基于天冬氨酸的固定化金属离子亲和色谱材料用于磷酸化肽选择性富集


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	申惠莲

	卡哈尔·阿里木

申惠莲¹, 卡哈尔·阿里木²

1. 辽宁民族师范高等专科学校, 辽宁沈阳 110032;
2. 新疆农业职业技术学院, 新疆昌吉 831100

收稿日期：2017-10-20

通讯联系人：申惠莲, Tel:(024)86622204, E-mail:1055824094@qq.com

摘要：采用点击化学的方法将自然界中的天冬氨酸（aspartic acid）键合到硅球上（命名为Click Asp），并将Fe³⁺配位到Click Asp上，合成固定金属离子亲和色谱（IMAC）材料（Fe³⁺-Click Asp）；采用红外光谱、X射线电子能谱和扫描电镜等表征证明Fe³⁺-Click Asp成功合成。将此IMAC材料用于蛋白质酶解液和牛奶中的磷酸化肽的富集，实现了磷酸化肽的高选择性富集。本研究为磷酸化蛋白质组学提供了新材料和新方法。

关键词：天冬氨酸固相萃取固定化金属离子亲和色谱磷酸化肽富集

Selective enrichment of phosphopeptides with aspartic acid based immobilized metal ion affinity chromatography materials

SHEN Huilian¹, ALIMU Kahaer²

1. Liaoning National Normal College, Shenyang 110032, China;
2. Xinjiang Agricultural Vocational Technical College, Changji 831100, China

Abstract: A natural amino acid, aspartic acid, was modified to bind to silica microspheres with a click chemistry method (-Click Asp).The modified Click Asp microspheres were further modified by incorporating Fe³⁺ ions, resulting in Fe³⁺ and Click Asp based immobilized ion affinity chromatography (IMAC)(Fe³⁺-Click Asp).The prepared materials were characterized using Fourier transform infrared spectrometry, X-ray photoelectron spectrometry, and scanning electron microscopy, and it was confirmed that Fe³⁺-Click Asp was successfully prepared.Subsequently, the Fe³⁺-Click Asp microspheres were used to enrich phosphopeptides from tryptic digests of proteins and milk.It was found that the phosphopeptides could be selectively enriched with this material.This study describes a novel material and enrichment method for phosphoproteomics.

Key words: aspartic acid solid phase extraction (SPE) immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC) phosphopeptide enrichment

蛋白质的磷酸化是最普遍、最重要的翻译后修饰方式, 与信号转导、转录调节和细胞凋亡等生物学过程密切相关^[1-3]。异常的蛋白质磷酸化与肿瘤的发生、发展和转移密切相关^[4]。因此研究蛋白质磷酸化意义重大。生物样品中磷酸化肽的含量非常低; 在质谱分析磷酸化肽时, 磷酸化肽的信号受到非磷酸化肽的抑制。基于上述两个原因在质谱检测之前需要对磷酸化肽进行高效富集。用于磷酸化肽的富集方法很多, 主要包括金属氧化物亲和色谱(MOAC)^{[5, 6]}、固定化金属离子亲和色谱(IMAC)^{[7, 8]}和强阳离子交换色谱法^[9]。其中, IMAC是应用最广泛的方法之一^[10-13], 但由于IMAC在富集磷酸化肽时存在酸性肽段的非特异性干扰, 因此降低了对磷酸化肽的富集选择性。这些酸性肽段中含有多个酸性氨基酸如天冬氨酸(Asp)和谷氨酸, 如何克服这些酸性肽段的干扰是IMAC材料富集磷酸化肽所面临的问题。针对这一问题, 科研工作者从材料官能团组成和亲水性等方面做出改进, 提高了IMAC材料对磷酸化肽的选择性^[14-16]。

