色谱  2018, Vol. 36 Issue (4): 400-407   PDF    
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刘洪斌
姚喜梅
田亚平
张鹭
蔡英华
姜艳彬
李颖
超高效液相色谱-串联质谱法同时检测动物组织中15种保水功能药物
刘洪斌1, 姚喜梅2, 田亚平1, 张鹭1, 蔡英华1, 姜艳彬1, 李颖1     
1. 中国动物疫病预防控制中心, 北京 102609;
2. 中国标准化协会, 北京 100048
收稿日期：2017-11-05
基金项目：“十二五”国家科技支撑重点项目（2014BAD13B05）
通讯联系人：李颖, Tel:(010)59198901, E-mail:liying@163.com
摘要：建立了超高效液相色谱-串联质谱检测动物组织中15种保水功能药物残留的分析方法。样品经含1.0%（v/v）甲酸的乙腈溶液提取和Oasis PRiME HLB SPE柱净化后，采用Acquity UPLC BEH C18色谱柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）分离，以甲醇和0.1%（v/v）甲酸水溶液为流动相进行梯度洗脱，在电喷雾电离（ESI）源、正离子模式下，采用MRM监测模式进行数据采集。在1.0~50.0 μg/kg范围内，15种保水功能药物的线性关系良好，相关系数均≥0.9949；定量限均低于1.0 μg/kg。通过添加回收试验表明，动物组织中15种保水功能药物的平均回收率为60.0%~111.0%，批内RSD为0.56%~11.5%，批间RSD为2.31%~14.8%。该方法满足动物组织中该药物多残留的检测要求，为应对动物源性食品中筛查风险隐患和监控非法添加提供了新思路。
关键词：超高效液相色谱-串联质谱    残留    保水功能药物    动物组织    
Simultaneous determination of 15 water-holding functional drugs in animal tissues using ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry
LIU Hongbin1, YAO Ximei2, TIAN Yaping1, ZHANG Lu1, CAI Yinghua1, JIANG Yanbin1, LI Ying1     
1. China Animal Disease Control Center, Beijing 102609, China;
2. China Association for Standardization, Beijing 100048, China
Abstract: A method based on ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS) was developed for the determination of 15 water-holding functional drugs in animal tissues.The analytes were extracted with acetonitrile containing 1.0%(v/v) methanol, purified by Oasis PRiME HLB SPE column, and analyzed by Acquity UPLC BEH C18 column (50 mm×2.1 mm, 1.7 μm) using methanol and 0.1%(v/v) formic acid aqueous solution as the mobile phases.The analytes were detected using an electrospray ionization (ESI) source under the MRM mode.The calibration curves of the analytes were linear in the range of 1.0-50.0 μg/kg (r ≥ 0.9949), and the limits of quantification were all less than 1.0 μg/kg in animal tissues.The recoveries of the 15 water-holding functional drugs ranged from 60.0%-111.0% in animal tissue samples, with the intra and inter RSDs of 0.56%-11.5% and 2.31%-14.8%, respectively.The method can meet the requirements for the determination of the drug residues in animal tissues.It provides a new idea to identify potential hazards in animal-derived foods and to monitor illegal addition.
Key words: ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (UPLC-MS/MS)     residues     water-holding functional drugs     animal tissues    

随着经济的发展和生活水平的提高, 人们对动物源食品的需求日益增大, 促使畜牧业在近几年得到了长足发展。不同种类兽药的使用对治疗和预防动物疾病、促进动物生长至关重要。目前我国存在养殖规模小而散、科学养殖水平低、盲目用药现象多的现状, 导致了养殖环节药物用量超标、不合理休药及人药兽用等问题仍较严重。在经济利益的驱使下, 非法添加违禁药物和功能性药物的现象屡禁不止。随着消费者对动物性产品质量安全的日益关注, 动物产品中限用及违禁药物的检测对保证食品安全意义重大。

目前动物性产品中药物残留检测方法大多按药物种类分类, 如磺胺类[1, 2]、喹诺酮类[3]、β-受体激动剂类[4]和大环类脂类[5]等, 也有多种类药物同时检测的报道[6, 7]。但实际生产中, 多类药物往往具有相似的功能或相同的副作用, 如部分抗胆碱类、抗惊厥类、肾上腺素类药物均具有口干、钠水潴留、排尿困难等特点[8], 这些副作用可间接用于注水增重以达到增收的效果。如果过量使用这些保水功能药物, 动物会出现烦躁不安、痉挛等神经兴奋症状, 进而出现昏迷、呼吸困难甚至死亡[9, 10]。因此建立针对同一功能、特性及副作用的多种类药物同时检测的方法, 为更好地保障食品安全、监管药物非法添加具有重要现实意义。

