超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱法检测柑橘中螺虫乙酯及其4种代谢产物


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徐诚^1,2, 张圣虎², 张毅², 浦跃朴¹, 尹立红¹, 张娟¹, 宋宁慧²

1. 东南大学公共卫生学院, 教育部环境医学工程重点实验室, 江苏南京 210000;
2. 环境保护部南京环境科学研究所, 江苏南京 210042

收稿日期：2017-10-27

基金项目：环境医学工程教育部重点实验室开放课题项目（2017EME001）

通讯联系人：宋宁慧, Tel:(025)85287140, E-mail:snh@nies.org

摘要：建立了超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱定量检测柑橘中螺虫乙酯及其4种代谢产物残留的分析方法。样品以QuEChERS技术为前处理方法进行净化、浓缩，在电喷雾电离（ESI）源、正离子模式下，采用MRM监测模式分析，以基质匹配外标法定量。螺虫乙酯及其4种代谢产物在2~1000 μg/L线性范围内具有良好的线性关系，相关系数（R²）>0.99；方法的检出限（LOD）为0.08~0.49 μg/kg，定量限（LOQ）为0.26~1.62 μg/kg；空白样品添加回收率为94.0%~98.7%，相对标准偏差为1.1%~5.3%。田间试验结果表明，在施药最高推荐量60 mg/kg（有效成分）下，柑橘果肉、果皮、全果样品中螺虫乙酯及其4种代谢产物残留总量分别为5.93~14.20、11.30~17.86和1.30~16.51 μg/kg，残留量均低于国家标准最大残留限量值1.00 mg/kg。该方法操作简便，快速准确，灵敏度高，分离效果好，能够有效降低基质干扰效应，准确度与精密度均能达到定量分析要求，适用于柑橘中螺虫乙酯及其代谢产物残留的定性定量检测。

关键词：超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱 QuEChERS 螺虫乙酯及其代谢产物柑橘

Determination of spirotetramat and its four metabolites in citrus by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-ion trap mass spectrometry

XU Cheng^1,2, ZHANG Shenghu², ZHANG Yi², PU Yuepu¹, YIN Lihong¹, ZHANG Juan¹, SONG Ninghui²

1. Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering of Ministry of Education, School of Public Health, Southeast University, Nanjing 210000, China;
2. Nanjing Institute of Environmental Sciences, Ministry of Environmental Protection, Nanjing 210042, China

Foundation item: Ministry of Education Key Laboratory of Environmental Medicine Engineering Open Project Fund (No. 2017EME001)

Abstract: A method for the simultaneous determination of spirotetramat and its four metabolites in citrus was developed by ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-ion trap mass spectrometry (UPLC-Q TRAP MS).The samples were extracted with acetonitrile and purified by QuEChERS pretreatment.The extracts were detected using an electrospray ionization (ESI) positive ion source under multiple reaction monitoring (MRM) mode, and quantified by matrix matching external standard method.The results showed that spirotetramat and its four metabolites had good linearities in the range of 2-1000 μg/L with correlation coefficients (R²) greater than 0.99.The limits of detection (LODs) of spirotetramat and its four metabolites were in the range of 0.08 to 0.49 μg/kg, while the limits of quantification (LOQ) were in the range of 0.26 to 1.62 μg/kg.The average spiked recoveries were in the range of 94.0% to 98.70%, and the relative standard deviations were 1.1%-5.3%.The results from field trials showed that the contents of the final residues of spirotetramat and its four metabolites in the flesh, peel and whole fruit samples were 5.93-14.20, 11.30-17.86 and 1.30-16.51 μg/kg with the highest recommended dose of 60 mg/kg (active ingredient).The residues in harvested citrus were lower than the national standard maximum residue limit (1.00 mg/kg).The method is simple, rapid and accurate, with a high sensitivity and good separation effect, and the effect of matrix interference can be effectively reduced.The accuracy and precision of this method can meet the requirements of quantitative analysis.The method is suitable for the qualitative and quantitative detection of spirotetramat and its four metabolites in citrus.

