随着生命科学、食品安全和环境保护等各个领域的快速发展, 迫切需要建立具有高分辨率、高灵敏度、高分离速度等特性的分析平台。加压毛细管电色谱(pressurized capillary electrochromatography, pCEC)结合了毛细管电泳(CE)和HPLC双重分离机理, 采用电渗流和压力流共同推动流动相, 不受柱内反压的限制^[1], 可以应用比UPLC更小粒径的填料, 实现更高的分离柱效。此外, 电渗流所带来的柱塞型前锋也能够大大减少色谱分离过程中的峰展宽, 进一步提高柱效^[2]。因此, 将亚微米材料和pCEC技术相结合可提供一个新的分析平台。

根据范式方程, 色谱填料分布均匀有助于降低由色谱柱内部路径不一造成的峰展宽。单分散性二氧化硅微球由于形状均一、尺寸可控、表面易功能化等特点, 在色谱填料中具有极大的应用价值。Stöber等^[3]最先利用氨水催化正硅酸乙酯的物理化学方法合成硅颗粒, 该方法由于具有原料廉价、工艺简单、产物单分散性良好等特点, 应用广泛^[4]。

三唑类手性农药是目前广泛应用的一种植物调节剂与杀菌剂, 其对映异构体在生物体内的活性、毒理作用以及代谢等方面的差异性引起了社会的广泛关注^[5]。例如烯唑醇(diniconazole)和烯效唑(uniconazole)的S体表现出植物调节剂的作用, 而R型则表现出较强的杀菌活性^[6]。动物实验表明, 三唑类手性农药对大鼠的肝脏毒性不同, 且已被美国环境保护署列为潜在人类手性致癌物^{[7, 8]}。目前, 手性农药的拆分方法主要有高效液相色谱法(HPLC)^[9-16]和毛细管电色谱法(CEC)^[17-19]。Wang等^[10]使用自制的支链淀粉-三(苯基氨基甲酸酯)色谱柱在HPLC正相色谱模式下于31 min内实现了烯唑醇的分离, 分离度为2.05。Li等^[15]利用Pirkle型Chirex 3020在HPLC模式下将烯效唑、烯唑醇和丙环唑(propiconazole)分别进行单独拆分, 实现了基线分离, 但未实现3种农药的同时拆分和分离。Wan等^[17]采用胶束电动毛细管色谱法同时分离3种手性三唑类农药(包含烯唑醇), 结果显示仅添加单一的环糊精(CD)无法将3种对映体同时分离, 最终在27 mmol/L羟丙基-β-环糊精(HP-β-CD)和3 mmol/L HP-γ-CD二元系统条件下实现了3种手性农药的同时拆分和分离, 分离度大于1.1, 分离时间为22 min。迄今, 还未见有对烯效唑、烯唑醇以及丙环唑等3种手性三唑类农药同时拆分和分离的报道。

本实验室曾对Stöber法进行改进, 合成了亚微米级别的色谱介质^[20], 但合成时间较长, 效率不高。本研究在此基础上, 通过优化实验条件, 在2 h内高效制备出了粒径为420 nm、单分散性良好的亚微米二氧化硅微球, 经C18修饰并填装制备成亚微米反相毛细管色谱填充柱。本文将小粒径色谱填料与pCEC技术相结合, 利用C18固定相的反相作用机理和手性添加剂手性选择机理, 在12 min内成功实现了3种手性农药烯效唑、烯唑醇和丙环唑的同时拆分和分离, 为手性三唑类农药的同时拆分和分离提供一个新的思路和方法。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