本实验研究了卡马西平、阿托品、哌仑西平和美卡拉明等15种保水功能药物, 这些药物的研究大多见于医学领域, 内容多为该类药物对人体及动物的治疗效果及药物作用机理[11, 12], 主要检测方法包括液相色谱法[13, 14]、液相色谱-质谱联用法[15, 16]和飞行时间质谱法[17]等, 然而检测动物组织中这些药物残留方法的报道较少[18], 其中多残留同时检测的方法还未见报道。本文建立了液相色谱-串联质谱检测动物组织中这15种保水功能药物残留的方法, 较好地满足动物组织中该功能药物残留的检测需求, 对更好地警示非法注水、监管动物源性食品安全和打击非法添加提供了技术支撑。

1 实验部分
1.1 仪器、试剂与材料

Acquity UPLC I-CLASS超高效液相色谱仪、TQ-XS三重四极杆质谱仪(美国Waters公司); 3K15型离心机(美国Sigma公司); T25均质机(德国IKA公司); N-EVAP氮吹仪(美国Organomation公司):Milli-Q纯水仪(美国Millipore公司)。

普瑞巴林(pregabalin)、美卡拉明(mecamylamine)、卡马西平(carbamazepine)、卡马西平10, 11环氧化物(carbamazepine 10, 11-epoxide)、氢溴酸后马托品(homatropine hydrobromide)、托吡卡胺(tropicamide)、阿托品(atropine)、氢溴酸东莨菪碱(scopolamine hydrobromide)、扎来普隆(zaleplon)、双环胺(dicyclomine)、贝那替嗪(benactyzine)、依替唑仑(etizolam)、哌仑西平(pirenzepine)、丁溴酸东莨菪碱(scopolamine butylbromide)和丙哌维林(propiverine)购自百灵威科技有限公司和美仑生物技术公司, 纯度均＞97%。乙腈、甲醇、甲酸等均为色谱纯, 购自美国Fisher公司; Oasis PRiME HLB SPE柱(60 mg/3 mL)购自美国Waters公司。猪肉、牛肉样品购自超市和农贸市场。

称取适量上述标准品, 用甲醇配制单标准储备液, 并用甲醇配制成质量浓度为10 mg/L的混合标准溶液, 于-20 ℃保存; 用初始流动相配制系列标准工作液, 现用现配。

1.2 样品前处理

提取:准确称取匀浆后的动物组织样品2 g(精确到0.01 g), 置于50 mL离心管中, 加入10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液, 以9500 r/min离心5 min, 取上清液于另一50 mL离心管中, 再用10 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液重复提取一次, 合并两次提取液, 准确量取10 mL, 置于15 mL离心管中, 待净化。

净化:将提取液上样至用3 mL含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液活化过的Oasis PRiME HLB SPE柱中, 收集全部滤出液, 于50 ℃氮气吹至近干, 然后用0.5 mL初始流动相定容, 以12000 r/min离心5 min, 经0.22 μm滤膜过滤, 待上机测定。

1.3 色谱条件

色谱柱:Acquity UPLC BEH C18柱(50 mm×2.1 mm, 1.7 μm); 流速:0.3 mL/min; 流动相:(A)0.1%(v/v)甲酸水溶液和(B)甲醇。梯度洗脱程序:0~0.5 min, 3%B, 0.5~2.5 min, 3%B~30%B; 2.5~3.5 min, 30%B, 3.5~3.6 min, 30%B~60%B, 3.6~4.5 min, 60%B, 4.5~6.0 min, 60%B~100%B, 6.0~7.5 min, 100%B, 7.5~8.5 min, 100%B~3%B; 8.5~10.5 min, 3%B。进样量:10 μL。

1.4 质谱条件

离子源:电喷雾电离源, 正离子模式(ESI+); 离子源温度:150 ℃; 毛细管电压:3.0 kV; 锥孔电压:3 V; 透镜电压:0.5 V; 脱溶剂温度:250 ℃; 锥孔气流速:150 L/h; 脱溶剂气流速:600 L/h; 碰撞气流速:0.15 mL/min; 监测模式:MRM模式。15种保水功能药物的母离子、子离子及其对应的聚焦电压和碰撞能量见表 1。

表 1 15种保水功能药物的母离子、子离子、聚焦电压、碰撞能和保留时间 Table 1 Precursor ions, product ions, focus voltages, collision energies and retention times of the 15 water-holding functional drugs
2 结果与讨论
2.1 过滤膜种类的优化

