色谱  2018, Vol. 36 Issue (2): 143-149   PDF    
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高洁
陈达炜
赵云峰
分散微固相萃取-超高效液相色谱-高分辨质谱法测定葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵
高洁, 陈达炜, 赵云峰     
国家食品安全风险评估中心, 卫生部食品安全风险评估重点实验室, 北京 100021
收稿日期：2017-10-17
基金项目：国家食品安全风险评估中心高层次人才队伍建设523项目
通讯联系人：陈达炜, Tel:(010)67779768, E-mail:dila2006@163.com
摘要：基于强阳离子交换填料(PCX)，采用分散微固相萃取前处理技术，结合超高效液相色谱-四级杆-静电场轨道阱高分辨质谱联用技术，建立了一种快速测定葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵的方法。通过对分散微固相萃取技术中PCX用量、洗脱溶剂中氨水的体积分数、乙腈的体积分数和洗脱体积的优化，实现了样品中多菌灵和噻菌灵的有效净化。经BEH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)色谱柱分离后，通过静电场轨道阱质谱靶向单一离子监测(targeted single ion monitoring，tSIM)结合数据依赖的二级质谱扫描(data dependent tandem mass spectrometry，ddMS2)采集模式进行定性定量分析。待测物多菌灵和噻菌灵在一定浓度范围内均呈良好线性关系，相关系数R2≥0.9999。在葡萄酒和啤酒基质中，多菌灵和噻菌灵的检出限分别为0.02和0.01 μg/L，定量限分别为0.06和0.03 μg/L。在0.1、1.0、100 μg/L 3个添加水平下，多菌灵和噻菌灵的加标回收率分别为95.6%~110.2%和87.5%~102.8%，日内精密度(RSDr)分别为1.8%~5.2%和1.3%~4.8%，日间精密度(RSDR)分别为4.3%~8.7%和4.8%~9.4%。该方法快速、简便、灵敏，适用于葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵的残留检测。
关键词：分散微固相萃取    超高效液相色谱    高分辨质谱    多菌灵    噻菌灵    葡萄酒    啤酒    
Determination of carbendazim and thiabendazole in wine and beer by ultra high performance liquid chromatography-high resolution mass spectrometry coupled with dispersive micro solid-phase extraction
GAO Jie, CHEN Dawei, ZHAO Yunfeng     
China National Centre for Food Safety Risk Assessment, Key Laboratory of Food Safety Risk Assessment, Ministry of Health, Beijing 100021, China
Foundation item: China Food Safety Talent Competency Development Initiative: China National Center for Food Safety Risk Assessment (CFSA) 523 Program
Abstract: A rapid method was established for the determination of carbendazim and thiabendazole in wine and beer by ultra high performance liquid chromatography-Q Orbitrap high resolution mass spectrometry and dispersive micro solid-phase extraction (DMSPE) based on a strong cation exchange adsorbent (PCX).For the pretreatment method, the amount of PCX, the volume percentage of acetonitrile, the volume percentage of ammonium hydroxide and the volume of eluent were optimized.The analytes were separated on a BEH C18 column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) and detected using targeted single ion monitoring-data dependent tandem mass spectrometry (tSIM-ddMS2) scan mode.The method showed a good linearity within a certain concentration ranges with correlation coefficients R2 ≥ 0.9999.The detection limits of carbendazim and thiabendazole in wine and beer were 0.02 and 0.01 μg/L, and the quantification limits were 0.06 and 0.03 μg/L.The average recoveries of carbendazim and thiabendazole at the spiked levels of 0.1, 1.0 and 100 μg/L were in the ranges of 95.6%-110.2% and 87.5%-102.8%, with intra-day precision (RSDr) ranges from 1.8%-5.2% and 1.3%-4.8%, and inter-day precision (RSDR) ranges from 4.3%-8.7% and 4.8%-9.4%.The method is rapid, simple and sensitive for the simultaneous determination of carbendazim and thiabendazole in wine and beer.
Key words: dispersive micro solid-phase extraction (DMSPE)     ultra high performance liquid chromatography (UHPLC)     high resolution mass spectrometry (HRMS)     carbendazim     thiabendazole     wine     beer    

