色谱  2018, Vol. 36 Issue (4): 381-387   PDF    
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肖汉
Kevin YAN
郑怡婷
王彦
阎超
基于加压毛细管电色谱-激光诱导荧光联用技术研究离子强度对维生素B2光解反应的影响
肖汉1, Kevin YAN2, 郑怡婷1, 王彦1, 阎超1     
1. 上海交通大学药学院, 上海 200240;
2. University of California, Riverside 92521, USA
收稿日期：2017-11-09
基金项目：上海市科委科研计划项目(16142200300, 17142201000)；上海市引进技术的吸收与创新专项(XC-ZXSJ-02-2016-11)；上海市标准化推进专项(17DZ2201500)
通讯联系人：王彦, E-mail:wangyan11@sjtu.edu.cn; 阎超, E-mail:chaoyan@sjtu.edu.cn
摘要：基于加压毛细管电色谱-激光诱导荧光检测法建立了分析维生素B2及其荧光性光解产物的方法, 并用于研究维生素B2在水溶液和磷酸盐缓冲液中的光解反应速率与离子强度之间的关系。发现在C18毛细管色谱柱, 流动相为含0.1%(v/v)三氟乙酸的乙腈水溶液, 梯度洗脱, 激发波长为488 nm, 发射波长为520 nm的条件下, 维生素B2及多种荧光性光解产物均得到很好的分离和检测, 维生素B2的定量限为5×10-8 mol/L。在此基础上研究了维生素B2的光降解反应受光照时间和离子强度等的影响。发现离子强度对维生素B2溶液的光解反应有显著影响, 离子强度越大, 光解速度越快。并进一步通过动力学计算得到维生素B2在水溶液和磷酸盐缓冲液中光解反应的表观速率常数。该研究为维生素B2的光稳定研究提供了一种高效分离和检测的方法, 并为维生素B2的保存及临床使用提供了参考。
关键词：加压毛细管电色谱    激光诱导荧光检测    维生素B2    光解反应    反应速率常数    
Study on effect of ionic strength on photolysis of vitamin B2 based on pressurized capillary electrochromatography coupled with laser induced fluorescence detection
XIAO Han1, Kevin YAN2, ZHENG Yiting1, WANG Yan1, YAN Chao1     
1. School of Pharmacy, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China;
2. University of California, Riverside 92521, USA
Foundation item: Shanghai Science and Technology Commission Scientific Research Project (Nos.16142200300,17142201000);Shanghai Introduction of Technology Absorption and Innovation (No.XC-ZXSJ-02-2016-11);Shanghai Standardization Promotion Project (No.17DZ2201500).
Abstract: A new method for the separation and analysis of vitamin B2 and its fluorescent photolysis products was established based on pressurized capillary electrochromatography (pCEC) coupled with laser induced fluorescence (LIF) detection.The relationship between the photolysis reaction rate of vitamin B2 and the ionic strength of aqueous solution or phosphate buffered solution was studied.The analysis was carried out by using a C18 capillary column.The mobile phase was acetonitrile-water with 0.1%(v/v) trifluoroacetic acid with gradient elution.The excitation wavelength was 488 nm and the emission wavelength was 520 nm.Vitamin B2 and many fluorescent photolysis products were well separated.Based on the above, the influence of photo degradation rate of vitamin B2 with ionic strength was studied.The apparent rate constant of photolysis was calculated by kinetic calculation.The results showed that the ionic strength had a significant effect on the photolysis of vitamin B2 solution.The photolysis rate of vitamin B2 was positively related to the ionic strength.This study provides a highly efficient method for the stability research of vitamin B2, which may serve as a good reference for the preservation and clinical use of it.
Key words: pressurized capillary electrochromatography (pCEC)     laser induced fluorescence detection (LIF)     vitamin B2     photolysis reaction     reaction rate constant    