Key words: ultra-high performance liquid chromatography-triple quadrupole-ion trap mass spectrometry (UPLC-Q TRAP MS) QuEChERS spirotetramat and its metabolites citrus

螺虫乙酯(spirotetramat, S)是德国Bayer公司开发的一种新型特窗酸类杀虫剂, 属于季酮酸类化合物, 化学名称为4-(乙氧基羰基氧基)-8-甲氧基-3-(2, 5-二甲苯基)-1-氮杂螺^{[4, 5]}-癸-3-烯-2-酮, 分子式为C₂₁H₂₇NO₅。螺虫乙酯作为杀虫剂的作用机理是通过干扰昆虫的脂肪生物合成导致幼虫死亡和降低成虫的繁殖能力^[1], 以达到防治多种蚜虫、介壳虫等刺吸式口器害虫和害螨的效果, 目前已广泛应用于柑橘的防虫害中。螺虫乙酯具有中到低毒, 对动物和人的皮肤具有潜在致敏性, 对眼睛有刺激作用^{[2, 3]}。螺虫乙酯在动植物体内的降解产物主要有4种, 分别是BYI08330-烯醇糖苷(BYI08330-enol-glucoside, B1)、BYI08330-醇酮(BYI08330-ketohydroxy, B2)、BYI08330-烯醇(BYI08330-enol, B3)和BYI08330-羟基(BYI08330-mono-hydroxy, B4), 结构式见图 1。虽然螺虫乙酯属于低毒杀虫剂, 但其具有很好的双向内吸传导性, 可通过植物的木质部和韧皮部向顶(上)传导, 也可在植株内由上向下传导, 杀虫谱广, 在环境中难挥发、难降解, 持效期较长^[4]。为了保证柑橘的品质和食用安全, 对螺虫乙酯及代谢产物进行环境安全评价, 建立高效准确地检测柑橘中螺虫乙酯及其4种代谢产物残留量的分析方法具有重要意义。

图 1 螺虫乙酯及其代谢产物的化学结构 Fig. 1 Chemical structures of spirotetramat and its metabolites

目前, 国内外螺虫乙酯的测定方法主要有液相色谱法(LC)^[5-8]、液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^[9-13]等, 螺虫乙酯代谢产物的分析方法主要采用液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)^{[14, 15]}。LC选择性差, 灵敏度低, 样品检测时间长; LC-MS/MS具有较高的选择性, 但在MS/MS模式下检测样品时依然存在高背景值或潜在的基质干扰, 尤其是在复杂基质中和低浓度水平下检测^[16]。目前, 已有研究^[17-19]表明，使用MS³技术成功分析了植物中化合物的残留, 但是使用超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱(UPLC-Q TRAP MS)技术定量检测农产品中螺虫乙酯及其代谢产物残留的研究尚未见报道。

本文在QuEChERS前处理方法的基础上, 建立了超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱检测柑橘中螺虫乙酯及其4种代谢产物残留量的方法。该方法简便、快速、准确、灵敏、分离效果好, 准确度与精密度均能达到定量分析的要求。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Triple Quad 4500超高效液相色谱-三重四极杆质谱仪(AB Sciex公司, 美国); Ultra-Turrax^® T18 Basic均质仪(IKA公司, 德国); 5804高速离心机(Eppendorf公司, 德国)。

S(纯度99.2%)、B1(C₂₄H₃₃NO₈, 纯度98.6%)、B2(C₁₈H₂₃NO₄, 纯度92.8%)、B3(C₁₈H₂₃NO₃, 纯度99.6%)和B4(C₁₈H₂₅NO₃, 纯度98.2%)均购自德国Bayer公司。乙腈和甲酸均为色谱纯(Tedia公司, 美国); 氯化钠(于140 ℃烘烤4 h)、无水硫酸钠(于130 ℃烘烤4 h)(Sigma-Aldrich公司, 美国)、N-丙基乙二胺(PSA)、石墨化炭黑(GCB)(Agilent公司, 美国)。实验用水为Milli-Q(美国Millipore公司)制备的超纯水。