多菌灵(carbendazim)和噻菌灵(thiabendazole)均为苯并咪唑类杀菌剂, 具有高效、低毒、广谱、内吸性等特点, 被广泛用于水果、蔬菜的病虫害防治及防腐。多菌灵能有效抑制病原菌的繁殖和生长, 是一种可疑的环境内分泌干扰物, 具有显著的生殖毒性。噻菌灵主要应用于果蔬的防腐, 已有动物实验表明其具有急性肾毒性[1]。基于这类杀菌剂对人类健康潜在的危害性, 国际食品法典委员会(CAC)、欧盟、美国、日本等组织和国家先后制定了这类杀菌剂在农产品及加工食品中的最大残留限量(MRL)[2-4]。我国在颁布的食品安全国家标准《食品中农药最大残留限量》[5]中也规定了其在蔬菜、水果、谷物、饮料等食品中的MRL, 如多菌灵在葡萄和大麦中的MRL值分别为3 mg/kg和0.5 mg/kg, 但目前尚未对葡萄酒和啤酒等酒类中的这类杀菌剂作出限量规定。

葡萄酒是用新鲜葡萄或葡萄汁经过发酵后制成的, 啤酒由麦芽发酵而成, 葡萄或麦芽在种植过程中, 为防止病虫害都有可能使用苯并咪唑类农药, 导致葡萄酒和啤酒中存在该类农药残留。目前国内外对农产品及加工食品中苯并咪唑类杀菌剂的检测方法主要有气相色谱-质谱法(GC-MS)[6]、高效液相色谱法(HPLC)[7, 8]、液相色谱-质谱法(LC-MS)[9, 10]等, 多集中在蔬菜、水果、果汁等食品基质, 针对酒类食品的研究则很少。在实际样品分析中, 样品前处理是整个分析过程中的重要一环。苯并咪唑类农药的前处理方法主要有液-液萃取法[11]、QuEChERS法[12, 13]、固相萃取法(SPE)[14, 15]、固相微萃取法[16]等。分散微固相萃取(DMSPE)技术的原理是, 将待净化提取液直接加入装有填料的离心管中, 先通过涡旋振荡等方式将目标物吸附于填料上, 后用解吸附溶剂进行洗脱, 从而起到净化的作用[17]。DMSPE技术相较于传统的SPE技术, 无需繁琐的淋洗、平衡和浓缩等过程, 具有耗时短、消耗溶剂少和价格低廉等特点。该技术尤其适用于含水基质, 如环境水、酒类或饮料, 石墨烯、碳纳米管和磁性材料是该技术最为常用的吸附填料[18-20]。强阳离子交换填料(PCX)作为一种高分子聚合填料, 带有磺酸根官能基团, 对碱性物质具有较佳的吸附作用, 已在SPE中广泛应用[21]。

本研究基于多菌灵和噻菌灵弱碱性的结构特征, 选取PCX作为吸附剂, 采用DMSPE技术对葡萄酒和啤酒样品进行前处理, 结合超高效液相色谱-高分辨质谱(UHPLC-HRMS)技术, 建立了快速测定葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵的方法。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱系统(Q Exactive, 美国Thermo-Fisher公司); 涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)。

多菌灵、噻菌灵和多菌灵-d4标准品(纯度＞98.0%, Dr.Ehrenstorfer公司); 乙腈(色谱纯, 美国Fisher Scientific公司); 甲酸和甲酸铵(HPLC级, 美国Tedia公司); 氨水(HPLC级, 上海安谱公司); 实验用水为超纯水, 由美国Millipore公司纯水仪制备。

阳离子交换聚合填料(PCX, 天津博纳艾杰尔公司)。

1.2 标准溶液的配制

准确称取多菌灵、噻菌灵及多菌灵-d4标准品10 mg(精确至0.1 mg)于10 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配成1 000 mg/L的标准储备溶液, 于-20 ℃储存。用甲醇稀释多菌灵和噻菌灵标准储备溶液, 配制成10 mg/L和1 mg/L的混合标准工作液, 于-4 ℃储存。用甲醇稀释多菌灵-d4标准储备溶液, 配制成1 mg/L的内标工作液, 于-4 ℃储存。

