亲水相互作用色谱-串联质谱法测定液体食品中14种甜味剂


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	范广宇

	冯峰

	张峰

	高飞

	李晓明

	梁振纲

范广宇^1,2, 冯峰¹, 张峰¹, 高飞¹, 李晓明³, 梁振纲⁴

1. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176;
2. 连云港出入境检验检疫局, 江苏连云港 222042;
3. 济南出入境检验检疫局, 山东济南 250014;
4. 海南出入境检验检疫局技术中心, 海南海口 570311

收稿日期：2017-10-24

基金项目：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金项目（2016JK028）；贵州茅台酒股份有限公司研发项目（2016010）

通讯联系人：张峰, Tel:(010)53898008, E-mail:fengzhang@126.com

摘要：建立了亲水相互作用色谱-三重四极杆质谱（HILIC-MS/MS）同时测定液体食品中6种人工合成甜味剂和8种甜菊糖苷类天然甜味剂的分析方法。样品经Waters Xbridge Amide色谱柱（150 mm×5.0 mm，3.5 μm）分离，以乙腈-10 mmol/L甲酸铵溶液（65：35，v/v）为流动相，流速为0.4 mL/min，柱温为35℃，然后以电喷雾电离（ESI）源，在多反应监测（MRM）、负离子模式下进行三重四极杆质谱检测。14种甜味剂在各自的范围内线性关系良好，相关系数均大于0.995，检出限为0.03~0.7 mg/kg，定量限为0.1~2.2 mg/kg。在2、5和20 mg/kg添加水平下，14种甜味剂的平均回收率为80.8%~108.7%，相对标准偏差为1.5%~7.7%（n=6）。该方法样品前处理操作简单，准确度高，灵敏度高，可用于液体食品中14种甜味剂的同时测定。

关键词：亲水相互作用色谱三重四极杆质谱人工合成甜味剂甜菊糖苷液体食品

Determination of 14 sweeteners in liquid foods by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry

FAN Guangyu^1,2, FENG Feng¹, ZHANG Feng¹, GAO Fei¹, LI Xiaoming³, LIANG Zhengang⁴

1. Institute of Food Safety, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;
2. Lianyungang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Lianyungang 222042, China;
3. Jinan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Jinan 250014, China;
4. Technology Center of Hainan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Haikou 570311, China

Foundation item: Fundamental Research Fund of Central Public Welfare Research Institution (No. 2016JK028); Research and Development Project of Kweichow Moutai Co., Ltd. (No. 2016010)

Abstract: A method for the simultaneous determination of six artificial sweeteners and eight steviol glycosides in liquid food samples by hydrophilic interaction liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HILIC-MS/MS) was developed.The sweeteners in the samples were separated by a Waters Xbridge Amide column (150 mm×5.0 mm, 3.5 μm) at 35℃, and eluted with acetonitrile-10 mmol/L ammonium formate (65:35, v/v) at a flow rate of 0.4 mL/min.Then, the analytes were detected using an electrospray ion source in negative mode (ESI^-) under multiple reaction monitoring (MRM) mode.Good linear relationships were obtained, and the correlation coefficients (r²) of the 14 sweeteners were greater than 0.995.The limits of detection (LODs, S/N=3) and the limits of quantification (LOQs, S/N=10) ranged from 0.03 to 0.7 mg/kg and 0.1 to 2.2 mg/kg, respectively.The average recoveries varied from 80.8% to 108.7% at spiked levels of 2, 5 and 20 mg/kg, and the relative standard deviations (RSDs) ranged from 1.5% to 7.7%(n=6).The proposed method is simple, accurate and sensitive for the simultaneous determination of the 14 sweeteners in liquid food samples.

Key words: hydrophilic interaction liquid chromatography (HILIC) triple quadrupole mass spectrometry artificial sweeteners steviol glycosides liquid food

甜味剂是指能够赋予食品甜味的一类食品添加剂, 分为人工甜味剂和天然甜味剂。人工甜味剂因为成本低、甜度高已在食品加工中被广泛应用, 但长期过量食用人工合成甜味剂存在一定的安全风险, 因而天然甜味剂受到人们的日益关注^{[1, 2]}。甜菊糖苷是从甜叶菊(Stevia Rebaudiana (Bertoni) Hemsl.)叶子中提取出的一类天然甜味剂, 其中含量比例最高的为甜菊苷(stevioside)和瑞鲍迪苷A(rebaudioside A), 此外还包括其他结构类似物。瑞鲍迪苷A的甜度是蔗糖的450倍, 而甜菊苷带苦味^[3]。我国《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》中规定了甜味剂的使用范围和限量^[4]。但在实际生产中存在违法添加甜味剂或者过量使用甜味剂的情况, 因此亟须建立高通量、快速、灵敏的方法以检测食品中的甜味剂。