TriSep^TM-3000加压毛细管电色谱仪(Unimicro Technologies Inc., 美国); SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司); KQ5200DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司); DF-101S集热式恒温磁力搅拌器(河南巩义市予华仪器有限责任公司); DM36-12马弗炉(上海德恭实业有限公司); XW-80A漩涡混合器(上海青浦沪西仪器厂); TGL-16G高速离心机(上海安亭科学仪器厂); JD200-3电子天平(郑州南北仪器有限公司); Molcell 1805V摩尔细胞型纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司); S-4800场发射扫描电子显微镜(SEM, 日本电子株式会社); Zeta-Sizer ZS-90激光粒度分析仪(英国Malvern仪器有限公司); ASAP2020 M比表面积孔隙度及化学吸附分析仪(Micromeritics Inc., 美国); Vario EL Cube元素分析仪(德国Elementar公司)。

羟丙基-γ-环糊精(HP-γ-CD)、十八烷基三氯硅烷、甲基三氯硅烷购自上海阿拉丁试剂有限公司; 无水乙醇、氨水、甲苯、正硅酸四乙酯(tetraethyl orthosilicate, TEOS)、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠购自国药集团化学试剂公司; 丙酮购自上海凌峰化学试剂有限公司; 乙腈(色谱纯)购自Tedia公司; 烯效唑(批号C1608078, 纯度97.5%)、烯唑醇(批号20150303, 纯度98.8%)和丙环唑(批号K1608036, 纯度97%)均购自上海阿拉丁生化科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 亚微米二氧化硅微球的制备及C18修饰

亚微米二氧化硅微球的合成:根据文献^{[3, 20, 21]}提供的方法, 经过进一步改良, 合成粒径为420 nm的亚微米SiO₂微球:取15 mL 28%的浓氨水、24.75 mL超纯水以及一定量无水乙醇混合液, 倒入150 mL圆底烧瓶内于油浴锅中25 ℃控温磁力搅拌混合均匀。配制7 mL正硅酸四乙酯和一定量无水乙醇至50 mL烧杯中, 超声混匀。将混合液快速倒入圆底烧瓶中, 高速搅拌后, 降低搅拌速度, 于25 ℃下反应2 h。反应结束后, 用浓盐酸调节pH至中性, 加入超纯水多次浮选, 至上层超纯水没有明显的悬浮颗粒。依次用超纯水和无水乙醇洗涤3次, 经220 nm滤膜抽滤后, 转移至坩埚中, 于65 ℃烘箱中干燥, 于马弗炉中煅烧, 备用。

亚微米二氧化硅微球的C18修饰:称取经硝酸活化的SiO₂微球1 g, 转移至50 mL干燥的圆底烧瓶中, 加入无水甲苯25 mL, 超声1.5 h。加入0.2 mL无水吡啶, 2 mL十八烷基三氯硅烷, 常温下磁力搅拌12 h。反应结束后, 依次用甲苯、无水乙醇、丙酮洗涤, 65 ℃真空干燥。取经C18修饰的SiO₂微球1 g, 以1 mL甲基三氯硅烷代替上述十八烷基三氯硅烷, 重复上述C18修饰方法, 对微球进行封尾。

1.2.2 毛细管色谱柱的制备及pCEC分析条件

毛细管色谱柱的装填:截取内径为100 μm的毛细管50 cm, 将C18微球分散液吸入毛细管中, 匀浆法填充, 烧结柱塞和窗口备用。

色谱柱:自制C18毛细管色谱柱(10 cm×100 μm, 420 nm); 定量环:1 μL; 分流比约为2200:1;施加电压:-9.4 kV, 进口端接地, 负极施加于毛细管柱出口端; 流动相:乙腈-20 mmol/L磷酸缓冲液(pH=6.8, 含20 mmol/L HP-γ-CD)(45:55, v/v); 流速:0.04 mL/min; 检测波长:220 nm。

