似[22]。经PRiME HLB SPE小柱净化后, 上述样品的离子化抑制效应都能有效减少(见表 2)。另外, 本实验采用与氟虫腈化学性质相近的乙虫腈作为内标对定量结果进行校正, 能有效补偿离子化抑制效应, 提高定量准确性。内标法与基质匹配法相比操作简便, 故选为本工作的定量方法。
对氟虫腈及其代谢物质量浓度分别为0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/L和乙虫腈质量浓度为1 μg/L的系列混合工作液进行测定, 以氟虫腈及其代谢物的定量离子峰面积和乙虫腈定量离子峰面积的比值为纵坐标(y), 对应的质量浓度的比值为横坐标(x), 绘制标准曲线。氟虫腈及其代谢物在0.1~5 μg/L内线性关系良好, 相关系数(r2)均大于0.99。以3倍信噪比(S/N=3)和10倍信噪比(S/N=10)确定氟虫腈及其代谢物的检出限(LOD)和定量限(LOQ)分别为0.2 μg/kg和1 μg/kg。
在鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱基质中分别添加1、2、5 μg/kg的氟虫腈及其代谢物标准品, 按1.3节进行前处理, 进行加标回收率试验(n=6)。结果表明, 方法的平均加标回收率为82.6%~98.1%, RSD为3.8%~9.9%(见表 3)。
空白鸡蛋样品和添加1 μg/kg氟虫腈及其代谢物的鸡蛋样品的选择离子色谱图分别见图 6。结果显示, 鸡蛋样品中氟虫腈及其代谢物的色谱峰峰形良好, 基质干扰少。说明该方法准确、稳定, 精密度高, 符合残留检测要求。
实验对170例市售鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱进行了检测, 其中6批次鸡蛋样品测出氟虫腈砜, 含量为0.006~3.8 mg/kg, 4批次蛋糕样品测出氟虫腈砜, 含量为0.007~0.068 mg/kg。对一级质谱发现氟虫腈砜的鸡蛋阳性样品进行二级子离子信息确证, 通过对比基质空白、标准溶液、添加回收样品和阳性样品的二级子离子质谱图(见图 7), 可确证为阳性结果。
本研究建立了液相色谱-四极杆飞行时间质谱测定鸡蛋、鸡蛋面、蛋糕和蛋黄酱中氟虫腈及其代谢物含量的快速筛查方法。采用酸性乙腈提取, PRiME HLB SPE柱净化, 对多种含蛋食品基质的净化效果良好, 可补偿食品基质中的基质效应, 有效提高定量的准确性, 扩大方法的适用范围。方法的检出限、回收率、精密度等均满足我国对食品中氟虫腈及其代谢物含量的检测要求, 可作为分析确证的储备方法。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1216-1223
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