1.2 标准溶液的配制

标准储备液:准确称取上述标准品, 置于50 mL容量瓶中, 用乙腈溶解并稀释至刻度, 配制成质量浓度为1 000 mg/L的标准储备液, 于4 ℃冷藏保存。

标准工作液:分别用乙腈逐级稀释上述标准储备液, 配制质量浓度为5、10、50、100、200、500和1 000 μg/L的系列标准工作溶液。

基质标准工作液:空白基质按照样品前处理方法进行处理，得到基质空白样品, 然后添加螺虫乙酯及其4种代谢产物标准品, 并用乙腈进行稀释, 得到系列基质标准工作液。

1.3 样品前处理

准确量取柑橘全果样品20 g, 置于80 mL离心管中, 依次加入20 mL乙腈、4 g无水硫酸镁和2 g氯化钠, 混匀, 用均质器在15 000 r/min的条件下均质提取2 min, 然后以8 000 r/min离心5 min, 取上清液于10 mL离心管中, 加入0.10 g PSA、10 mg GCB和0.30 g无水硫酸镁净化, 涡旋3 min, 然后以8 000 r/min离心5 min, 取上清液过0.22 μm滤膜, 用乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液(1:1, v/v)定容至1 mL, 待UPLC-Q TRAP MS测定。

将柑橘去皮, 果肉和果皮分别粉碎, 其余前处理方法同柑橘全果。

1.4 分析条件

色谱柱:Agilent EC-C18 (75 mm×2.7 mm, 2.7 μm); 流动相:A为0.01%(v/v)甲酸水溶液，B为乙腈; 流速:0.30 mL/min。梯度洗脱程序:0.5~1.0 min, 95%A~55%A; 1.0~4.0 min, 55%A; 4.0~4.8 min, 55%A~5%A; 4.8~6.0 min; 5%A; 6.0~6.1 min, 5%A~95%A; 6.1~7.1 min; 95%A。进样体积:5 μL。

离子源:ESI源, 正离子模式; 扫描方式:多反应监测(MRM); 离子源温度(TEM): 540 ℃; 离子源喷雾电压:4.8 kV; 窗帘气(CUR)压力:204 kPa; 雾化气(Gas 1)压力:340 kPa; 辅助加热气(Gas 1)压力:374 kPa; 碰撞气(CAD)压力:34 kPa。螺虫乙酯及其代谢产物的去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)和其他参数见表 1。

表 1 目标化合物的质谱参数 Table 1 MS parameters of the target compounds

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的优化

实验比较了在4种不同流动相(甲醇-0.01%(v/v)甲酸水溶液、甲醇-水、乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液和乙腈-水)条件下目标化合物的分离效果。结果表明, 流动相为乙腈-0.01%(v/v)甲酸水溶液时, 螺虫乙酯及其代谢产物的离子对响应强度最高, 因此选为实验所用。螺虫乙酯及代谢产物标准溶液(200 μg/L)在此流动相条件下的MRM色谱图见图 2。

图 2 空白样品和标准溶液(200 μg/L)中螺虫乙酯及其代谢产物的色谱图 Fig. 2 Chromatograms of spirotetramat and its metabolites in a blank sample and a standard solution (200 μg/L)

2.2 质谱条件的优化

质谱条件的优化主要包括螺虫乙酯及其代谢产物MS³跃迁离子的选择以及去簇电压、碰撞能量等参数的优化。取200 μg/L的混合标准溶液, 用针泵进样的方式进样, 首先进行母离子扫描(Q1 Scan), 获取S、B1、B2、B3和B4的母离子, 其m/z分别为374.1、318.1、464.1、302.1、和304.1, 在MRM扫描模式下优化DP、CE等质谱参数, 然后得到待测物第二极前体离子, 其m/z分别为302.3、300.2、253.1、253.1和254.1。在线性离子阱(LIT)捕集的MS³光谱中显示出强烈的第三极离子, 其m/z分别为270.3、268.2、225.1、225.2和148.2。优化结果见表 1。

