色谱  2018, Vol. 36 Issue (4): 413-415   PDF    
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钮利喜
马师师
2, 3-吡啶二甲酰亚胺及其工程菌转化产物的高效液相色谱检测
钮利喜, 马师师     
山西大学生物技术研究所, 教育部化学生物学与分子工程重点实验室, 山西 太原 030006
收稿日期：2017-10-09
通讯联系人：钮利喜, E-mail:nlx@sxu.edu.cn
摘要：建立了利用含D-海因酶的基因工程菌转化吡啶二甲酰亚胺（PDI）生成3-氨基甲酰基-α-吡啶甲酸（α-3CP）的高效液相色谱（HPLC）检测方法。将工程菌pET3a-hyd/BL21（DE3）诱导表达后收集菌体，以PDI为底物，37℃摇床反应30 min后，以13000 r/min离心，取上清液进行HPLC检测。色谱条件：HypersilTM GOLD C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相为H2O-乙腈（体积比为90：10，含0.1%（体积分数）三氟乙酸）；检测波长为254 nm。当底物PDI达到饱和浓度时，测得工程菌pET3a-hyd/BL21（DE3）的比活力为0.61 U/（mL·10OD600 nm）。该研究为今后利用生物法制备复杂半酰胺有机物提供了坚实的理论基础。
关键词：高效液相色谱法    3-氨基甲酰基-α-吡啶甲酸    2, 3-吡啶二甲酰亚胺    工程菌    
Analysis of 2, 3-pyridinedicarboximide and its products conversed by engineering strain with high performance liquid chromatography
NIU Lixi, MA Shishi     
Institute of Biotechnology, Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: A high performance liquid chromatography (HPLC) method was established for the detection of 2, 3-pyridinedicarboximide (PDI) and its enzyme reaction products, 3-carbamoyl-α-picolinic acid (α-3CP), using an engineering strain containing the D-hydantoinase gene expression box.The strain pET3a-hyd/BL21(DE3) was collected after induction and added to a PDI saturated aqueous solution.After reacting at 37℃ for 30 min with constant stirring, the supernatant was separated by centrifugation at 13000 r/min and detected by HPLC.The chromatographic conditions were as follows:HypersilTM GOLD C18 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm), H2O-acetonitrile (90:10, v/v) containing 0.1%(v/v) trifluoroacetic acid as the mobile phase with a flow rate of 1 mL/min and a detection wavelength of 254 nm.The specific activity of pET3a-hyd/BL21(DE3) was found to be 0.61 U/(mL·10OD600 nm).This study provides a theoretical basis for the preparation of complicated half-amides using biological methods.
Key words: high performance liquid chromatography (HPLC)     3-carbamoyl-α-picolinic acid     2, 3-pyridinedicarboximide     engineering strain    

3-氨基甲酰基-α-吡啶甲酸(3-carbamoyl-α-picolinic acid, α-3CP)作为一类重要的结构单元, 是合成药物和现代农药时的一种通用有机合成中间体, 具有广阔的应用前景, 如利用它可以合成烟碱类杀虫剂[1]。其化学合成主要是利用2, 3-吡啶二羧酸(2, 3-pyridinedicarboxylic acid, PDC)和氨合成2, 3-吡啶二甲酰亚胺(2, 3-pyridinedicarboximide, PDI), 再通过PDI水解得到α-3CP[2]。但是PDI的水解反应随机发生于分子中两个酰胺键中的一个, 生成α-3CP和2-氨基甲酰基-β-吡啶甲酸(2-carbamoyl-β-picolinic acid, β-2CP)两种水解产物。利用D-海因酶催化PDI水解可以特异地断裂其中的一个酰胺键, 只生成α-3CP, 从而避免副反应产物β-2CP的生成(见图 1)[3]。目前国内尚未见对复杂环酰亚胺底物进行酶催化转化的报道。

图 1 D-海因酶区域选择性水解PDI为α-3CP的示意图 Fig. 1 Schematic diagram of regioselective hydrolysis of PDI catalyzed to α-3CP by D-hydantoinase PDI:2, 3-pyridinedicarboximide; α-3CP:3-carbamoyl-α-picolinic acid.

环酰胺酶超家族(superfamily of cyclic amide hydrolases)是生物体内重要的水解酶类之一, 可水解不同的环酰胺键。根据底物专一性不同可将其分为环酰脲水解酶和环酰亚胺水解酶。环酰脲水解酶包括海因酶(hydantoinase)、二氢尿嘧啶酶、二氢乳清酸酶、尿囊素酶[4]。环酰亚胺水解酶一般作用于简单的环酰亚胺, 最适底物是含硫的环酰亚胺, 生成相应的半酰胺。海因酶的最适底物是海因或二氢尿嘧啶, 其中少数海因酶还能作用于复杂的环酰亚胺[5, 6]。

目前对D-海因酶的研究主要集中在利用其催化海因及其5′-单替代产物制备D-氨基酸, 鲜有发现具有环酰亚胺水解酶活性的D-海因酶。我们从自行分离得到的一株原始菌株假单胞菌YZ26中克隆得到了一个D-海因酶基因, 活性检测表明其同时具有环酰亚胺水解酶活性。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