维生素B2又称核黄素, 是一种人体必需的水溶性维生素。在人体内主要以两种衍生物黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在, 作为重要的氧化还原酶的辅基参与生物氧化反应及糖、蛋白质等的代谢[1]。核黄素不能在人体内自合成, 只能从食物和外源性补充剂中摄取, 核黄素的缺乏将导致人和动物能量代谢受阻, 引起口角炎、舌炎、角膜血管增生等症状[2]。另外, 维生素B2作为一种维生素类药, 可用于辅助治疗高血压、冠心病等慢性病, 也可用于治疗放化疗所引起皮炎、黏膜炎等[3]。

维生素B2因其结构中含有异咯嗪环, 稳定性较差, 遇光容易分解[4], 很多研究都对维生素B2的光降解特性进行了研究, 测定了不同光照条件下维生素B2的含量变化[5, 6]。目前对于药物稳定性的研究, 包括维生素B2的光稳定性研究, 通常是在固定离子强度的情况下进行的。然而, 一系列研究表明, 离子强度对药物稳定性及光解反应的速率有较大的影响[7-9]。由于液体制剂会加入等渗调节剂等盐类物质, 因而在研究维生素B2的光解反应时, 不应仅仅考察在水溶液中的分解情况, 在盐溶液中的研究将有更实际的参考价值。考察维生素B2在不同离子强度条件下的光照稳定性, 首先需要建立维生素B2及降解产物的分析方法。目前, 维生素B2多采用紫外-可见分光光度法、高效液相色谱法、荧光比色法等[3, 10-12]。UV和HPLC的灵敏度欠佳, 荧光分光光度法灵敏度高, 但无法测定分解反应产生的有关物质。

加压毛细管电色谱(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)是近年发展起来的一种新兴电动微分离技术, 它以内含色谱固定相的毛细管为分离柱, 利用电渗流结合压力流来推动流动相, 既可分离带电物质也可分离中性物质。具有高柱效、高选择性、高分辨度、快速分离、样品和试剂用量少的特点[13]。pCEC已广泛应用于药物分析[14]、食品检测[15]等领域。将具有高效分离能力的pCEC和高灵敏度的激光诱导荧光(laser-induced fluorescence, LIF)检测器联用[16], 可显著增加其对痕量物质的分析, 非常适合于维生素B2和其有关物质的测定[17]。

本研究将pCEC-LIF微分离平台应用于维生素B2及其荧光性分解产物的分离分析中, 建立分析维生素B2及有关物质的新方法, 同时将利用此平台考察维生素B2溶液光解反应的速率与离子强度之间的关系。

1 实验部分
1.1 仪器与试剂

TriSep-2100型加压毛细管电色谱仪(美国Unimicro Technologies公司), 由激光诱导荧光检测器(型号Trisep-3000)、溶剂输送系统、微流控系统、高压电源及数据采集系统5部分组成; WD-A型药物稳定性检查仪(天津新天光分析仪器技术公司); Sartorius BT224S电子天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司); KQ5200DE超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司); Molcell 1805V摩尔细胞型纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司); F7000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)。

维生素B2(vitamin B2, VB2, 批号K1622101, 含量98%)购自上海阿拉丁试剂有限公司; 光黄素(lumiflavin, 含量95%)购自加拿大Toronto Research Chemicals公司, 磷酸氢二钠(含量99%)购自上海凌峰化学试剂有限公司; 三氟乙酸(trifluoroacetic acid, TFA, 含量98%)和氯化钠(分析纯)购自国药集团化学试剂有限公司; 甲醇和乙腈(色谱纯)购自美国Tedia公司。

1.2 溶液配制

维生素B2对照储备液的配制:精密称取维生素B2 18.8 mg置于250 mL容量瓶中, 准确配制浓度为2.0×10-4 mol/L的储备液。

光黄素对照储备液的配制:精密称取光黄素12.8 mg置于250 mL容量瓶中, 准确配制浓度为2.0×10-4 mol/L的储备液。

维生素B2系列对照溶液的配制:用超纯水将上述对照储备液逐级稀释为0.25×10-4、0.50×10-4、1.0×10-4和1.5×10-4 mol/L的系列对照溶液。

