氟虫腈(fipronil)是一种苯基吡唑类杀虫剂，杀虫谱广, 可杀灭跳蚤、螨和虱，已被世界卫生组织列为“对人类有中等毒性”化学品。世界卫生组织表示，大量进食含一定浓度氟虫腈的食品，会损伤肝脏、甲状腺和肾脏。另外, 氟虫腈在环境中的光解产物氟甲腈(fipronil desulfinyl)、氧化产物氟虫腈砜(fipronil sulfone)及还原产物氟虫腈硫醚(fipronil sulfide)也都有毒性, 有的毒性甚至远高于母体氟虫腈。

目前, 欧盟Commission Regulation (EU) No 1127/2014已明确规定, 氟虫腈不得用于人类食品产业链中的畜禽养殖业中, 对蛋中氟虫腈(氟虫腈和氟虫腈砜之和)限量为0.005 mg/kg。国际食品法典委员会(CAC)和日本(http://www.fao.org/fao-who-codexalimentarius/standards/pestres/pesticide-detail/en/?p_id=202, http://www.m5.ws001.squarestart.ne.jp/foundation/agrdtl.php?a_inq=57000)对于蛋中氟虫腈的限量要求为0.02 mg/kg。美国对蛋中氟虫腈的限量要求为0.03 mg/kg(http://www.epa.gov/pesticides/regulating/tolerances.htm)。中华人民共和国环境保护部第1157号公告, 规定我国自2009年10月1日起禁用氟虫腈, 卫生用、玉米等部分旱田种子包衣剂除外。GB 2763-2016 《食品中农药残留限量》对粮谷、油料、蔬菜、水果、糖料和食用菌中氟虫腈(氟虫腈、氟虫腈硫醚、氟虫腈砜、氟甲腈之和)的要求是0.02~0.10 mg/kg。

目前我国牵涉到测定氟虫腈残留量的检测标准有SN/T 1982-2007^[1]、SN/T 4039-2014^[2]、GB 23200.8-2016^[3]、GB 23200.9-2016^[4]及GB 23200.7-2016^[5], 这些检测标准只是适用于各种植物源性产品或蜂蜜, 目标物也只针对氟虫腈, 尚无针对禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物检测方法的标准。

此外, 文献报道的氟虫腈检测方法^[6-12]也多是针对植物源性产品、水产品或血浆。陈志涛等^[6]采用乙腈水提取, 分散固相萃取净化, 气相色谱-电化学检测法(GC-ECD)测定了水产品中的氟虫腈。周昱等^[7]采用丙酮-正己烷提取茶叶中的氟虫腈及其代谢物, 固相微萃取净化, GC-ECD和气相色谱-质谱法测定, 定量限为0.002 mg/kg。丁立平等^[8]采用酸性乙腈提取, 分散固相萃取净化, 气相色谱-质谱法测定了蔬菜中的氟虫腈和丁烯氟虫腈, 定量限为0.006 mg/kg。徐敦明等^[9]采用加速溶剂萃取提取茶叶中的氟虫腈等10种吡唑和吡咯类农药, 固相萃取净化, 气相色谱-串联质谱法测定, 定量限为0.001~0.005 mg/kg。陈珊珊等^[10]采用丙酮-二氯甲烷提取虾中的氟虫腈及其代谢物, 固相萃取净化, 气相色谱-负化学源质谱(GC-NCI-MS)测定, 定量限为0.4 μg/kg。

综上所述, 建立禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物残留量的检测方法非常必要且迫在眉睫。本工作建立了GC-NCI-MS测定禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其3种代谢物残留量的检测方法。

1 实验部分

1.1 试剂与标准品

实验用水符合GB/T 6682中一级水的要求; 分析纯乙腈和氯化钠购自南京化学试剂股份有限公司; 色谱纯乙腈购自德国Merck公司。标准品:氟虫腈(CAS No. 120068-37-3), 纯度≥99%;氟虫腈硫醚(CAS No. 120067-83-6), 纯度≥99%;氟虫腈砜(CAS No. 120068-36-2), 纯度≥98%;氟甲腈(CAS No. 205650-65-3), 纯度≥99%, 均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司。