1.3 样品处理

啤酒样品预先通过超声处理30 min后, 准确吸取酒类样品1.0 mL于装有15 mg PCX填料的2 mL离心管中(含内标多菌灵-d4 2 μg/L), 涡旋混匀30 s后, 将其转移至带有0.22 μm微孔滤膜的1 mL针头注射器中过滤, 弃去滤液, 目标物则吸附于PCX填料上, 保留在0.22 μm微孔滤膜上; PCX填料使用注射器进一步用1 mL乙腈淋洗后, 用2.0 mL 5%(体积分数)氨水乙腈-水(4:6, v/v)洗脱, 收集洗脱液, 供仪器分析。

1.4 仪器分析条件

色谱条件:BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm)。流动相A为水, 含0.1%(体积分数)甲酸和5 mmol/L甲酸铵, B为甲醇, 含0.1%(体积分数)甲酸和5 mmol/L甲酸铵。梯度洗脱:0~2.0 min, 20%B; 2.0~3.0 min, 20%B~30%B; 3.0~3.5 min, 30%B~90%B; 3.5~5.5 min, 90%B~20%B。进样量:5 μL; 流速:200 μL/min; 柱温:40 ℃。

质谱条件:采用加热电喷雾离子化(heated electrospray ionization, HESI)方式; 喷雾电压3.5 kV; 毛细管温度320 ℃; 加热器温度300 ℃; 鞘气40 arb, 辅助气10 arb; 正离子采集模式, 定量扫描模式为靶向单一离子监测(targeted single ion monitoring, tSIM), 分辨率为70 000 FWHM, 扫描宽度为4 Da, 定性二级质谱扫描模式为数据依赖的二级质谱扫描(data dependent tandem mass spectrometry, ddMS2), 分辨率为17 500 FWHM, 归一化碰撞能量(normalized collision energy, NCE)为60%。

2 结果与讨论
2.1 质谱采集模式的选择

本研究比较了Q Exactive HRMS中3种定量扫描模式, 包括全扫描(full scan, FS)、tSIM和平行反应监测(parallel reaction monitoring, PRM)。其中FS和tSIM模式是以化合物的精确母离子进行定量, 而PRM模式是先在一级质谱中选择性地提取目标化合物的母离子, 而后经过高能量碰撞池对母离子进行碎片裂解, 在二级质谱中监测该母离子的所有碎片, 以精确二级碎片离子进行定量分析。采用直接进样方式, 对质量浓度为0.1 μg/L的多菌灵和噻菌灵混合标准溶液分别采用以上3种模式进行扫描分析, 发现目标化合物多菌灵和噻菌灵在tSIM和PRM模式下的分析性能均较FS模式更高, 信噪比(S/N)约为FS模式的4倍(见图 1a), 这主要是由于tSIM较FS模式具有更窄的质量扫描宽度(4 Da), 从而产生较低的背景噪音, 而PRM模式则是通过二级质谱碎裂降低背景噪音, 但tSIM操作较PRM模式简单, 无需进行参数优化。因此, 最终选择tSIM模式对目标化合物进行定量分析。目标化合物的定性确证, 通过ddMS2模式对母离子进行二级质谱碎裂, 在60%的NCE能量下获取二级质谱碎片谱图, 目标化合物的二级质谱碎片离子信息见表 1, 图 1b为多菌灵的二级质谱碎片离子图。

图 1 (a) 多菌灵(0.1 μg/L)在3种不同质谱采集模式下、噻菌灵(0.1 μg/L)在tSIM模式下的提取离子色谱图和(b)多菌灵的碎片离子质谱图 Fig. 1 (a) Exactive ion chromatograms of carbendazim (0.1 μg/L) in three different acquistion modes, thiabendazole (0.1 μg/L) in tSIM mode and (b) fragment mass spectrum from carbendazim FS: full scan; PRM: parallel reaction monitoring; tSIM: targeted single ion monitoring.