缓冲液和不同离子强度溶液的配制:配制10、20和40 mmol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffer saline, PBS), pH为7.0, 并加入氯化钠分别调节其离子强度。

维生素B2/PBS的配制:将维生素B2溶于上述PBS缓冲液中, 现用现配。

以上含维生素B2的溶液均用锡箔纸包裹, 避光冷藏保存。

1.3 光解反应实验条件

吸取2 mL的维生素B2/水溶液和维生素B2/PBS置于透明玻璃样品瓶中, 放入药物稳定性检查仪内, 控制检查仪的灯光强度为3 500 Lx, 温度保持在室温, 开启风扇。开始光照的时间记为t0, 在光照不同时间点取样, 样品避光冷藏保存。

1.4 维生素B2荧光光谱扫描实验条件

发射光谱测量模式, 激发波长488 nm, 发射光谱波长测量范围:450~600 nm, 激发波长狭缝宽度5 nm, 发射波长狭缝宽度5 nm, 温度为室温。

1.5 pCEC-LIF实验条件

色谱柱:毛细管色谱柱(150 mm×100 μm, 1.8 μm, C18);流动相A:水(含0.1%(v/v)三氟乙酸), 流动相B:乙腈(含0.1%(v/v)三氟乙酸), 梯度洗脱(0 min, 30%B; 0-15 min, 30%B上升至90%B; 15-20 min, 90%B), 总流速:0.05 mL/min; 柱温:室温; 分流比:1:600;进样量:3 nL; LIF激发波长:488 nm, 发射波长:520 nm。

2 结果与讨论
2.1 维生素B2在不同离子强度溶液中的荧光光谱

维生素B2溶液为黄色, 自身发黄绿色荧光, 发生光解后, 溶液颜色整体变淡, 在离子强度大的溶液中褪色更加明显。通过荧光分光光度计分别测量维生素B2在水和20 mmol/L PBS(离子强度为0.5 mol/L)中光照0.5、1、1.5和2 h后的荧光光谱, 见图 1。结果显示, 维生素B2/水溶液和维生素B2/PBS在光照不同时间后, 荧光光谱形状并没有大的改变, 但荧光强度发生了改变。维生素B2/水溶液在488 nm处激发产生的荧光强度随光照时间有一定程度的下降, 但远低于其在PBS中的下降程度。由此说明离子强度对维生素B2光解反应有直接影响, 溶液中离子强度的增加, 将加快维生素B2光解反应的速率。

图 1 在不同光照时间下维生素B2荧光光谱的比较 Fig. 1 Comparison of fluorescence spectra of vitamin B2 with different exposure time to light a.aqueous solution; b.phosphate buffer saline (PBS)solution.

在图 1中看到, 维生素B2在水溶液和磷酸盐溶液中的荧光强度有不同程度的下降, 这个强度代表的是整个维生素B2反应体系中的总荧光强度, 即维生素B2和光降解产物的荧光强度的总和, 说明维生素B2的光解产物整体上在488 nm激发时产生的荧光强度不如维生素B2本身, 也可能是部分降解产物没有荧光信号导致。为了进一步研究维生素B2和光降解产物的变化, 我们需要建立有分离能力的分析方法。

2.2 pCEC-LIF分析维生素B2及其分解产物

pCEC-LIF系统中, 毛细管色谱柱的出口端连接负电极, 进口端接地, 电渗流与压力流方向一致。在毛细管色谱柱中, 样品根据各自的分配系数和电泳淌度的不同得到分离。将毛细管色谱柱的窗口直接安装于可变波长LIF中, 激光器发射出的488 nm激光由激发滤光片滤光后经二向色镜反射, 通过物镜聚焦到色谱柱窗口上, 激发被分离的待测物质产生荧光, 荧光通过物镜聚焦、滤光片过滤, 聚焦到光电倍增管(photomultiplier tube, PMT)前面狭缝处, 由PMT采集转化成电信号, 然后被信号采集单元转化成数字信号输出。