氨基酸是生物功能大分子蛋白质的基本组成单位。自然界里组成蛋白质的20种氨基酸中只有2种酸性氨基酸, 分别是天冬氨酸和谷氨酸。相比于谷氨酸, 天冬氨酸的酸性和亲水性更强。因此, 本文应用自然界中亲水性、酸性氨基酸Asp作为IMAC材料的连接臂, 通过点击化学的方法在硅球上键合Asp(Click Asp), 然后在此材料螯合上Fe³⁺后(Fe³⁺-Click Asp)用于磷酸化肽富集。实验结果表明, 所开发的基于Fe³⁺-Click Asp的IMAC材料能选择性富集磷酸化肽。

1 实验部分

1.1 试剂与材料

硅球(5 μm, 10 nm)、α-酪蛋白(α-casein)、牛血清白蛋白(BSA)、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(IAA)、盐酸胍、胰蛋白酶、碳酸氢铵(NH₄HCO₃)、氨水(NH₃. H₂O)、丙烯酰氯、(3-巯基丙基)、甲酸铵(NH₄FA)、甲酸(FA)、乙腈(ACN)和三甲氧基硅烷购于Sigma公司。所有溶液均用Milli-Q水配制。离心管和移液枪枪头购于Axygen公司。超纯水由美国Millipore公司Milli-Q超纯水系统制备得到。

1.2 材料的制备和表征

按照文献^[17]合成Click Asp。反应结束后, 离心弃掉上层清液, 于真空干燥箱中60 ℃干燥过夜。将真空干燥的硅球悬浮于15 mL无水乙醇中, 超声分散后, 加入0.1 g九水硝酸铁Fe(NO₃)₃·9H₂O, 室温振荡0.5 h。反应结束后, 于60 ℃干燥过夜, 制备得到Fe³⁺-Click Asp。

所合成的材料分别经如下仪器表征:日立SM-5610LV扫描电镜(SEM)(日立高新技术公司); Vertex 80v傅里叶转换红外光谱仪(德国Bruker公司); Smart Lab9 X射线衍射分析仪(美国Smart Lab公司)。

1.3 蛋白质的酶解

称取1 mg蛋白质标准品溶解于100 μL含8 mol/L尿素的50 mmol/L NH₄HCO₃缓冲液中, 加入5 μL含200 mmol/L二硫苏糖醇的25 mmol/L NH₄HCO₃缓冲液, 于56 ℃条件下孵化45 min; 加入20 μL含200 mmol/L碘代乙酰胺的25 mmol/L NH₄HCO₃缓冲液, 暗室常温反应30 min; 用25 mmol/L NH₄HCO₃缓冲液将溶液稀释至10倍体积, 并与30 μg胰蛋白酶充分混合后于37 ℃下反应9 h, 加入5 μL甲酸终止酶解反应, -80 ℃保存。

脱脂牛奶(产地德国)用3倍体积的乙腈沉淀, 离心, 弃去上清液, 保留沉淀, 用旋转离心浓缩挥去乙腈。沉淀后的蛋白质用8 mol/L尿素溶解后, 采用上述蛋白质标准品的酶解过程进行酶解。

HeLa细胞裂解液中蛋白质的提取和胰蛋白酶的酶解参照文献^[18]进行。

1.4 磷酸化肽的富集

称取2.5 mg Fe³⁺-Click Asp材料, 用30 μL ACN-H₂O-FA(50:49:1, 体积比)活化, 用30 μL ACN-H₂O-TFA(80:19.9:0.1, 体积比)平衡, 以30 μL ACN-H₂O-TFA(80:19.9:0.1, 体积比)为上样溶液, 溶解上样(样品为α-酪蛋白或者HeLa细胞裂解液的酶解物)后, 依次用30 μL ACN-H₂O-TFA (80:19.9:0.1, 体积比)、30 μL ACN-H₂O-TFA (50:49.9:0.1, 体积比)、30 μL H₂O淋洗, 再用20 μL NH₃·H₂O-H₂O(5:95, 体积比)洗脱, 然后进行质谱分析。