1.2 仪器与材料

Agilent 7890A气相色谱-5975C质谱联用仪(配备有CI离子源, 美国安捷伦公司); Xcelvap全自动氮吹浓缩仪(美国Horizon Technology公司); XW-80A旋涡混合仪(上海沪西分析仪器厂有限公司); SHZ-88台式水浴恒温振荡器(江苏太仓实验设备厂); Büchir-200旋转蒸发仪(瑞士步琪有限公司); Heraeus Multifuge XIR离心机(美国热电公司); Kh-500B超声波振荡器(昆山禾创超声仪器厂)。

PestiCard石墨化炭黑(GCB)填料(120~140目)购自苏州赛分科技有限公司, 乙二胺-N-丙基甲硅烷(PSA)填料(40~60目)和C18(碳载量17%)填料(40~60目)购自北京艾杰尔科技有限责任公司。

试验用到的鲜鸡蛋、冰蛋、皮蛋、全蛋粉等样本均来自于实验室送检样品或购自超市, 并储藏于实验室冷库(4 ℃)中备用。

1.3 标准溶液的配制

标准储备液:分别称取每种适量标准物质, 用色谱纯乙腈溶解, 配制成1.0 g/L的标准储备液, 于4 ℃冰箱内避光保存, 有效期为6个月。

混合标准溶液:分别移取适量标准储备液, 用色谱纯乙腈逐级稀释配制成100、10、1.0 mg/L的混合标准溶液, 于4 ℃冰箱内避光保存, 有效期为3个月。

基质标准工作溶液:量取一定体积的混合标准溶液, 根据需要用阴性样品提取净化后的溶液稀释成0.10、0.05、0.02、0.01、0.005 mg/L的系列基质标准工作溶液, 需现用现配。

1.4 提取

1.4.1 鲜鸡蛋和冰蛋

准确称取样品10 g(精确至0.01 g), 置于50 mL塑料离心管中, 加入5 mL水, 涡旋30 s, 充分混合均匀。加入分析纯乙腈25 mL, 涡旋1 min。加入氯化钠5 g, 剧烈振摇1 min。超声波提取15 min, 以8 000 r/min离心3 min, 取上层清液至鸡心瓶中。残渣再加入15 mL分析纯乙腈提取一次, 合并提取液。于40 ℃水浴下旋转蒸发至干。加入分析纯乙腈2.0 mL, 涡旋1 min, 待净化。

1.4.2 皮蛋和全蛋粉

准确称取样品5 g(精确至0.01 g), 置于50 mL塑料离心管中, 加入10 mL水, 涡旋30 s, 充分混合均匀。加入分析纯乙腈25 mL, 涡旋1 min。加入氯化钠5 g, 剧烈振摇1 min。超声波提取15 min, 以8 000 r/min离心3 min, 取上层清液至鸡心瓶中。残渣再加入15 mL分析纯乙腈提取一次, 合并提取液。于40 ℃水浴下旋转蒸发至干。加入分析纯乙腈1.0 mL, 涡旋1 min, 待净化。

1.5 QuEChERS净化

将待净化样液转移至预先加入100 mg PSA、150 mg GCB、50 mg C18的试管中, 涡旋1 min, 过0.22 μm有机相滤膜后转移至进样小瓶, 待GC-NCI-MS技术分析。

1.6 仪器分析

色谱柱:HP-5ms弹性石英毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm); 升温程序:初始温度70 ℃, 以25 ℃/min升至300 ℃, 保持2.8 min; 载气:高纯氦气(≥99.999%); 载气流速:1.0 mL/min; 进样体积:1 μL; 进样模式:脉冲不分流进样(脉冲压力:172 kPa), 1.50 min后打开分流阀; 进样口温度:270 ℃; 接口温度:280 ℃; 离子源温度:150 ℃; 四极杆温度:150 ℃; 电离模式:NCI; 电子能量:经自动调谐后得到的电子能量; 溶剂延迟时间:5.80 min; 反应气:高纯甲烷气(≥99.999%); 数据采集模式:选择离子监测(SIM)模式, 监测离子见表 1。