实验中首先考察了流动相梯度、施加电压等对维生素B2分析的影响。其中电压的影响如图 2所示。可看出, 随着电压的增加, 分离时间缩短。同时, 各个物质仍能得到良好的分离, 主峰维生素B2与右侧相邻杂质峰的分离度也随电压的增加而增加。其主要原因在于, 加压毛细管电色谱兼具HPLC和电泳的双重性质, 可通过改变电压来增加分离的选择性。图 2中, 由于毛细管中电渗流方向和外加电压方向一致, 随电压增加, 维生素B2等物质的保留时间缩短; 同时由于分离对象所带电荷不同, 电压对其电泳速度的影响不完全一样, 因而维生素B2与右侧相邻降解产物峰的分离度随着电压增加也有所增加, 体现了加压毛细管电色谱的双重分离机理。

图 2 电压对pCEC-LIF分离维生素B2及其光解产物的影响 Fig. 2 Effects of voltage on separation of vitamin B2 and its photolysis products by pressurized capillary electrochromatography-laser induced fluorescence (pCEC-LIF) detection Column dimension:150 mm×100 μm, 1.8 μm, C18;mobile phase A:H2O, containing 0.1% (v/v) trifluoroacetic acid(TFA), pH 2;mobile phase B:acetonitrile, containing 0.1% (v/v) TFA.Gradient elution:0 min, 30%B; 0-15 min, 30%B to 90%B; 15-20 min, 90%B.LIF excitation wavelength:488 nm; emission wavelength:520 nm; pump flow rate:0.05 mL/min.

在pCEC-LIF最优条件下, 维生素B2溶液的分离如图 3所示。可以看出, 维生素B2对照品(见图 3a)及光解产物光黄素对照品(见图 3b)均显示一个单一的色谱峰。随着光解反应的进行, 维生素B2在水溶液(见图 3c)和PBS(见图 3d)中均开始降解, 并有新的降解产物产生, 但降解峰的个数和强度有所不同。当光照24 h后, 维生素B2在水溶液(见图 3e)和盐溶液(见图 3f)中的色谱峰基本消失, 色谱图中仅存在降解产物的峰。在最优条件下, 维生素B2的多种带荧光的光解产物都得到了很好的分离, 说明我们建立的pCEC-LIF为维生素B2溶液的光降解产物研究提供了一个很好的分析平台。

图 3 维生素B2、光黄素及维生素B2在水溶液和PBS缓冲液中光解不同时间后的pCEC-LIF谱图 Fig. 3 pCEC-LIF electrochromatograms of vitamin B2, lumiflavin and photolysis products of vitamin B2 in aqueous solution and PBS with different exposure time to light (a) vitamin B2 reference standard; (b) lumiflavin reference standard; (c) vitamin B2 in aqueous solution and (d) PBS exposed to light for 2 h, and (e) in aqueous solution and (f) PBS exposed to light for 24 h.
Applied voltage:-9 kV.Other conditions are the same to those in Fig. 2.

本研究使用的是反相色谱柱。而维生素B2的结构如图 4a所示。可以看到, 在异咯嗪环的10号位N原子上所连接的基团上有4个极性较大的羟基, 在反相色谱中保留较弱。而降解产物光黄素如图 4b所示, 在其他结构基本不变的情况下, 其10号位N原子上的基团部分丢失, 虽然相对分子质量变小, 但是极性大的羟基也脱去了, 因而产物分子在相对分子质量减小同时, 极性亦减小, 保留增加, 符合RPLC的保留规律。

图 4 维生素B2及光黄素的结构式 Fig. 4 Structure of vitamin B2 and lumiflavin
2.3 标准曲线及线性

在pCEC-LIF上分别测定1.2节所述维生素B2系列对照溶液, 在该系列对照溶液的浓度范围内, 根据色谱图上的峰面积Y对浓度X(mol/L)绘制标准曲线, 得到回归方程Y=877201X-24602(r＞0.999), 表明方法的线性关系良好。定量限可低至5×10-8 mol/L。连续进样6次, 计算得保留时间的RSD为2.1%, 峰面积的RSD为3.7%。