食品中甜味剂的检测方法主要有毛细管电泳法^[5-7]、液相色谱法^[8-11]和液相色谱-串联质谱法等^[12-19]。毛细管电泳法目前在甜味剂检测中应用不多, 不能满足多种甜味剂同时检测的需求; 液相色谱法灵敏度低且容易受到基质干扰; 液相色谱-串联质谱法因具有强大的定性定量能力而被越来越多地应用于甜味剂的检测中。目前, 分离甜味剂多采用反相色谱法, 但其存在分离效果不理想、需要在有机相中加入缓冲盐和分离时间较长等问题。亲水相互作用色谱(HILIC)是一种特殊的液相色谱分离模式, 采用的是极性固定相和有机相含量较高的含水流动相。亲水相互作用色谱可以保留在反相色谱中不保留或洗脱过快的强极性物质，也因流动相中有机溶剂含量高使得柱压不会过高, 从而可以改善某些极性物质的峰形, 因此亲水相互作用色谱更适合用于分离极性物质^[20]。本研究建立了亲水相互作用色谱-三重四极杆质谱快速、准确检测饮料和白酒中6种人工合成甜味剂和8种甜菊糖苷类甜味剂的方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1200高效液相色谱仪, 配备自动进样器、柱温箱(美国Agilent公司); API5000三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司); Analyst工作站; XP 105分析天平(瑞士Mettler公司); A10 Milli-Q超纯水机(美国Millipore公司)。

甜蜜素(sodium cyclamate)、安赛蜜(acesulfame potassium)、糖精钠(sodium saccharin)、三氯蔗糖(sucralose)、阿斯巴甜(aspartame)和纽甜(neotame)均购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 甜菊苷、瑞鲍迪苷B(rebaudioside B)、瑞鲍迪苷D(rebaudioside D)、瑞鲍迪苷F(rebaudioside F)、杜克苷A(dulcoside A)均购自美国ChromaDex公司; 瑞鲍迪苷A、瑞鲍迪苷C(rebaudioside C)和甜菊双糖苷(steviolbioside)均购自北京百灵威公司。甲醇、乙腈(色谱纯)和甲酸铵(优级纯)购自美国Fisher公司。饮料和白酒样品均购自超市和电商平台。

1.2 标准溶液的制备

准确称取适量标准品, 分别用水溶解并配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液, 于4 ℃储存。分别移取14种甜味剂标准储备液, 用乙腈-水(70:30, v/v)定容, 配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准溶液, 于4 ℃储存; 使用时根据需要用乙腈-水(70:30, v/v)稀释至所需浓度。

1.3 样品制备

准确称取1 g样品, 用水稀释至100 mL, 过0.22 μm滤膜后上机测定。

1.4 色谱条件

色谱柱:Waters XBridge Amide色谱柱(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm); 柱温:35 ℃; 流动相:乙腈-10 mmol/L甲酸铵(65:35, v/v); 等度洗脱; 流速:0.4 mL/min; 进样体积:5 μL。

1.5 质谱条件

离子源为电喷雾电离(ESI)源; 多反应监测(MRM)、负离子模式; 实验所用的气体均为高纯氮气; 碰撞气(CAD)压力为5 kPa; 气帘气(CUR)压力为25 kPa; 雾化气(GS1)压力为55 kPa; 辅助气(GS2)压力为60 kPa; 电喷雾电压(IS)为-4.5 kV; 去溶剂温度(TEM)为500 ℃; 入口电压(EP)为-10 V; 碰撞室出口电压(CXP)为-15 V。14种甜味剂的保留时间、监测离子对、碰撞电压(CE)和去簇电压(DP)见表 1。

表 1 14种甜味剂的保留时间、监测离子对、碰撞电压和去簇电压 Table 1 Retention times, monitoring ion pairs, collision energies (CE) and declustering potentials (DP) of the 14 sweeteners