表 1 分析物的保留时间和质谱信息 Table 1 Retention times and mass spectrometric information of the analytes
2.2 样品前处理方法的选择与优化

根据目标化合物多菌灵和噻菌灵弱碱性的结构特征, 选取带有磺酸根官能基团的强阳离子交换填料作为DMSPE前处理的吸附填料, 通过涡旋振荡对目标化合物进行选择性吸附; 氨水乙腈-水溶液则可作为解吸附溶剂, 将目标化合物从PCX填料上洗脱, 从而达到提取与净化样品的目的。

对于DMSPE前处理技术, 吸附填料PCX的用量、洗脱溶剂中氨水的体积分数、乙腈的体积分数和洗脱体积是影响提取效率的主要因素。在前期研究[17]中发现，PCX在对碱性物质的吸附过程较快, 仅短短30 s即可达到吸附平衡。因此, 本研究针对上述参数进行优化, 以回收率为考核指标, 在空白葡萄酒50 μg/L的加标水平下, 分别对PCX用量(5~30 mg)、氨水的体积分数(1%~10%)、洗脱溶剂中乙腈的体积分数(30%~100%)和洗脱体积(1.0~3.0 mL)进行考察, 结果如图 2所示。图 2a显示, 随着PCX用量的增加(5~15 mg), 多菌灵和噻菌灵的吸附效应不断增加, 当用量达到20 mg及以上, 吸附效应达到平衡, 说明高表面比的PCX填料具有较高的吸附性能, 故本实验采用PCX的用量为15 mg。在一定浓度的氨水洗脱剂下, 吸附于PCX填料上的碱性目标物易从PCX填料上解吸附下来。图 2b显示, 洗脱溶剂中氨水的体积分数为5%时, 洗脱效果达到最佳。乙腈具有较强的洗脱能力, 但高比例的乙腈也会将弱极性杂质洗脱下来, 本研究考察不同体积分数的乙腈对目标物的洗脱能力。图 2c显示, 乙腈体积分数为40%时，含5%(体积分数)氨水的乙腈水溶液可以将目标物洗脱, 同时无溶剂效应存在, 而乙腈的体积分数为50%时存在一定的溶剂效应, 100%时则溶剂效应明显。因此最终选择5%(体积分数)氨水乙腈-水(4:6, v/v)进行洗脱。洗脱溶剂的体积将直接影响分析目标物的回收效率, 图 2d显示, 2.0 mL的洗脱溶剂可以将目标化合物多菌灵和噻菌灵完全洗脱。综上分析, 本研究采用15 mg PCX吸附多菌灵和噻菌灵, 用2.0 mL 5%(体积分数)氨水乙腈-水(4:6, v/v)进行洗脱。

图 2 (a) PCX填料用量、(b)氨水的体积分数、(c)乙腈的体积分数和(d)洗脱体积对多菌灵和噻菌灵提取效率的影响 Fig. 2 Effects of (a) the amount of a strong cation exchangeadsorbent (PCX), (b) the volume percentage of ammonium hydroxide, (c) the volume percentage of acetonitrile, and (d) the desorption solvent volume on extraction efficiencies of carbendazim and thiabendazole
2.3 基质效应的考察

用5%(体积分数)氨水乙腈-水(4:6, v/v)配制多菌灵和噻菌灵的系列混合标准溶液。同时, 按照1.3节中前处理方法, 用空白葡萄酒和啤酒样品制备空白葡萄酒和啤酒基质溶液, 用空白基质溶液配制同浓度水平的系列基质匹配标准溶液。通常以基质匹配标准曲线的斜率与纯溶剂配制标准曲线的斜率之比来评价基质效应, 比值越接近1.0, 说明基质效应越弱。实验结果显示, 多菌灵在葡萄酒和啤酒样品中的曲线斜率比值分别为0.96±0.01和1.01±0.02 (n=3), 噻菌灵的斜率比值分别为0.94±0.03和0.98±0.01 (n=3), 说明多菌灵和噻菌灵在葡萄酒和啤酒样品中不存在明显的基质效应, 本方法净化效果良好。

