β-受体阻断剂在临床上对冠心病、高血压、心律失常等心血管系统疾病的治疗发挥着极其重要的作用[1]; 临床上常用的苯二氮卓及其衍生物类药物有20余种, 因其具有抗焦虑、镇静催眠、抗惊厥、肌肉松弛和安定作用[2], 常被不法厂商添加于改善睡眠的保健品中, 但长期使用会造成神经系统、心血管系统等多方面的副作用和严重的依赖性; 5型磷酸二酯酶抑制剂(PDE-5)和睾酮等蛋白质同化剂因其具有改善男性勃起功能障碍、提升体能及维持肌肉强度的作用, 常被不法厂商添加于提高免疫类作用的保健品中, 但长期服用会造成肝脏损伤、内分泌失调等严重的不良反应。因此, 我国明确禁止在保健食品中添加化学药物成分。
目前, 已报道的苯二氮卓及其衍生物类、β-受体阻断剂、PDE-5和蛋白质同化剂类药物的检测方法主要有高效液相色谱法(HPLC)[3, 4]、高效液相色谱-离子阱飞行时间串联质谱法(LC-IT-TOF MS)[5]、高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)[6-9]和超高效液相色谱-串联质谱法(UPLC-MS/MS)[10-13]。其中HPLC同时检测多种化合物时灵敏度低, 选择性差; LC-IT-TOF MS测定过程简单、灵敏度高, 但仪器设备昂贵; UPLC-MS/MS因具有高灵敏度和高选择性而成为常用的测定方法[14]。现有报道中能同时检测非法添加化学药物的种类较少, QuEChERS(quick, easy, cheap, effective, rugged and safe)法结合UPLC-MS/MS同时检测保健食品中21种非法添加化学药物的方法尚未见报道。
本实验建立了同时检测保健食品中21种非法添加化学药物的QuEChERS-UPLC-MS/MS的分析方法。通过对样品前处理方法的优化及UPLC-MS/MS条件的选择, 获得了较好的提取效率和重复性。本方法快速准确, 灵敏度高, 重复性好, 实用性强, 为改善睡眠类、提高免疫力类保健食品中非法添加化学药物的检测及监控提供了可靠的技术支持。
API5500QTRAP高效液相色谱-串联质谱仪(美国ABSciex公司); LC-30AD超高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司); Sartorius BS210S电子天平(德国Sartorius公司); XH-B型旋涡混合器(江苏康健医疗用品有限公司); SR-2DS强力振荡器(日本Taitec公司); N-EVAP116氮气吹干浓缩仪(美国Organomation Associates公司); Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司); ACQUITY UPLCTM BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm, 美国Waters公司)。
甲醇、乙腈均为色谱纯(美国Tedia公司); 甲酸为色谱纯(美国Roe Scientificing公司); N-丙基乙二胺(PSA, 美国Agilent公司); 无水MgSO4(成都科龙化工试剂厂)。实验用水为超纯水。
本实验所用标准品纯度均≥98%, 其中, 红地那非(acetildenafil)、羟基豪莫西地那非(hydroxyhomosildenafil)、那莫西地那非(norneosildenafil)、伐地那非(vardenafil)、伪伐地那非(pseudo vardenafil)均购自加拿大TRC公司; 阿普唑仑(alprazolam)、卡马西平(carbamazepine)、地西泮(diazepam)、艾司唑仑(estazolam)、多虑平(doxepin)、利眠宁(chlordiazepoxide)由重庆市公安局提供; 纳多洛尔(nadolol)、氧希洛尔(oxprenolol)、普萘洛尔(propranolol)、卡拉洛尔(carazolol)、醋丁洛尔(acebutolol)、美托洛尔(metoprolol)、艾司洛尔(esmolol)、诺龙(nandrolone)、睾酮(testosterone)、甲睾酮(methyltestosterone)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。