1.2.3 样品制备

精密称取烯效唑、烯唑醇和丙环唑对照品适量, 用甲醇配制成2.5 g/L的储备液, 用0.22 μm微孔滤膜过滤, 置于4 ℃冰箱中备用。

2 结果与讨论

2.1 亚微米二氧化硅微球的制备和表征

2.1.1 亚微米二氧化硅微球合成条件的优化

参考Stöber法^[3], 经过改良, 以大量的乙醇作为溶剂, 用氨水作为反应的催化剂, 以正硅酸乙酯为硅源, 经过水解缩聚生成二氧化硅微球。优化条件下合成的二氧化硅微球, 其扫描电镜图(SEM)见图 1a, 该条件下合成的微球粒径均匀, 表面光滑, 单分散性良好。

图 1

Fig. 1

图 1 二氧化硅微球的扫描电镜图 Fig. 1 Scanning electron microscope (SEM) images of the SiO2 particles a.420 nm particles; b.particles with conglutination; c.cross-section of 420 nm C18 column after using for 300 times.

实验中分别考察了氨水浓度、TEOS浓度对微球的影响。其中, 氨水浓度和TEOS浓度对微球粒径单分散性的影响显著(见表 1)。反应液1~3反映了TEOS浓度对微球粒径的影响, 随着TEOS浓度的增加, 二氧化硅微球粒径显著增加。反应液4~6为氨水浓度对微球粒径的影响, 随着氨水浓度的增加, 微球粒径逐渐增大。但是, 随着氨水浓度和TEOS浓度的增大, 微球的单分散性减弱, 当TEOS或氨水浓度过大时, 出现了微球粘连共生情况(见图 1b)。猜测是因为TEOS和氨水浓度增加提高了水解反应的速度, 生成的三维网络链交织聚合在一起, 聚合度增大, 使微球倾向于团聚, 粒径分布变宽。本实验还考察了水浓度对微球的影响, 水浓度为13 ~22 mol/L时, 微球粒径变化不显著。故本工作的合成条件最终确定为:TEOS浓度为0.31 mol/L, 氨水浓度为2.20 mol/L, 超纯水浓度为13.74 mol/L, 反应时间为2 h。该方法反应时间短, 且所合成的微球粒径非常均匀, 单分散性好。

表 1 (Table 1)

表 1 TEOS浓度与氨水浓度对微球粒径的影响 Table 1 Effects of TEOS and NH4OH concentration on particle size Reaction number Concentration/(mol/L) Particle diameter/nm TEOS NH4OH H2O 1 0.18 2.20 13.74 340±4 2 0.31 2.20 13.74 426±6 3 0.44 2.20 13.74 666 (agglomeration) 4 0.31 1.32 13.74 356±10 5 0.31 2.20 13.74 422±10 6 0.31 3.67 13.74 569 (agglomeration) TEOS:tetraethyl orthosilicate.

表 1 TEOS浓度与氨水浓度对微球粒径的影响 Table 1 Effects of TEOS and NH4OH concentration on particle size

为了进一步考察该合成方法的重现性, 在表 1中Number 2条件下分批次合成二氧化硅微球, 共合成了6批, 通过SEM测得其粒径大小, 计算得到不同批次间的相对标准偏差为4.2%, 说明该方法的重现性良好。

2.1.2 亚微米二氧化硅微球的表征

为了进一步表征二氧化硅微球的单分散性, 采用激光粒度分析仪检测微球的粒径分布。结果(图 2)显示平均粒径为421.1 nm, PDI (particle dispersion index)为0.002, 本条件下制备的PDI值明显小于0.05, 说明微球是均匀的单分散体系。

图 2

Fig. 2

图 2 二氧化硅微球的激光粒度分析仪检测图 Fig. 2 Laser particle analyzer images of the SiO2 particles

所制备亚微米二氧化硅微球的氮气吸附-解吸附曲线和孔径分布图见图 3。可以看出, 其氮气吸附-解吸附曲线中滞后环吸附曲线和脱附曲线分离处的相对压力极低, 说明毛细孔的孔径很小, 而曲线均属于Ⅳ型吸附平衡等温线, 说明这是微球堆积成的介孔结构^[22]。由孔径分布图可以看出, 孔径集中分布在1 nm以内。实验最终测得该二氧化硅微球的比表面积、孔径和总孔容积为13.538 m²/g、0.891 nm和0.019 cm³/g。