2.4 定量方法学考察
2.4.1 线性范围、检出限与定量限

配制多菌灵和噻菌灵的系列混合标准溶液, 质量浓度范围为0.01~50 μg/L, 内标法定量, 内标多菌灵-d4的质量浓度为1 μg/L。将标准溶液注入仪器中, 以标准溶液质量浓度为横坐标, 多菌灵、噻菌灵分别与多菌灵-d4提取母离子的色谱峰峰面积比值为纵坐标, 绘制标准曲线。结果表明, 多菌灵和噻菌灵在表 2所列的质量浓度范围内均呈良好的线性关系, 相关系数R2≥0.999 9。对空白葡萄酒和啤酒样品分别进行低水平加标试验, 按已建立的方法测定。以3倍信噪比对应的加标水平为检出限, 10倍信噪比对应的加标水平为定量限, 结果显示葡萄酒和啤酒具有相同的检出限和定量限, 具体结果见表 2。从结果看, 能够满足酒类样品中多菌灵和噻菌灵残留检测的要求。

表 2 分析物的线性关系、检出限及定量限 Table 2 Linear relationships, LODs and LOQs of the analytes
2.4.2 准确度和精密度

分别取空白葡萄酒和空白啤酒进行加标回收试验, 加标水平为0.1、1.0和100 μg/L, 每个水平制备6份平行样品, 并连续进样5天。以空白酒类样品加标的回收率表示方法的准确度; 以同一天6份平行样品测定结果的相对标准偏差作为日内精密度(RSDr), 而连续5天样品测定结果的相对标准偏差作为日间精密度(RSDR)。按照1.3节方法处理, 结果见表 3。多菌灵和噻菌灵在葡萄酒样品中的回收率分别为95.6%~109.4%和87.5%~94.9%, 日内精密度分别为1.8%~5.2%和2.3%~4.8%, 日间精密度分别为4.3%~8.6%和5.9%~9.3%;在啤酒样品中的回收率分别为98.5%~110.2%和90.7%~102.8%, 日内精密度分别为2.7%~4.2%和1.3%~3.7%, 日间精密度分别为5.7%~8.7%和4.8%~9.4%。表明本方法的准确度和精密度良好。

表 3 不同添加水平下的回收率和精密度 Table 3 Recoveries and precisions at different spiked levels
2.5 实际样品的测定

采用已建立的方法对市售的51份葡萄酒样品(W1~W51)和33份啤酒样品(B1~B33)进行了检测, 结果见表 4。其中, 葡萄酒中均检出多菌灵, 检出含量为0.09~633.81 μg/L, 平均值为56.20 μg/L, 中位数为26.24 μg/L, 含量大于100 μg/L的占有比为13.7%;葡萄酒中噻菌灵的检出率为9.8%, 含量范围为ND~0.74 μg/L。啤酒中多菌灵检出含量较低(低于1 μg/L), 范围为ND~0.63 μg/L, 而噻菌灵则未检出。阳性葡萄酒和啤酒样品中检出多菌灵的色谱图见图 3。上述结果表明, 本方法灵敏度高, 样品处理快捷简便, 净化效果好, 适用于葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵残留的快速分析测定。

表 4 葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵的测定结果 Table 4 Results of the determination of carbendazim and thiabendazole in wine and beer

图 3 tSIM模式下阳性样品中多菌灵的提取离子色谱图 Fig. 3 Exactive ion chromatograms of carbendazim in tSIM mode for positive samples a.wine (sample No.W8, 47.17 μg/L); b.beer (sample No.B8, 0.15 μg/L).
3 结论

本研究基于PCX填料的分散微固相萃取技术与同位素稀释的高效液相色谱-高分辨质谱联用技术, 建立了同时测定葡萄酒和啤酒中多菌灵和噻菌灵残留量的方法。该方法样品前处理时间短, 每个样品仅耗时3 min, 操作简单、成本低、有机溶剂消耗少, 同时净化效果良好, 灵敏度高, 准确度及精密度均能满足酒类中农药残留检测的要求, 为我国酒类食品的常规监测和监管提供了可靠的技术手段。

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