滤膜过滤作为前处理过程的最后一道防线, 对净化样品、减少基质干扰作用明显。滤膜对药物的吸附作用直接影响检测结果的回收率和准确性。本文考察了Waters GHP膜、Agilent PTFE膜和尼龙膜、聚醚砜(PES)膜(天津津腾实验设备有限公司)等4种适用于绝大多数有机溶剂和水溶液的滤膜对10 μg/L混合标准溶液吸附效果的影响(见图 1)。结果显示, 4种滤膜对除普瑞巴林、托吡卡胺和阿托品外的其他12种药物均存在不同程度的吸附, 吸附率为0.7%~68.7%, 其中Waters GHP膜、Agilent PTFE膜对双环胺及丙哌维林的吸附作用较明显; 尼龙膜除对丁溴酸东莨胆碱、扎来普隆和卡马西平10, 11环氧化物的吸附作用较聚醚砜膜明显外, 其他均优于聚醚砜膜。综合滤膜对各药物的吸附率和价格, 选取尼龙膜作为实验用过滤膜, 但考虑到尼龙膜对部分目标药物也存在吸附, 实验用标准溶液也需经滤膜过滤后上机。

图 1 不同滤膜对15种保水功能药物吸附率的影响 Fig. 1 Effect of different filters on the adsorption rates of the 15 water-holding functional drugs GHP:hydrophilic polypropylene; PTFE:polytetrafluoroethylene; PES:polyether sulfone.
2.2 提取溶剂的选择

在空白动物组织样品中添加10 μg/kg 15种保水功能药物的混合标准溶液, 分别选取甲醇、乙腈、80%(v/v)乙腈水溶液、含不同体积分数(0.1%、0.2%、0.5%和1.0%)甲酸的乙腈溶液等7种提取溶剂, 考察不同提取溶剂对提取效果的影响(见图 2)。结果表明, 当采用甲醇和80%(v/v)乙腈水溶液为提取溶剂时, 蛋白质变性沉淀不完全, 样品整体较为浑浊, 且回收率较低。普瑞巴林、卡马西平、依替唑仑、双环胺及丙哌维林5种药物的回收率均随乙腈中甲酸体积分数的升高而增加, 当甲酸的体积分数达到1.0%时, 双环胺及丙哌维林两种药物的回收率能达到60%以上。因此实验最终选择含1.0%(v/v)甲酸的乙腈溶液作为提取溶剂。

图 2 不同提取溶剂对15种保水功能药物回收率的影响 Fig. 2 Effect of different extraction solutions on the recoveries of the 15 water-holding functional drugs
2.3 基质效应(ME)

动物组织含有丰富的脂类、蛋白质、肽类及其代谢产物等各种有机物[19], 组织样品经处理后, 仍有部分上述物质和待测药物以共流出物的形式同时进入电离源, 导致增强或抑制待测药物的电离程度, 从而产生不同的基质效应。试验采用提取后添加法[20]测定基质效应。ME=目标化合物在空白动物组织和纯溶剂中的峰面积之比。若ME值小于1.0, 说明基质对待测物的响应产生抑制作用; 若ME值大于1.0, 说明存在增强效应。结果表明, 除猪肉中哌仑西平、依替唑仑及牛肉中双环胺的抑制效果不明显外, 其他药物在两种基质中均存在不同程度的抑制效果, ME为0.70~1.05;15种药物在猪肉和牛肉中的基质效应差别不显著(见表 2)。但为减少基质效应对结果准确度的影响, 应在实际检测中采用空白基质加标溶液。

表 2 不同动物组织样品中15种保水功能药物的基质效应 Table 2 Matrix effects of the 15 water-holding functional drugs in different animal tissue samples
2.4 线性方程和检出限

采用1.2节方法处理空白组织样品, 添加适量15种保水功能药物的混合标准溶液, 配制1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/kg基质加标溶液, 经UPLC-MS/MS检测, 以定量离子色谱峰面积为纵坐标、待测药物的含量为横坐标绘制标准曲线。结果表明, 在猪肉和牛肉组织中, 15种保水功能药物在1.0~50.0 μg/kg范围内线性关系良好, 相关系数(r)均≥0.9949(见表 3)。

表 3 15种保水抗利尿药物的线性方程、相关系数、线性范围、检出限和定量限 Table 3 Linear equations, correlation coefficients (r), linear ranges, limits of detection and limits of quantification of the 15 water-holding functional drugs

用空白基质溶液逐级稀释标准溶液, 按3倍和10倍信噪比确定方法的检出限(LOD)和定量限(LOQ), 15种保水功能药物的定量限均低于1.0 μg/kg(见表 3)。

2.5 回收率

取空白猪肉、牛肉组织样品, 添加含量为1.0、2.0和10 μg/kg 3个水平的混合标准溶液, 每个水平平行测定6次, 共测定3个批次, 按1.2节方法进行添加回收试验(见表 4)。猪肉中15种药物的平均回收率为60.0%~108.2%, 批内RSD为1.09%~10.5%, 批间RSD为2.31%~11.4%;牛肉中15种药物的平均回收率为68.6%~111.0%, 批内RSD为0.56%~11.5%, 批间RSD为3.65%~14.8%。方法的准确度及精密度均满足GB/T 27404-2008要求。空白猪肉样品中添加15种保水功能药物(10 μg/kg)的提取离子色谱图见图 3。