2.3 样品前处理条件的优化

本方法采用QuEChERS对样品进行前处理, 该方法主要通过将含多种官能团的吸附材料复合以吸附生物样品中的主要干扰杂质, 同时将水溶性的被测物质留在样品溶液中, 从而达到富集的目的。选取PSA作为净化材料, 其有效成分为PSA表面键合的氨基, 可有效去除样品中的金属离子、糖类、脂肪酸、叶黄素、甾醇、亲脂性色素等极性物质, 但对水溶性色素的净化能力不理想。因此本研究在PSA的基础上添加了GCB。GCB对色素、类胡萝卜、固醇和平面结构的基质干扰物有较强的吸附净化能力, 但是由于其表面的六元环结构会吸附一些平面及对称结构的农药, 导致回收率降低, 因而还对净化过程中GCB的用量(5、10、15和20 mg)进行了优化(见图 3)。结果表明, 当GCB的用量为10 mg时, 柑橘中螺虫乙酯及其代谢产物的回收率均较好, 故选为实验所用。

图 3 GCB的用量对柑橘中螺虫乙酯及其代谢产物回收率的影响 Fig. 3 Effect of amount of graphitized carbon black (GCB) on the recoveries of spirotetramat and its metabolites in citrus

2.4 线性范围、检出限和定量限

根据中华人民共和国农业部组织制定的《农药残留检测方法国家标准编制指南》^[20]进行方法学验证。按照1.2节方法配制质量浓度为2~1 000 μg/L的系列柑橘(全果、果肉和果皮)基质标准工作液, 以峰面积对质量浓度进行线性回归, 绘制标准曲线(见表 2)。柑橘基质中螺虫乙酯及其4种代谢产物在线性范围内具有良好的线性关系, 相关系数(R²)＞0.99;采用空白基质提取液逐级稀释标准溶液的方法, 以信噪比(S/N)为3和10时确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 螺虫乙酯及其4种代谢产物的检出限和定量限分别为0.08~0.49 μg/kg和0.26~1.62 μg/kg(见表 2)。与其他采用MS²技术报道^{[11, 13]}的LOD(0.12~1.40 μg/kg)和LOQ(0.40~4.90 μg/kg)值相比, 本方法的检出限和定量限较低, 说明方法的灵敏度较高。

表 2 柑橘全果、果肉和果皮样品中螺虫乙酯及其代谢产物的线性方程、相关系数、检出限和定量限 Table 2 Linear equations, correlation coefficients (R²), limits of detection (LODs) and limits of quantification (LOQs) of spirotetramat and its metabolites in flesh, peel, whole fruit of citrus

Analyte	Matrix	Linear equation	R²	LOD/(μg/kg)	LOQ/(μg/kg)
S	whole fruit	y=1.05×10⁴x-7.86×10⁴	0.999	0.10	0.33
	peel	y=1.59×10⁴x+6.90×10⁴	0.996	0.10	0.33
	flesh	y=3.01×10³x-4.92×10²	0.995	0.08	0.26
B1	whole fruit	y=2.42×10³x+1.43×10⁴	0.993	0.21	0.69
	peel	y=3.84×10³x-9.65×10⁴	0.997	0.33	1.09
	flesh	y=1.00×10³x+5.00×10⁴	0.992	0.08	0.26
B2	whole fruit	y=7.15×10²x+3.58×10³	0.998	0.38	1.25
	peel	y=9.72×10²x-1.86×10⁴	0.998	0.48	1.58
	flesh	y=6.60×10²x+6.23×10³	0.999	0.34	1.12
B3	whole fruit	y=1.01×10⁴x+7.61×10³	0.999	0.14	0.46
	peel	y=1.33×10⁴x+1.46×10⁵	0.999	0.10	0.33
	flesh	y=9.91×10³x-2.72×10⁴	0.999	0.13	0.43
B4	whole fruit	y=4.19×10³x-7.10×10⁴	0.995	0.43	1.42
	peel	y=3.79×10³x-1.09×10⁴	0.997	0.16	0.53
	flesh	y=2.79×10³x+1.30×10⁵	0.999	0.49	1.62
y: peak area; x: mass concentration, μg/L

2.5 基质效应(ME)