No.	Compound	Retention time/min	Monitoring ion pair	CE/V	DP/V
1	acesulfame potassium	3.93	162.0＞82.0^*	-23	-60
			162.0＞78.0	-42	-60
2	sodium saccharin	4.07	181.9＞62.0^*	-32	-82
			181.9＞105.8	-27	-82
3	neotame	4.44	377.5＞200.2^*	-26	-120
			377.5＞345.2	-17	-120
4	sodium cyclamate	4.64	178.0＞80.0^*	-44	-120
			178.0＞96.1	-33	-120
5	sucralose	4.97	395.3＞359.4^*	-14	-108
			397.3＞361.5	-19	-108
6	steviolbioside	5.66	641.8＞479.7^*	-62	-45
			641.8＞317.4	-65	-45
7	aspartame	5.77	293.1＞200.2^*	-25	-108
			293.1＞261.4	-13	-108
8	dulcoside A	6.24	787.7＞625.6^*	-19	-150
			787.7＞479.6	-75	-150
9	rebaudioside B	6.43	803.8＞642.0^*	-60	-154
			803.8＞479.8	-77	-154
10	stevioside	7.04	803.8＞641.8^*	-25	-150
			803.8＞479.8	-75	-150
11	rebaudioside C	7.31	949.5＞787.8^*	-48	-144
			949.5＞626.0	-81	-144
12	rebaudioside F	7.54	935.5＞774.0^*	-57	-110
			935.5＞641.7	-79	-110
13	rebaudioside A	8.35	965.6＞804.0^*	-35	-140
			965.6＞641.7	-76	-140
14	rebaudioside D	12.22	1127.7＞803.9^*	-70	-140
			1127.7＞641.9	-89	-140
* Quantitative ion.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

本研究比较了正离子和负离子模式下各物质的响应值, 发现在负离子模式下目标物的响应值明显优于正离子模式。除三氯蔗糖外, 其他物质均选择准分子离子作为母离子, 然后选择两个子离子组成两个监测离子对, 并对DP和CE进行优化。当三氯蔗糖以[M-H]^- (m/z 395.3)的准分子离子为母离子进行子离子扫描时, 逐渐增加CE值也只能得到一个丰度较大的子离子(m/z 359.3), 即准分子离子再失去一分子HCl后得到的碎片。由于三氯蔗糖结构中含有3个氯原子, 根据天然同位素分布规律, [M+2-H]^- (m/z 397.3)的同位素离子丰度与准分子离子丰度相当, 所以选择m/z 397.3＞361.5作为另一个监测离子对。优化后的质谱参数见表 1。

2.2 色谱条件的优化

2.2.1 色谱柱的选择

目前报道^[14-18]的甜味剂的检测方法多使用C18色谱柱进行分离, 但由于天然甜味剂的极性较强, 在C18色谱柱上的保留效果并不好。因此本研究比较了Agilent ZORBAX SB-C18(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)和Waters XBridge Amide(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)两种色谱柱对甜味剂的分离效果。结果表明, 当使用Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱时, 甜菊糖苷类甜味剂的保留效果和峰形均较差; 当使用Waters XBridge Amide色谱柱进行分离时, 14种甜味剂的分离度和峰形均较好, 推测原因是Waters XBridge Amide色谱柱引入了酰胺基, 使得其对强极性化合物有更强的保留能力。因此本实验最终选择Waters XBridge Amide色谱柱。

2.2.2 流动相的选择

本研究还对流动相进行了考察和优化。结果表明, 流动相中有机相为乙腈时比为甲醇时能获得更好的分离度和灵敏度。分别考察了采用不同无机相(10 mmol/L甲酸铵水溶液、10 mmol/L乙酸铵水溶液、0.1%(体积分数)甲酸水溶液和超纯水)时14种甜味剂的分离效果。当采用0.1%(体积分数)甲酸水溶液和超纯水时, 14种甜味剂的色谱峰较宽, 且峰拖尾严重; 采用10 mmol/L甲酸铵水溶液和10 mmol/L乙酸铵水溶液时, 大部分甜味剂的峰高相当, 但信噪比前者明显高于后者(见图 1)。因此本研究最终选择乙腈-10 mmol/L甲酸铵水溶液作为流动相进行分离。

图 1 无机相中甲酸铵和乙酸铵对14种甜味剂峰高和信噪比的影响 Fig. 1 Effect of ammonium formate and ammonium acetate in inorganic phase on peak heights and S/N of the 14 sweeteners Nos. 1-14 are the same as that in Table 1.

在优化的条件下, 14种甜味剂的提取离子色谱图见图 2。可以看出, 在甜菊双糖苷的提取离子色谱图中有一强度相当的峰, 保留时间为6.76 min, 与甜菊苷的保留时间一致, 通过对比二者的结构可知, 甜菊苷由甜菊双糖苷结构上的羧基与β-Glc基团缩合而来, 故其在质谱电离时也容易丢失β-Glc基团, 产生的碎片离子(m/z 641.8)进一步解离成m/z为479.7的碎片离子, 产生与甜菊双糖苷峰高相当的峰。类似的情况还有瑞鲍迪苷B，其提取离子色谱图中有与瑞鲍迪苷A保留时间一致的色谱峰。

图 2 14种甜味剂定量离子对的提取离子色谱图 Fig. 2 Extract ion chromatograms of the quantitative ion pairs of the 14 sweeteners