Breeze 1525型高效液相色谱仪(美国Waters公司), 超纯水发生器(Millipore公司), WD-9415B型超声波清洗机(北京市六一仪器厂)。PDI(纯度99%)、α-3CP(纯度97%)、β-2CP(纯度97%)为北京百灵威公司产品。含有D-海因酶基因的工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)为本室构建保存。实验中所有用水均为超纯水。

1.2 色谱条件

色谱分离柱:HypersilTM GOLD C18 (250 mm×4.6 mm, 5 μm); 流动相:H2O-乙腈(体积比为90:10, 含0.1%(体积分数)三氟乙酸); 流速:1 mL/min; 检测波长:254 nm; 柱温为室温。

1.3 样品处理

标准溶液:精确称取一定量的PDI、α-3CP和β-2CP, 用超纯水配制成0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mmol/L的标准工作溶液。

反应液制备:工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)发酵液经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)过夜诱导后, 在9 000 r/min转速下离心10 min, 收集菌体细胞。再用H2O清洗菌体两次后将其悬浮于饱和的PDI水溶液中, 于37 ℃摇床160 r/min反应适当时间, 用12 000 r/min转速离心10 min, 取其上清进行HPLC测定。在上述条件下, 1 min内转化底物生成1 μmol产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

2 结果与讨论
2.1 标准色谱图

在1.2节色谱条件下, 取1.0 mmol/L的PDI、α-3CP、β-2CP标准溶液等体积混合后取20 μL混合液上样, 得到3种标准品的色谱图(见图 2), 其中PDI的出峰时间为5.7 min, α-3CP的出峰时间为3.0 min, β-2CP的出峰时间为3.9 min。3种化合物达到了基线分离。

图 2 PDI、α-3CP和β-2CP标准混合液的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of the standard mixture of PDI, α-3CP and β-2CP

由于PDI在缓冲溶液中很容易发生自发水解, 推测该酰胺键在PDI中不稳定, 因此在酸碱条件下容易发生自发水解, 但该自发水解无特异性, 在两个酰胺键上随机发生(见图 3)。而在水溶液中PDI、α-3CP、β-2CP都非常稳定, 因此我们选择H2O作为整个反应体系的溶剂。

图 3 PDI在50 mmol/L PBS (pH 7.5)中自发水解 Fig. 3 Autohydrolysis of PDI in 50 mmol/L PBS (pH 7.5)
2.2 工作曲线的制作

将配制好的PDI、α-3CP、β-2CP系列浓度的标准溶液经0.22 μm滤膜过滤后进行分析, 结果各标准品的峰面积Y与进样量X(μmol)的线性回归方程如下:PDI, Y=5.01×107X+4.28×104, r2=0.999 6;α-3CP, Y=4.56×107X+4.20×105, r2=0.999 4;β-2CP, Y=4.427 84×107X+4.32×105, r2=0.999 1。表明线性关系良好。

2.3 D-海因酶水解PDI的色谱分析

工程菌pET3a-hyd/BL21(DE3)经诱导后可以表达可溶性的重组D-海因酶蛋白, 能专一性地水解PDI分子吡啶2位上的酰胺键, 将其转化为α-3CP。由于PDI在水中的溶解度较低, 为了保证酶催化反应始终处于最大反应速度, 我们在转化体系中加入过量的PDI, 保证在终止反应时反应液中仍然有过量的固体PDI, 我们在1 mL转化体系中加入由相同体积发酵液收集得到的菌体细胞, 反应30 min后离心取上清液进行HPLC检测酶催化产物α-3CP的生成(见图 4), 利用标准曲线将峰面积换算成摩尔数, 测得工程菌中D-海因酶以PDI为底物时比活力为0.61 U/(mL ·10OD600 nm)。

图 4 利用重组D-海因酶催化PDI生成α-3CP Fig. 4 Generation of α-3CP by catalyzing PDI using recombinant D-hydantoinase
3 结论

通过建立HPLC快速检测方法确认我们重组表达的一种D-海因酶具有催化复杂环酰亚胺底物的能力, 能够特异性地水解底物分子两个酰胺键中的一个, 生成相应的半酰胺, 该产物还能在半酰胺酶的催化下继续转化为二羧酸[7]。如果能通过一定的物理/化学助溶方法, 或者建立新型的转化体系, 解决底物溶解度差的问题, 该方法有望用于复杂的半酰胺和二羧酸有机物分子的工业化生产。

参考文献
[1] Moriya K, Shibuya K, Hattori Y, et al. Biosci Biotech Biochem, 1993, 57(1): 127.
[2] Luc I, Spiessens M, Marc J, et al. Bull Soc Chim Belg, 1980, 89: 205.
[3] Ogawa J, Soong C L, Ito M, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2000, 54(3): 331. doi: 10.1007/s002530000400
[4] Soong C L, Ogawa J, Shimizu S. J Mol Catal B:Enzym, 2001, 12(1-6): 61. doi: 10.1016/S1381-1177(00)00204-6
[5] Huang C Y, Yang Y S. Protein Expr Purif, 2005, 40(1): 203. doi: 10.1016/j.pep.2004.12.008
[6] Soong C L, Ogawa J, Honda M, et al. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(4): 1459.
[7] Soong C L, Ogawa J, Shimizu S. Appl Environ Microbiol, 2000, 66(5): 1947. doi: 10.1128/AEM.66.5.1947-1952.2000