采用串联质谱检测样品时往往会存在基质效应的干扰, 基质效应主要受样品基质、化合物性质和离子源监测模式等因素的影响。为了评估本次研究产生基质效应的大小, 同时建立螺虫乙酯及其4种代谢产物的溶液标准曲线和基质(柑橘全果、果肉、果皮)标准曲线, 以相同浓度下二者峰面积之比计算基质效应, 公式为ME=(A_乙腈-A_基质)/A_乙腈×100%, 其中A_乙腈和A_基质分别表示采用乙腈和基质溶液为溶剂时目标化合物的峰面积。ME值的可接受范围为-10%~10%。本研究同时对比了在MS²和MS³条件下螺虫乙酯及其代谢产物的基质效应(见图 4)。结果表明，使用MS³检测时, 相较于MS², 螺虫乙酯及其代谢产物在3种基质(柑橘全果、果肉、果皮)中的基质效应分别降低了55.55%、64.77%和58.97%。因此使用MS³检测存在较高基质背景值的复杂样品可在一定程度上减小基质效应引起的偏差。

图 4 柑橘果皮、果肉和全果样品中目标化合物的基质效应 Fig. 4 Matrix effects of the target compounds in peel, flesh and whole fruit of citrus

2.6 回收率和精密度

按照1.3节对空白样品进行前处理, 分别添加5、100和500 μg/L的混合标准溶液进行加标回收试验。柑橘中螺虫乙酯及其4种代谢产物的加标回收率为94.0%~98.7%, 相对标准偏差(RSD)为1.1%~5.3%, 相对误差(RE)为-1.3%~-6.0%(见表 3)。

表 3 螺虫乙酯及其4种代谢产物的回收率、相对标准偏差和相对误差(n=8) Table 3 Recoveries, RSDs and relative errors (REs) of the spirotetramat and its four metabolites (n=8)

Analyte	Spiked/(μg/L)	Measured (mean±SD)/(μg/L)	Recovery/%	RSD/%	RE/%
S	5	4.9±0.1	97.6	1.6	-2.4
	100	98.7±1.1	98.7	1.1	-1.3
	500	485.3±15.8	97.1	3.3	-2.9
B1	5	4.8±0.1	95.6	2.7	-4.4
	100	96.5±2.1	96.5	2.1	-3.5
	500	474.1±25.3	94.8	5.3	-5.2
B2	5	4.8±0.1	95.2	2.1	-4.8
	100	97.3±2.0	97.3	2.1	-2.7
	500	475.4±18.7	95.1	3.9	-4.9
B3	5	4.9±0.1	97.4	1.9	-2.6
	100	97.7±1.1	97.7	1.2	-2.3
	500	479.3±19.8	95.9	4.1	-4.1
B4	5	4.7±0.2	94.0	3.8	-6.0
	100	96.7±3.1	96.7	3.2	-3.3
	500	487.2±12.8	97.4	2.6	-2.6
RE: (measured value/actual value-1)×100%.

表 3 螺虫乙酯及其4种代谢产物的回收率、相对标准偏差和相对误差(n=8) Table 3 Recoveries, RSDs and relative errors (REs) of the spirotetramat and its four metabolites (n=8)

2.7 田间试验

2013年6月10日~2014年12月30日选择我国柑橘种植代表性地区江苏省苏州市吴中区东山镇温州蜜柑作为实验作物, 采用建立的UPLC-Q TRAP MS方法对螺虫乙酯及其4种代谢产物残留进行检测。在距最后一次施药间隔时间为20、30、40 d时对柑橘进行采样, 每个样品平行检测3次, 在施药含量最高推荐量(60 mg/kg)用药时, 柑橘果肉、果皮、全果样品中螺虫乙酯及其4种代谢产物的残留总量分别为5.93~14.20、11.30~17.86和1.30~16.51 μg/kg(见表 4), 残留量均低于国家标准最大残留限量值1.00 mg/kg^[21]。

表 4 柑橘果肉、果皮、全果中螺虫乙酯及其4种代谢产物的残留量 Table 4 Residues of the spirotetramat and its four metabolites in flesh, peel, whole fruit of citrus

3 结论

本文基于QuEChERS的前处理方法, 建立了超高效液相色谱-三重四极杆-离子阱质谱检测柑橘中螺虫乙酯及其代谢产物残留的方法。该方法操作简便, 快速准确, 灵敏度高, 分离效果好, 准确度与精密度均能达到定量分析的要求, 适用于柑橘中螺虫乙酯及其代谢产物残留的定性定量检测。

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