2.3 方法学评价

2.3.1 线性关系、检出限和定量限

在优化的条件下, 配制14种甜味剂的系列混合标准溶液(1~1 000 μg/L), 以峰面积(Y)为纵坐标、质量浓度(X, μg/L)为横坐标绘制标准曲线, 得到的线性回归方程和相关系数(r²)见表 2。根据3倍和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 结果见表 2。可以看出, 14种甜味剂在各自的范围内线性关系良好, 相关系数均大于0.995。

表 2 14种甜味剂的线性范围、回归方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear ranges, regression equations, correlation coefficients (r²), limits of detection and limits of quantification of the 14 sweeteners

No.	Linear range/(μg/L)	Regression equation	r²	LOD/(mg/kg)	LOQ/(mg/kg)
1	1-200	y=1.28×10⁵X+4.33×10⁶	0.9965	0.03	0.1
2	1-500	y=2.28×10³X+6.69×10⁴	0.9972	0.2	0.5
3	1-500	y=1.40×10⁵X+1.21×10⁶	0.9971	0.03	0.1
4	1-1000	y=1.27×10⁴X+5.86×10⁵	0.9955	0.03	0.1
5	10-1000	y=7.12×10²X+4.82×10³	0.9997	0.7	2.1
6	10-1000	y=2.94×10²X-1.69×10³	0.9999	0.7	2.2
7	1-1000	y=8.24×10³X+8.99×10⁴	0.9993	0.03	0.1
8	10-1000	y=7.29×10²X+5.78×10³	0.9987	0.3	1.0
9	10-1000	y=3.24×10²X+8.83×10²	0.9961	0.7	2.1
10	10-1000	y=3.50×10²X-2.74×10³	0.9997	0.7	2.2
11	10-1000	y=6.39×10³X+7.80×10⁴	0.9995	0.2	0.5
12	10-1000	y=4.71×10³X+4.74×10⁴	0.9996	0.2	0.5
13	10-1000	y=2.05×10³X+1.33×10³	0.9999	0.3	1.0
14	10-1000	y=3.22×10³X-1.13×10³	0.9998	0.3	1.1
Nos. 1-14 are the same as that in Table 1. Y: peak area; X: mass concentration, μg/L.

2.3.2 精密度与回收率

在空白饮料样品中添加2、5和20 mg/kg 3个水平的混合标准溶液, 经1.3节所述方法处理后, 每个水平重复测定6次, 得到方法的回收率和精密度, 结果见表 3。3个添加水平下14种甜味剂的平均回收率为80.8%~108.7%, 相对标准偏差为1.5%~7.7%(n=6)。

表 3 14种甜味剂的回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and precisions of the 14 sweeteners (n=6)

Compound	2 mg/kg		5 mg/kg		10 mg/kg
Compound	Recovery/%	RSD/%	Recovery/%	RSD/%	Recovery/%	RSD/%
Acesulfame potassium	90.7	7.3	100.6	6.3	92.9	2.7
Sodium saccharin	80.9	7.1	92.3	5.6	98.0	3.5
Neotame	82.2	2.3	89.5	2.7	96.3	2.3
Sodium cyclamate	87.2	5.8	90.5	2.4	90.3	3.0
Sucralose	96.4	7.3	97.1	7.7	94.8	2.8
Steviolbioside	104.7	6.9	95.3	6.4	94.2	6.1
Aspartame	80.8	4.2	84.7	2.4	91.9	2.0
Dulcoside A	107.3	7.3	97.2	7.4	89.7	6.9
Rebaudioside B	108.7	4.0	96.7	5.4	103.4	5.6
Stevioside	82.3	7.3	93.4	7.3	103.7	7.1
Rebaudioside C	97.6	6.6	84.9	6.7	88.3	2.6
Rebaudioside F	95.9	2.4	86.0	3.2	85.3	1.9
Rebaudioside A	107.5	3.1	97.7	3.5	94.6	3.6
Rebaudioside D	107.9	1.5	97.6	2.9	96.1	1.6

表 3 14种甜味剂的回收率和精密度(n=6) Table 3 Recoveries and precisions of the 14 sweeteners (n=6)

2.4 实际样品测定

将方法应用于市场上购买的8种饮料和2种白酒中甜味剂的检测, 有3种饮料样品中有甜味剂的检出, 其中1种饮料中检出人工合成甜味剂三氯蔗糖, 2种饮料中有天然甜味剂的检出, 含量均符合GB 2760-2014的要求, 详细结果见表 4。

表 4 实际样品的测定结果 Table 4 Detected results of the real samples

3 结论

本研究建立了亲水相互作用色谱-三重四极杆质谱检测饮料和白酒中14种甜味剂的分析方法。该方法样品前处理简单, 分析速度快, 精密度和灵敏度高, 能够同时测定饮料和白酒等液体食品中14种甜味剂。该方法有望在食品甜味剂的检测中发挥重要作用。

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