2.4 维生素B2在不同离子强度溶液中的降解反应

将维生素B2溶解在不同离子强度的PBS中, 在光照不同时间后取样, 基于建好的pCEC-LIF平台进行分析。

考察了不同浓度的缓冲液中, 维生素B2浓度随光照时间的变化(见图 5)。随着光照时间的增加, 维生素B2在所有溶液中的浓度都会逐渐降低, 但在水溶液中的降低程度最小, 且缓冲溶液的浓度越大, 维生素B2的降解越快。

图 5 光照时间对水溶液和PBS中维生素B2浓度变化的影响 Fig. 5 Effect of exposure time to light on the concen-tration change of vitamin B2 dissolved in aqueous solution and PBS

固定光照时间为1 h, 考察了维生素B2的浓度随离子强度的变化(见图 6)。可以看出, 当缓冲液浓度不变时, 维生素B2的降解随离子强度的增加而加快。当离子强度相同时, 缓冲液浓度越大, 维生素B2的降解越快, 这可能是由于磷酸盐在溶液中形成的PO43-、HPO42-、H2PO4-中一种或多种离子对维生素B2降解反应的影响比Cl-大, 具体原因还需进一步探索。

图 6 光照1 h时不同PBS中维生素B2浓度的变化 Fig. 6 Concentration changes of vitamin B2 in different PBS with 1-hour light exposure
2.5 维生素B2光解反应的动力学研究

维生素B2在水溶液中的光解遵从一级反应动力学[10]。故根据动力学方程, 维生素B2初始浓度c0与时间t时的浓度ct有以下关系:

(1)

其中k为表观反应速率常数。

按式(1), 基于pCEC-LIF求得维生素B2在不同离子强度溶液中的k, 如表 1所示。可看出, 磷酸盐浓度越高, 离子强度越大, 维生素B2光解反应的表观反应速率常数越大。

表 1 不同PBS中维生素B2光解的k Table 1 Apparent rate constant of photolysis (k) of vitamin B2 in different PBS

离子强度对溶液中化学反应的影响又称原盐效应。在药物制剂中, 往往加入等渗调节剂、抗氧化剂、pH调节剂, 而这些多为无机盐[18], 产生的离子强度可能会影响药物的降解速度, 影响的定量关系可由过渡态理论导出[19]。

离子强度对药物降解速度的影响符合下式[20]:

(2)

式中, ZA、ZB是反应物在溶液中所带电荷, μ是离子强度, k0是无限稀释下的反应速率常数。式(2)适用于μ较小的体系, 而在离子强度较大的溶液体系中, 式(2)可表示为:

(3)

式中β取决于离子的直径, 并通常可约等为1, 那么与log k应该呈线性关系。

图 7维生素B2在不同浓度PBS中的与log k的关系, 可看出与log k的确呈良好的线性关系, 且斜率为正值。由式(3)可知, 斜率为正表明ZAZB为正, 即维生素B2在该条件下的光解反应属于带相同电荷的离子之间的反应, 此时加入盐使溶液的离子强度增加, 则降解反应速率增加, 这也从理论上证实了本实验的结果。

图 7 不同浓度PBS时与log k的关系 Fig. 7 Plot of versus log k with different concentrations of PBS
3 结论

本研究基于pCEC-LIF平台, 建立了维生素B2及其荧光性分解产物的分析方法, 实现了维生素B2及多种光降解产物的分析。用该联用系统研究了维生素B2在水溶液和PBS中的光解反应速率与离子强度之间的关系。发现维生素B2溶液的光解速率与磷酸盐浓度及离子强度呈正相关性, 动力学计算表明, 该条件下的光解反应是两种带同种电荷的离子之间的反应。因而, 在维生素B2液体制剂的运输、保存和使用过程中, 应注意控制体系的离子强度。

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