1.5 质谱分析和搜库

从α-酪蛋白和牛奶中富集的磷酸化肽采用纳升级ESI Q-TOF MS (美国Waters公司)进行分析; 质谱采用正离子(ESI⁺)扫描模式; 纳升级电喷雾电压为2.3 kV; 质量扫描范围为600~1 800 Da。从HeLa细胞裂解液中富集到的磷酸化肽采用液相色谱仪及LTQ-Orbitrap Velos质谱仪(美国Thermo公司)进行分析。肽段溶解在FA-H₂O (0.1:99.9, 体积比)溶液中, 上样至捕获柱(3 cm×100 μm, C18AQ色谱填料)。在纳升级的分离柱(10 cm×75 μm, C18AQ色谱填料)上进行梯度分离; 流动相A为FA-H₂O(0.1:99.9, 体积比), 流动相B为ACN-H₂O-FA(90:9.9:0.1, 体积比), 流速约为0.2 μL/min。洗脱梯度为:0~3 min, 2%B; 3~95 min, 35%B; 95~100 min, 50%B; 100~105 min, 90%B, 90%B保持5 min。

LTQ-Orbitrap Velos质谱在正离子、Survery模式下采集数据。ESI喷针电压为1.9 kV, 碰撞能量为35%。MS扫描范围为450~2 000 Da, 分辨率为6 000, 仅对丰度前15的离子进行二级碎片扫描分析。将所采集的质谱数据采用Maxquant软件转化为“*. mgf”文件, 并在Uniprot数据库中进行检索。搜库时参数设置如下:允许最多两个漏切位点; 固定修饰设定为半胱氨酸被碘代乙酰烷基化, 可变修饰为磷酸化; 磷酸化肽的score＞20, 假阳性率＜1%。

2 结果与讨论

2.1 材料的制备和表征

所合成的材料分别采用傅里叶红外光谱(FTIR)、X射线电子能谱(XPS)和SEM进行表征。从红外谱图(图 1a)可以判断3 450 cm^-1处的峰为-NH-振动峰, 3 200 cm^-1处宽而强的峰为羧基上-OH的伸缩振动, 2 980 cm^-1和2 850 cm^-1处的峰为-CH₃的对称、不对称伸缩振动且包含-CH单键的振动的峰, 1 720 cm^-1处的峰为酮上C=O的伸缩振动(饱和)峰, 1 490 cm^-1处中等强度的峰为-CH₂剪式振动, 1 440 cm^-1处的峰为羧基上C-O伸缩振动峰。XPS谱图表明所合成材料中含有C、N和Fe等元素的存在(见图 1b)。SEM谱图说明硅球的形貌在修饰前后没有发生显著变化(见图 2), 说明修饰没有破坏硅球的形貌。上述这些结果表明Fe³⁺-Click Asp被成功合成。

图 1 Fe³⁺-Click Asp的(a)红外光谱图和(b)X射线电子能谱图 Fig. 1 Images of (a) Fourier transform infrared spectrometry and (b)X-ray photo electron spectrometry of Fe³⁺-Click Asp

图 2 (a) 硅球和(b)Fe³⁺-Click Asp材料的扫描电镜图 Fig. 2 Images of (a) scanning electron microscope of silica microsphere and (b) the Fe³⁺-Click Asp materials