口服液、保健酒样品均随机购自重庆市的药店、超市, 密封, 标识, 置于干燥阴凉处保存。
标准储备液:分别准确称取各目标物标准品0.01 g, 用甲醇溶解并配制成1 g/L的标准储备液, 于-18 ℃保存。混合标准溶液:分别吸取一定量的标准储备液, 用甲醇稀释, 涡旋混匀, 配制成质量浓度为1 mg/L的混合标准溶液, 于-18 ℃保存。混合标准工作液:移取适量混合标准溶液, 用乙腈-水(30:70, v/v)配制成1~100 μg/L的系列混合标准工作液, 现用现配。
口服液:称取2.0 g试样(精确至0.01 g), 置于50 mL具塞离心管中, 加入乙腈10 mL, 混匀, 然后强力振荡15 min, 以3 500 r/min离心3 min; 吸取全部上清液, 置于另一洁净离心管中(已加入100 mg PSA和100 mg无水MgSO4), 涡旋混匀, 强力振荡10 min后, 以3 500 r/min离心3 min; 准确移取5 mL上清液于15 mL洁净离心管中, 于40 ℃氮吹仪吹至近干, 加入1 mL乙腈-水(30:70, v/v)溶液溶解残渣, 涡旋, 过0.22 μm尼龙滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
保健酒:称取2.0 g试样(精确至0.01 g), 置于50 mL具塞离心管中, 加入10 mL乙腈-水-甲酸(60:39:1, v/v/v)溶液, 强力振荡20 min; 依次向离心管中加入50 mg PSA和150 mg无水MgSO4, 加盖涡旋混匀后, 强力振荡10 min, 以3 500 r/min离心3 min, 准确移取5 mL上清液, 置于15 mL洁净试管中, 于40 ℃氮吹仪吹至近干, 加入1 mL乙腈-水(30:70, v/v)溶液溶解残渣, 涡旋, 过0.22 μm尼龙滤膜, 供UPLC-MS/MS检测。
色谱柱:Acquity UPLCTM BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温:40 ℃; 流动相:A为乙腈, B为2 mmol/L乙酸铵溶液(含0.1%(v/v)甲酸)。梯度洗脱条件:0~1.0 min, 5%A; 1.0~4.0 min, 5%A~80%A; 4.0~8.0 min, 80%A~95%A; 8.0~10.0 min, 95%A; 10.0~13.0 min, 5%A。流速:0.3 mL/min; 进样量:2 μL。
离子源:电喷雾离子源, 正离子模式(ESI+); 扫描方式:多反应监测(MRM); 离子源温度(TEM): 550 ℃; 气帘气压力(CUR): 0.3 MPa; 电喷雾电压(IS): 5.5 kV; 雾化气压力(GS1): 0.55 MPa; 辅助气压力(GS2): 0.55 MPa; 碰撞室入口电压(EP): 10 V; 21种化学药物的监测离子对(Q1/Q3)、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和碰撞室出口电压(CXP)见表 1。