图 3

Fig. 3

图 3 SiO2微球的(a)N2吸附-解吸附图和(b)孔径分布图 Fig. 3 (a) N2 adsorption-desorption isotherm plot and (b) pore size distribution curve of the SiO2 particles

该二氧化硅微球为无孔结构, 相比于常规全多孔微球填料具有更好的机械性能。图 1c为使用约300次、柱压为12~18 MPa时420 nm微球毛细管柱横截面的电镜表征图, 可以看出, 亚微米无孔二氧化硅微球填充柱在长时间使用后, 颗粒堆积均匀, 形态规整, 没有出现明显的破损情况。因此, 在较高的压力条件下, 无孔二氧化硅微球的抗压能力强, 机械性能好, 具有良好的长期稳定性和较长的使用寿命。

采用元素分析法, 测定了所制备二氧化硅微球的C含量, 结果为1.62%, 说明C18成功修饰在二氧化硅微球表面。

2.1.3 亚微米毛细管色谱柱的重现性考察

色谱柱的重现性对手性分离效果极为重要。为了考察所制备色谱柱的重现性, 在相同pCEC条件下, 以二苯甲酮作为标记物, 比较了柱间(N=3)和批间(N=3)色谱柱的重现性, 其保留时间的相对标准偏差依次为1.99%和2.03%;以烯效唑作为柱内重现性考察标记物, 重复进样8次, 烯效唑对映体保留时间的相对标准偏差依次为1.00%和1.01%, 峰面积的相对标准偏差依次为2.38%和2.55%。由此可见, 本文所制备的亚微米毛细管色谱柱在pCEC模式下具有良好的重现性。

2.2 三唑类手性农药分离度的影响因素考察

2.2.1 流动相中手性添加剂浓度对分离度的影响

考察了流动相中手性添加剂浓度对3种对映体分离度的影响(见图 4)。可以看出, 随着HP-γ-CD浓度的增加, 烯效唑和烯唑醇对映体的分离度呈现上升趋势, 在HP-γ-CD浓度为20 mmol/L时分离度达到最佳, 说明随着手性添加剂浓度的增加, 溶质分子与环糊精包合作用增强, 分离度增加; 再继续增加环糊精浓度, 分离度降低, 可能是因为体系黏度增大, 影响了分离效果。丙环唑对映体的分离度随环糊精浓度变化不明显, 在10 mmol/L时分离度达到最大, 但仅能达到基本分离, 可能是因为HP-γ-CD对丙环唑的包合作用较弱。

图 4

Fig. 4

图 4 羟丙基-γ-环糊精的浓度对3种对映体分离度的影响 Fig. 4 Effects of HP-γ-CD concentration on resolution of the three enantiomers Column dimension:10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase:ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing HP-γ-CD (40:60, v/v); UV detection wavelength:220 nm; pump flow rate:0.035 mL/min.

2.2.2 乙腈体积分数对分离度的影响

随着乙腈体积分数的增加, 三唑类手性农药的分离度逐渐降低, 见图 5。一方面因为随着乙腈体积分数的增大, 乙腈分子会与溶质分子相互竞争, 从而占据环糊精的内腔, 使其包合能力减弱; 另一方面可能是因为在反相作用机理下, 乙腈体积分数增大, 流动相的洗脱能力增强, 溶质和环糊精之间的作用时间减短, 使得包合作用减弱, 分离度降低。考虑到继续降低乙腈含量, 流动相的洗脱能力会减弱, 从而使得出峰时间延长, 故不再继续降低乙腈含量。选择35%乙腈体积分数作为进一步优化其他实验条件的基础。

图 5

Fig. 5

图 5 乙腈体积分数对3种对映体分离度和保留时间的影响 Fig. 5 Effects of ACN volume percentage on resolution and retention time of the three enantiomers Column dimension:10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase:ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD; applied voltage:-4 kV; UV detection wavelength:220 nm; pump flow rate:0.04 mL/min.