2.2 磷酸化肽富集方法的建立

因为Click Asp材料本身具有很好的亲水性^[17], 所以Fe³⁺-Click Asp材料对磷酸化肽的富集实验在亲水作用色谱的操作模式下进行。我们以α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液为模式样品, 首先采用酸性、高有机溶剂的上样溶液(ACN-H₂O-TFA, 80:19.9:0.1, 体积比)降低酸性非磷酸化肽的吸附, 接着降低乙腈的含量(ACN-H₂O-TFA, 50:49.9:0.1, 体积比)淋洗保留在材料上的非磷酸化肽, 最后采用NH₃·H₂O-H₂O(5:95, 体积比)洗脱保留在材料上的磷酸化肽。结果如图 3所示, 未经过Fe³⁺-Click Asp处理的α-酪蛋白酶解液的质谱图中只能鉴定到一条磷酸化肽, 大量高丰度的非磷酸化肽信号占据着整个质谱图, 如m/z 692.98(1+)、880.64(1+)和1 267.85(1+)等。同样的α-酪蛋白的酶解液经过Fe³⁺-Click Asp富集后, 高丰度的非磷酸化肽被有效去除, 使得磷酸化的信号显著提高, 能够鉴定到15条磷酸化肽(具体信息见表 1)的信号, 如m/z 733.82(2+)、830.92(2+)、976.60(2+)、964.39(2+)和1 310.01(2+)。与此相比, 采用磷酸化蛋白质组学中广泛使用的TiO₂材料, 我们只检测到10条磷酸化肽的信号。上述结果表明我们合成的Fe³⁺-Click Asp能实现磷酸化肽的选择性富集, 其对磷酸化肽的富集效果优于商品化的TiO₂材料。

图 3 α-酪蛋白的胰蛋白酶酶解液(a)处理前和经过(b)TiO₂和(c)Fe³⁺-Click Asp处理后的质谱图 Fig. 3 Mass spectra of tryptic digests of α-casein (a) before and after treatment with (b) TiO₂ and (c) Fe³⁺-Click Asp Phosphopeptides are labeled with xP. Other peaks are non-phosphorylated peptides. x indicates the number of phosphate group, and P indicates phosphate groups.

表 1 α-酪蛋白胰蛋白酶酶解液中所含磷酸化肽的详细信息 Table 1 Detailed information of phosphopeptides contained in tryptic digests of α-casein

2.3 富集复杂生物样品中的磷酸化肽

为了验证所建立的磷酸化肽富集方法在实际样品中的效果, 我们分别选取了脱脂牛奶和HeLa细胞裂解液作为分析对象。对于牛奶样品, 我们首先采用乙腈沉淀的方法从脱脂牛奶样品中得到蛋白质, 并对所得蛋白质进行酶解; 然后采用Fe³⁺-Click Asp对牛奶蛋白酶解液中的磷酸化肽进行富集。从图 4中可以看出, 富集前的牛奶蛋白质酶解液中只有一条磷酸化肽的信号; 与此相对, 经过Fe³⁺-Click Asp富集后的质谱图中能检测到17条磷酸化肽信号, 这些信号不仅包括m/z 830.89(2+)、976.48(2+)、964.18(2+)、1 339.31(2+)和1 373.79(2+)等α-酪蛋白中的磷酸化肽, 还鉴定到m/z 1 041.24(3+)、1 044.56 (3+)、1 561.44 (2+)和1 580.43 (2+)等已报道的磷酸化肽。将Fe³⁺-Click Asp用于更加复杂的HeLa细胞裂解液, 从50 μg样品中共鉴定出1 855个磷酸化位点, 这些位点来源于1 269条磷酸化肽, 方法的富集选择性为65.8%。这些实验结果表明我们合成的Fe³⁺-Click Asp材料对磷酸化肽具有较高的富集选择性。

图 4 脱脂牛奶的胰蛋白酶酶解物经过Fe³⁺-Click Asp处理(a)前、(b)后的质谱图 Fig. 4 Mass spectra of tryptic skim milk digest (a) before and (b) after enrichment with Fe³⁺-Click Asp Phosphopeptides are labeled with ★. Other peaks are non-phosphorylated peptides. X indicates the number of phosphate group, and P indicates phosphate groups.

3 结论

本文合成了一种Fe³⁺-Click Asp用于磷酸化肽的富集, 并应用红外光谱、X射线衍射电子能谱和扫描电镜对材料进行了表征, 结果表明材料合成成功。此外, 这种基于Fe³⁺-Click Asp的富集材料能实现磷酸化肽的选择性富集。本工作为磷酸化蛋白质组学的磷酸化肽富集提供了新材料和新方法。

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