表 1 (Table 1)

表 1 NCI源下氟虫腈及其代谢物的保留时间、定量离子、定性离子和定量限 Table 1 Retention times, quantitative ions, qualitative ions and LOQs of fipronil and its metabolites in negative chemical ionization (NCI) mode Compound tR/ min Quantitative ion (m/z) Qualitative ions (m/z) LOQ/ (μg/kg) Fipronil desulfinyl 7.4 352 318, 354 0.05 Fipronil sulfide 8.0 384 386, 350 0.025 Fipronil 8.1 366 331, 400 0.10 Fipronil sulfone 8.6 416 383, 452 0.05

表 1 NCI源下氟虫腈及其代谢物的保留时间、定量离子、定性离子和定量限 Table 1 Retention times, quantitative ions, qualitative ions and LOQs of fipronil and its metabolites in negative chemical ionization (NCI) mode

2 结果与讨论

2.1 仪器方法的选择

前言中所说的标准(GB 23200.8-2016^[3]、GB 23200.9-2016^[4]、GB 23200.7-2016^[5])均采用气相色谱-质谱-电子轰击电离(EI)源技术进行分析, 但是从定量限可以看出, 其灵敏度无法满足欧盟0.005 mg/kg的限量要求, 原因是EI在分析蛋制品的时候基质成分带来的背景噪声较大, 造成信噪比下降, 从而影响其灵敏度, 需要进行繁琐复杂的净化过程。

由于氟虫腈及其3种代谢物分子结构中均含有6个F原子、两个Cl原子和一个氰基基团, 具有较强的电负性, 因此选用对含电负性基团或元素有特异性响应的NCI技术进行测定无疑是较好的选择, SN/T 1982-2007^[1]和陈珊珊等^[10]均采用NCI分析氟虫腈。NCI属于软电离技术, 一方面对蛋制品基质成分和色谱柱柱流失没有响应, 具有较低噪声背景的巨大优势, 正常阴性样品得到的总离子流色谱图和进空针得到的基线谱图基本一致; 另一方面, 对含电负性的有机物有特异性响应, 且随着待测物质的电负性增强, 灵敏度也显著增强, 因此本工作选择GC-NCI-MS进行分离分析。

2.2 前处理的优化

2.2.1 提取条件

鲜蛋和冰蛋样品本身含有一定的水分, 称取10 g样品加入5 mL水可以充分稀释和混匀, 加入提取溶剂后涡旋即可充分渗透, 确保提取效果。

蛋粉和皮蛋样品含水量较少, 实验初期尝试称取10 g样品加入5 mL水, 结果仍呈现较为浓稠的糊状, 加入提取溶剂后, 无论涡旋、超声或猛烈振摇均不能实现充分渗透。故将蛋粉和皮蛋样品的称样量减少为5 g, 加水量增加到10 mL, 使样品充分稀释, 得到混悬液, 加入提取溶剂后, 涡旋能够使提取溶剂充分渗透, 实现完全提取。

2.2.2 净化条件

采用经典的分散固相萃取技术QuEChERS进行净化, 试剂用量小, 效率高, 一次实验一个人可以同时完成上百个样本的前处理。

对常用的PSA、GCB和C18 3种填料的使用量(50、100、150 mg 3个使用量)进行了正交试验, 综合考虑了回收率、净化效果、基质效应、仪器维护保养和经济效益等因素, 最终确定净化剂加入量分别为100 mg PSA、150 mg GCB和50 mg C18。另外, 由于实验结果显示出有一定的基质增强效应, 为了保证检测结果的准确性, 本工作采用了制作基质标准曲线进行外标法定量。

2.3 方法学验证

2.3.1 标准曲线和定量限

采用4种基质配制得到的基质标准溶液在0.005~0.10 mg/L内4种目标物均呈现良好的线性, 其中阴性鲜鸡蛋基质标准溶液(0.05 mg/L)的总离子流色谱图(TIC)见图 1。根据定量限信噪比等于10可以得知氟虫腈及其3种代谢物的定量限(见表 1)。可以看出, 方法的灵敏度很高, 所有基质的方法定量限完全满足国际国内的限量要求。