表 4 动物样品中15种保水抗利尿药物的加标回收率和相对标准偏差 Table 4 Spiked recoveries and RSDs of the 15 water-holding functional drugs in animal samples

图 3 加标猪肉样品中15种保水功能药物(10 μg/kg)的提取离子色谱图 Fig. 3 Extracted ion chromatograms of the 15 water-holding functional drugs in blank pork samples spiked with 10 μg/kg
3 结论

本实验针对具有相同副作用的药物建立了UPLC-MS/MS检测动物组织中15种保水功能药物残留的方法, 为应对动物源性食品中风险隐患的筛查和监控提供了新思路。该方法前处理快速简单, 灵敏度高, 稳定性好, 能够较好地满足动物组织中该类药物残留的检测要求, 该方法的建立能有效防范药物滥用和非法添加行为, 并对打击动物组织中非法注水提供了一定的技术支撑。

参考文献
[1] Liu H B, Yao X M, Cai Y H, et al. Chinese Journal of Analysis Laboratory, 2015, 34(10): 1141.
刘洪斌, 姚喜梅, 蔡英华, 等. 分析试验室, 2015, 34(10): 1141.
[2] Xu X, Xiao Y C, Geng D D, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(4): 422.
许旭, 肖远灿, 耿丹丹, 等. 色谱, 2016, 34(4): 422.
[3] Yang Y F, Cao X M, Li X L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(11): 1063.
杨艳菲, 曹旭敏, 李雪莲, 等. 色谱, 2016, 34(11): 1063.
[4] Zheng L, Wu Y J, Zhao Y F, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2014, 32(8): 867.
郑玲, 吴玉杰, 赵永锋, 等. 色谱, 2014, 32(8): 867.
[5] Zhang X G, Liu D, Liu H R, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2017, 35(10): 1055.
张晓光, 刘东, 刘红冉, 等. 色谱, 2017, 35(10): 1055.
[6] Luo H D, Xie M T, Huang X L, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(4): 354.
罗辉泰, 谢梦婷, 黄晓兰, 等. 色谱, 2015, 33(4): 354.
[7] Wang H, Zhao L, Yang H M, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2015, 33(9): 995.
王浩, 赵丽, 杨红梅, 等. 色谱, 2015, 33(9): 995.
[8] Li W N. [MS Dissertation]. Hangzhou: Zhejiang Gongshang University, 2010
李伟妮. [硕士学位论文]. 杭州: 浙江工商大学, 2010
[9] Wu G S. Chinese Journal of Modern Drug Application, 2010, 4(11): 118.
吴桂生. 中国现代药物应用, 2010, 4(11): 118. doi: 10.3969/j.issn.1673-9523.2010.11.104
[10] Jose N, Angela H, Mitchell J B, et al. Am J Geriatr Pharmacother, 2006, 4(1): 42. doi: 10.1016/j.amjopharm.2006.03.008
[11] Modi A R, Casten R, Rovner B W. Am J Geriatr Pharmacother, 2015, 23(3): 109.
[12] Machado-Alba J E, Castro-Rodriguez A, Alzate-Piedrahita J A, et al. J Am Med Dir Assoc, 2016, 17(3): 275.
[13] Tu J S, Li P M, Yang X Y. J Chromatogr B, 2005, 822(1/2): 300.
[14] Ceyhan T, Kartal M, Altun M L, et al. J Pharm Biomed Anal, 2001, 25(3/4): 399.
[15] John H, Binder T, Hochstetter H, et al. Anal Bioanal Chem, 2010, 396: 751. doi: 10.1007/s00216-009-3209-7
[16] Li J L, Zhang Z Q, Ruan J X, et al. J Chromatogr B, 2007, 855: 180. doi: 10.1016/j.jchromb.2007.04.046
[17] Yu Z H, Wu Z P, Gong F J, et al. J Sep Sci, 2012, 35(20): 2773. doi: 10.1002/jssc.v35.20
[18] Hu X J, Wu N P, Meng L, et al. Chinese Journal of Veterinary Drug, 2014, 48(7): 46.
胡兴娟, 吴宁鹏, 孟蕾, 等. 中国兽药杂志, 2014, 48(7): 46.
[19] Wang L Q, He L M, Zeng Z L, et al. Journal of Chinese Mass Spectrometry Society, 2011, 32(6): 322.
王立琦, 贺利民, 曾振灵, 等. 质谱学报, 2011, 32(6): 322.
[20] Matuszewki B K, Constanzer M L, Chavez-Eng C M. Anal Chem, 2003, 75: 3019. doi: 10.1021/ac020361s