婴幼儿湿疹, 又称奶癣, 是一种十分常见的过敏性炎症性皮肤病, 多发于头、面、颈部, 患处瘙痒剧烈, 病情易反复发作[1], 其中6~12个月婴儿的湿疹发生率约为75.7%, 且发病率呈逐年上升趋势[2], 严重影响了患儿的生活质量和健康成长[3]。另外, 婴幼儿湿疹往往是儿童过敏性(变应性)疾病的早期表现, 有报道[4, 5]表明大约80%的婴儿湿疹患者在其皮肤病症状消退后又发生了呼吸道变态反应, 如哮喘、过敏性鼻炎、过敏性结膜炎等其他过敏性疾病, 而且湿疹发病的月龄越早, 哮喘的发病年龄越小[6], 如果继发细菌感染, 还会导致全身的中毒感染, 甚至危及生命[7]。
治疗湿疹的传统方法是外用含激素的霜膏剂, 如含糖皮质激素的霜膏剂[8], 长期不正确使用或滥用含激素的产品会产生副作用，如柯兴综合征、免疫抑制、皮肤干燥及刺痛感等[9]。《化妆品安全技术规范》(2015版)[10]及欧盟化妆品指令[11]均明确规定糖皮质激素为禁用物质。有文献[12-15]报道了化妆品中糖皮质激素的测定方法, 现行《化妆品中四十一种糖皮质激素的测定》[16]亦规定了化妆品中糖皮质激素的测定方法, 但这些方法均未针对婴幼儿湿疹产品。婴儿皮肤功能不成熟[17], 更容易产生如湿疹、尿布疹、特应性皮炎等各种皮肤问题[18, 19], 未知情况下大量使用含糖皮质激素的产品会导致婴儿皮肤产生药物依赖性和反跳性皮炎[20]。
本实验室以市面上卫生许可证为消字号和卫妆准字号的婴幼儿湿疹产品为研究对象, 建立了全自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱(ASPE-UHPLC-MS/MS)测定婴幼儿湿疹膏中42种糖皮质激素的检测方法, 以期为婴幼儿湿疹产品中糖皮质激素的检测提供一定的数据支撑。
Prominence LC-30A超高效液相色谱仪(日本岛津公司); AB SCIEX Triple QuadTM 5500质谱仪, 带ESI源(美国Allen-Bradley公司); GX-274 ASPEC全自动固相萃取仪(美国吉尔森公司); AUW220D电子分析天平(日本岛津公司); Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。
42种糖皮质激素标准品分别购自中国食品药品检定研究院、德国Dr. Ehrenstorfer公司、美国药典委员会和加拿大TRC公司, 纯度均大于97%。甲醇和乙腈(德国Merck公司); 乙酸锌和亚铁氰化钾(国药集团公司); Oasis HLB固相萃取小柱(60 mg/3 mL)(美国Waters公司)。所用水均为Milli-Q纯水仪制备的超纯水。样品均为市售。
分别精密称取上述标准品各10 mg, 置于10 mL容量瓶中, 用甲醇溶解并定容至刻度, 配制质量浓度为1 000 mg/L的单标准储备液; 分别精密移取上述溶液1 mL, 置于50 mL容量瓶中, 用甲醇稀释至刻度, 摇匀, 配制成质量浓度为20 mg/L的混合标准储备液; 精密吸取一定体积的混合标准储备液, 用50%(v/v)甲醇水溶液配制成质量浓度为5~1 000 μg/L的系列混合标准溶液。
称取试样约0.2 g(精确至0.01 g), 置于10 mL具塞塑料离心管中, 加入3 mL饱和氯化钠溶液, 于涡旋混合器上混合, 使样品分散, 准确加入2 mL乙腈, 充分涡旋提取2 min, 以5 000 r/min离心10 min, 吸出上层清液, 置于另一50 mL具塞塑料离心管中, 下层氯化钠溶液用2 mL乙腈重复提取一次, 合并两次的乙腈提取液, 加入30 mL水, 混匀, 然后加入0.2 mL 100 g/L亚铁氰化钾水溶液(称取115 g三水合亚铁氰化钾用水溶解定容至1 000 mL), 混匀, 再加入0.2 mL 200 g/L乙酸锌水溶液(称取239 g二水合乙酸锌用水溶解定容至1 000 mL), 混匀, 用水定容至40 mL, 以5 000 r/min离心10 min, 过滤, 滤液待净化。
预先依次用5 mL甲醇、10 mL水依次活化固相萃取小柱, 再用10 mL 10%(v/v)乙腈水溶液清洗小柱, 精密量取1.3节滤液5.0 mL进行上样, 用4 mL甲醇洗脱, 收集洗脱液, 加入4 mL超纯水, 经0.22 μm有机滤膜过滤, 待上机分析。
色谱柱:Dikma EndeavorsilTM C18柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 柱温:30 ℃; 流速:0.25 mL/min; 流动相A: 0.1%(v/v)甲酸水溶液; 流动相B:乙腈。梯度洗脱程序:0~3.0 min, 20%B~32%B; 3.0~12.0 min, 32%B~75%B; 12.0~14.0 min, 75%B; 14.0~14.5 min, 75%B~ 95%B; 17.0~18.0 min, 95%B~20%B; 18.0~20.0 min, 20%B。进样量:5 μL。