由于目标物的化学结构不同, 其酸碱性、极性等存在差异, 使用等度洗脱较难实现理想的分离效果。本实验采用Acquity UPLCTMBEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)对目标物进行梯度洗脱, 同时考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-2 mmol/L乙酸铵水溶液、乙腈-2 mmol/L乙酸铵水溶液作为流动相时, 目标物的分离效果与色谱峰形。结果表明, 以乙腈-2 mmol/L乙酸铵水溶液为流动相时, 各目标物分离效果与峰形良好。进一步考察了在乙腈-2 mmol/L乙酸铵水溶液加入甲酸对化合物离子化效率的影响。结果表明, 加入0.1%(v/v)甲酸后化学药物的离子化效率较高。因此, 以乙腈-2 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%(v/v)甲酸)为流动相梯度洗脱, 可对所有目标物实现分离，且峰形较好。
本实验采用注射泵直接进样的方式将混合标准溶液注入串联质谱仪。采用ESI+扫描方式进行一级质谱分析, 确定母离子, 优化电离电压。对母离子进行二级质谱分析, 确定碎片离子信息, 选取相对丰度较高的两个特征碎片离子为定性、定量离子, 并优化DP、EP、CXP等参数, 各目标物质谱参数见表 1。图 1为代表药物红地那非、卡拉洛尔、地西泮和睾酮的多反应监测色谱图。
地西泮、普萘洛尔、红地那非、睾酮等化合物显中性或者弱碱性; 保健食品基质多为酸性基质[15], 且多含氨基酸、糖苷等, 此类物质极性大、易溶于甲醇。提取溶剂的选择, 需考虑溶剂、基质和化学药物的性质, 查阅相关文献[16]可知, 乙腈极性范围宽, 对多数化合物均有较好的溶解性和较高的提取率, 对糖、脂肪、蛋白质化合物的提取率低, 且分子小, 组织穿通能力强。
本实验针对口服液样品分别考察了乙腈、甲醇、含1%(v/v)甲酸的乙腈溶液、含1%(v/v)乙酸的乙腈溶液、含0.1%(v/v)乙酸的乙腈-甲醇(3:7, v/v)混合溶剂、含1%(v/v)甲酸的乙腈-甲醇(7:3, v/v)混合溶剂对化学药物提取效率的影响(见图 2a)。结果表明, 酸化乙腈、酸化的乙腈-甲醇混合溶液作提取溶剂时, 口服液中多数化学药物的回收率较低, 可能由于加酸后, 口服液基质酸性加强, 多数药物以离子形式存在, 有机溶剂中的溶解度降低。甲醇作提取溶剂, 易残留极性较大的物质, 造成干扰。因此, 最终选择乙腈作为口服液的提取溶剂。
保健酒功效(标志性)成分主要为总皂苷、粗多糖及总黄酮[17], 配料主要含有水和乙醇(约38%), 乙醇对部分目标物具有一定溶解性。已报道的样品处理方法有:经乙腈稀释后过滤膜直接进样[18]或经乙腈与乙腈-水(90:10, v/v)溶液分步处理样品后过滤膜进样[19]。本实验分别考察了不同比例的乙腈-水(60:40、70:30、80:20、90:10, v/v)和乙腈对目标物提取效果的影响(见图 2b)。根据结果可知, 当乙腈-水(60:40, v/v)溶液为提取溶剂时, 多数化学药物回收率较好; 红地那非、卡马西平等化学药物的回收率低于70%。根据保健酒基质特点以及化合物性质, 进一步考察提取溶剂加酸对化学药物提取效率的影响(见图 2b)。结果表明, 加入1%(v/v)甲酸后, 21种化学药物的回收率均高于80%。因此, 以乙腈-水-甲酸(60:39:1, v/v/v)溶液作为保健酒的提取溶剂。
为保证化学药物的提取效率, 同时减少口服液、保健酒中的水、有机酸、色素、多糖类等杂质的干扰, 分别考察了氧化铝(Al2O3)、PSA、C18、无水MgSO4、石墨化炭黑(GCB)5种吸附剂对化学药物回收率的影响。结果发现, Al2O3、C18、GCB对化学药物吸附性较强, 化学药物的回收率较低; 采用无水MgSO4和PSA时, 化学药物的回收率较好。因此最终选择PSA和无水MgSO4为吸附剂。
根据基质特点, 按照1.3节样品前处理方法对吸附剂用量进行优化。根据口服液基质中含水、糖、皂苷、有机酸等杂质, 分别考察了无水MgSO4(见图 3a)和PSA(见图 3b)对化学药物提取回收率的影响。结果表明, 当无水MgSO4用量100 mg、PSA用量100 mg时, 化学药物回收率较好, 选为实验所用。