图 1

Fig. 1

图 1 阴性鲜鸡蛋基质标准溶液(0.05 mg/L)的TIC图 Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatogram of mixed standard solution (0.05 mg/L) with matrix of negative egg

2.3.2 方法的准确度及精密度

选取阴性鲜鸡蛋、冰蛋、皮蛋、全蛋粉样品做添加回收试验, 4个添加水平分别为0.1、2.0、4.0、20.0 μg/kg, 每个添加水平做6个平行样, 平均回收率及其RSD见表 2。

表 2 (Table 2)

表 2 氟虫腈及其代谢物在4种基质中4个添加水平下的回收率及其RSD (n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites at four spiked levels in four matrixes (n=6) Matrix Spike level/ (μg/kg) Recoveries/RSDs/% Fipronil desulfinyl Fipronil sulfide Fipronil Fipronil sulfone Egg 0.1 95.8/11.4 94.4/9.5 96.5/10.7 93.3/9.4 2.0 97.8/10.6 99.3/9.9 89.8/11.2 90.0/10.9 4.0 94.9/9.1 96.8/8.3 94.4/8.8 93.9/8.3 20.0 95.7/7.0 96.1/7.8 91.6/7.9 91.8/8.5 Frozen egg 0.1 98.4/8.6 95.7/9.8 91.6/10.5 95.5/11.8 2.0 96.2/12.2 94.1/11.4 88.7/10.3 90.1/11.5 4.0 94.8/9.0 96.0/9.7 93.1/9.6 91.6/9.3 20.0 92.2/7.5 95.7/8.3 92.1/8.6 91.9/8.0 Preserved egg 0.1 91.5/12.1 90.8/10.5 87.9/9.7 92.6/11.9 2.0 88.3/11.4 90.7/11.1 90.0/10.4 90.3/11.8 4.0 91.9/9.8 90.5/9.9 94.2/8.0 88.3/8.6 20.0 94.6/10.2 94.2/9.7 95.9/7.8 91.4/8.0 Egg powder 0.1 86.8/11.6 96.4/9.5 94.8/8.6 95.2/10.4 2.0 87.4/12.7 89.8/11.2 87.7/11.2 87.0/11.4 4.0 90.6/9.9 89.5/9.2 90.0/9.4 89.0/9.5 20.0 93.0/9.3 92.3/9.3 93.0/8.5 91.4/9.0

表 2 氟虫腈及其代谢物在4种基质中4个添加水平下的回收率及其RSD (n=6) Table 2 Recoveries and RSDs of fipronil and its metabolites at four spiked levels in four matrixes (n=6)

从表 2数据可以看出, 4个添加水平下, 4种不同的基质, 氟虫腈及其3种代谢物的平均回收率均处于87.0%~99.3%, 所有RSD均≤12.7%。说明方法准确可靠, 精密度较好。

2.4 实际样品的检测

利用所建立的禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物的检测方法, 已检测鲜鸡蛋、冰蛋、皮蛋、全蛋粉等送检样品近200个, 其中有8个样品检测出含有氟虫腈砜和氟甲腈, 氟虫腈砜含量为0.5~2.0 μg/kg, 氟甲腈含量为0.8~4.0 μg/kg, 均未超过欧盟的限量标准。

图 2为检出氟甲腈残留的阳性鲜鸡蛋样品的TIC图。

图 2

Fig. 2

图 2 氟甲腈阳性鲜鸡蛋样品(1.1 μg/kg)的TIC图 Fig. 2 TIC chromatogram of an egg sample with residual of fipronil desulfinyl (1.1 μg/kg)

3 结论

本工作建立了GC-NCI-MS测定禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其3种代谢物残留量的检测方法。实验表明，该法灵敏度、准确度较高, 精密度较好, 可用于禽蛋及蛋制品中氟虫腈及其代谢物残留量的测定。

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