离子源:电喷雾电离源, 正离子模式(ESI+); 毛细管电压:3 kV; 锥孔电压:30 V; 萃取锥孔电压:3 V; 聚焦电压:0.1 V; 脱溶剂温度:500 ℃; 鞘气流速:500 L/h。42种糖皮质激素的其他质谱参数见表 1。
根据待测物的性质, 考察了Dikma EndeavorsilTM C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)、ACQUITYTM UPLC HSS T3(50 mm×1.8 mm, 1.7 μm)、Agilent EC-C18(150 mm×2.1 mm, 2.7 μm)、HaloTM C18(100 mm×2.1 mm, 2.7 μm)和ACQUITYTM UPLC BEH C18(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)5种色谱柱的分离效果; 比较了水-乙腈、水-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-甲醇、0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈4种流动相对分离效果的影响。结果表明, 采用1.7 μm Dikma EndeavorsilTM C18柱, 以0.1%(v/v)甲酸水溶液-乙腈为流动相进行梯度洗脱时42种糖皮质激素的响应值和峰形均较好, 可获得较好的峰形和分离。
在电喷雾离子源下, 采用正离子和负离子模式分别对质量浓度为400 μg/L的42种糖皮质激素混合标准溶液进行全扫描分析。发现42种糖皮质激素均在正离子模式下获得[M+H]+母离子。在此基础上, 分别优化各糖皮质激素的锥孔电压及碰撞能量, 使其母离子、子离子的响应值达到最大, 选取待测物质谱响应最佳的两对离子对及其他质谱参数, 优化后的质谱条件见表 1。42种糖皮质激素在优化后的色谱-质谱条件下分离效果较好, 灵敏度较高。42种糖皮质激素混合标准溶液(400 μg/L)的总离子流色谱图见图 1。
在高效液相色谱-串联质谱分析中, 基质效应会对分析方法的灵敏度、精密度以及准确度造成影响, 改进前处理方法、纯化样品是消除基质干扰的有效手段[21]。本实验比较了以水、饱和氯化钠为分散剂, 以乙腈、甲醇为提取剂和洗脱液时, 42种糖皮质激素的回收率。结果表明, 以饱和氯化钠为分散剂, 以甲醇为洗脱液时, 42种糖皮质激素的回收率最高; 另外, 以乙腈为提取剂时比甲醇更利于分层, 不易乳化。因此本实验采用以饱和氯化钠为分散剂, 乙腈为提取剂, 甲醇为洗脱液。
配制42种糖皮质激素的系列混合标准溶液, 以响应值为纵坐标(y)、相应的质量浓度为横坐标(x, μg/L)绘制标准曲线。结果表明, 42种糖皮质激素在5~1 000 μg/L的范围内线性关系良好, 相关系数(r)均大于0.998, 结果见表 2。
用50%(v/v)甲醇水溶液逐步稀释42种糖皮质激素的混合标准品溶液, 在1.5节和1.6节条件下进行测定, 以大于3倍和10倍信噪比时对应的质量浓度计算检出限(LOD)和定量限(LOQ)。42种糖皮质激素的LOD均小于0.03 mg/kg, LOQ均小于0.1 mg/kg。
精密称取试样0.2 g, 分别加入质量浓度为20 mg/L的42种糖皮质激素混合标准溶液0.2、1.0、6.0 mL, 每个添加水平重复测定6次, 其加标回收率为78.7%~101.5%, RSD为2.0%~8.8%(见表 2), 表明方法具有良好的准确度和精密度。
根据建立的方法, 对市面上声称纯草本、用于婴幼儿湿疹护理的5批(包括2批卫生许可证的卫妆准字号和3批消准字号)样品进行42种糖皮质激素的测定。结果表明, 2批样品中检出醋酸泼尼松, 含量分别为675 mg/kg和844 mg/kg; 1批样品中检出地塞米松醋酸酯和氟米松, 含量分别为264 mg/kg和1.2 mg/kg。
本实验建立了全自动固相萃取-超高效液相色谱-串联质谱测定婴幼儿湿疹膏中42种糖皮质激素的方法, 实现了样品分析的快速性和高效性, 可满足婴幼儿湿疹膏中糖皮质激素的测定。该法为以中草药为主要原料的治疗婴幼儿湿疹类产品的检测及监管提供了技术支撑。
2018,
Vol. 36 Issue (4): 356-361
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2018,
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