保健酒配料主要含有水和乙醇等, 乙醇可溶解部分化学药物, 与提取溶剂互溶, 实验过程中, 离心后管内未发生明显分层现象。故本实验采用Guo等[20]向提取混合物管内直接加入吸附剂的单管萃取法, 该法简便、快速, 耗时短。分别考察了无水MgSO4(见图 4a)和PSA(见图 4b)的用量对化学药物提取回收率的影响。结果表明, 当无水MgSO4用量150 mg、PSA用量50 mg时化学药物回收率较好, 选为实验所用。
超声波有助于成分溶解; 强力振荡利于提取溶剂和基质充分混合。本实验比较了超声波提取、振荡提取、超声波结合振荡提取3种提取方式对提取效率的影响。结果表明, 振荡提取口服液、保健酒类等液体保健食品, 目标物提取效率较好。因此选用振荡提取的方式对化学药物进行提取。
不同体积分数的乙腈水溶液对样品残渣中化学药物的溶解效率存在差异, 实验比较了不同体积比的乙腈-水(10:90、20:80、30:70, v/v)对化学药物溶解效率的影响。结果表明, 采用乙腈-水(30:70, v/v)定容时化学药物溶解效率高, 且峰形较好。因此, 选择乙腈-水(30:70, v/v)溶液作为定容溶剂。
保健食品多采用天然材料, 成分复杂, 糖类、皂苷等杂质对目标物的分析检测有一定干扰。本实验采用空白基质溶液与定容溶剂分别配制相同浓度的标准溶液, 根据基质效应=(基质匹配曲线的斜率/标准曲线的斜率-1)×100%的公式计算基质效应。基质效应为负值表示存在基质抑制效应; 正值表示存在基质增强效应[21]。由表 2所示可知, 口服液与保健酒中均存在较大的基质效应, 为降低基质效应的影响, 采用基质匹配曲线进行线性考察与含量测定。
将空白口服液与保健酒样品按照1.3节方法进行前处理, 采用质量浓度为1、5、10、20、50、70和100 μg/L的混合标准溶液溶解残渣，在1.4节最佳的UPLC-MS/MS条件下对化学药物进行分析测定。以峰面积(y)对质量浓度(x, μg/L)进行线性回归, 结果表明，二者呈良好的线性关系, 相关系数(R2)均≥0.992。以3倍信噪比(S/N=3)的结果作为检出限(LOD), S/N=10的结果作为定量限(LOQ)，结果表明, 口服液中化学药物的LOD和LOQ分别是0.15~3.41 μg/kg和0.51~11.36 μg/kg; 保健酒中化学药物的LOD和LOQ分别为0.07~1.59 μg/kg和0.22~5.29 μg/kg(见表 2)。
按照1.3节样品前处理方法, 向空白基质中分别加入低、中、高(10、20、100 μg/kg)3个水平的混合标准溶液进行加标回收率的测定(n=6)。结果表明, 口服液中21种化学药物平均加标回收率为61.4%~116.5%, RSD为0.2%~13.4%;保健酒中化学药物的平均加标回收率为67.4%~98.4%, RSD为0.2%~11.8%(见表 3)。
应用所建立的方法分别对市售常见的保健食品(8份口服液、1份保健酒)进行分析。结果表明, 口服液中检测出3份阳性样品, 其中, 样品1中检测出羟基豪莫西地那非和氧烯洛尔, 含量分别为3.09 μg/kg和1.02 μg/kg; 样品3中检测出甲睾酮和诺龙, 含量分别为2.21 μg/kg和7.57 μg/kg; 样品5中检测出醋丁洛尔, 含量为2.44 μg/kg; 保健酒样品中均未检出目标化合物。
本实验基于QuEChERS样品快速前处理, 建立了超高效液相色谱-串联质谱快速测定改善睡眠类、提高免疫力类保健食品中非法添加的21种化学药物的分析方法。该法对色谱和质谱参数、样品提取方式、提取溶剂、吸附剂用量等条件进行了优化。本实验操作简单、快速, 且节约实验耗材, 环保, 灵敏度高，实用性强, 为保健食品非法添加化学药物的监测工作提供了可靠的技术支持。
2017,
Vol. 35 Issue (12): 1257-1265
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