2.2.3 施加电压对手性分离的影响

pCEC模式下, 迁移行为同时被压力和电渗流驱动, 当在毛细管的入口端接零极, 出口端接负极, 施加负电时, 电渗流和压力流方向一致, 可以达到快速分离的效果。图 6为3种对映体在不同电压下的分离色谱图, 当施加电压为0 kV(cLC模式)时, 出峰极慢; 当施加-2 kV到-7 kV电压时, 分离时间显著缩短, 分离度先提高, 随后降低, 在-6 kV时达到最大分离度(见表 2)。施加电压后, 分离度和柱效一开始提高的原因是柱塞型电渗流驱动力逐步增强, 而抛物线形压力流驱动力逐渐降低。当施加压力达-6 kV时, 两者达到最好的结合效果, 分离度达到最大值; 随着电压进一步增大, 分离度下降, 可能是由于样品和手性添加剂的作用时间减少。

图 6

Fig. 6

图 6 施加电压对3种对映体分离度的影响 Fig. 6 Effects of applied voltage on resolutions 1.uniconazole; 2.diniconazole; 3.propiconazole. Column dimension:10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase:ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=7.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD (35/65, v/v); applied voltage:0 to-7 kV; UV detection wavelength:220 nm; pump flow rate:0.04 mL/min.

表 2 (Table 2)

表 2 施加电压对3种对映体分离度的影响 Table 2 Effects of applied voltage on resolutions of the three enantiomers Compound Resolution 2 kV 4 kV 6 kV 7 kV Uniconazole 2.53 2.77 2.92 2.71 Diniconazole 2.23 2.49 2.73 2.62 Propiconazole 1.40 1.71 1.92 1.92

表 2 施加电压对3种对映体分离度的影响 Table 2 Effects of applied voltage on resolutions of the three enantiomers

2.2.4 缓冲盐浓度和pH对分离度的影响

缓冲盐浓度和pH对分离效果的影响主要体现在对焦耳热和分离度两方面^{[23, 24]}的影响。本实验选用磷酸盐作为缓冲盐体系, 考察了盐浓度及pH对分离度的影响。其中, 磷酸盐浓度在10~30 mmol/L时对分离度影响不大, 但浓度越大, 产生的焦耳热也越大, 而浓度太小又不利于电渗流的稳定, 考虑后续施加电压的需要, 将缓冲盐浓度确定为20 mmol/L。

同样, 考察了磷酸盐缓冲液的pH对分离度的影响。如图 7所示, 与pH 7.8相比, pH为6.8时, 烯效唑和烯唑醇的分离度显著提高, pH对丙环唑的分离度影响不大。由于pH过低会抑制电渗流, 不利于样品的快速分离, 综合考虑, 我们最终选择pH 6.8作为3种对映体同时分离的最佳条件。

图 7

Fig. 7

图 7 pH对3种对映体分离度的影响 Fig. 7 Effects of pH on resolutions 1.uniconazole 2.diniconazole 3.propiconazole. Column dimension:10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase:ACN- 20 mmol/L phosphate buffer containing 20 mmol/L HP-γ-CD (35/65, v/v); applied voltage:-6 kV; UV detection wavelength:220 nm; pump flow rate:0.04 mL/min.

2.2.5 条件优化后的手性分离结果

当流动相pH调整为6.8时, 3对对映体的分离度显著增加, 这时增加流动相中有机相的比例, 提高施加电压, 可以在满足分离度的情况下, 缩短出峰时间, 提高分析效率。

最终确定烯效唑、烯唑醇、丙环唑3种三唑类手性农药的最佳分离条件为:流动相为乙腈-20 mmol/L磷酸盐缓冲溶液(pH=6.8, 含20 mmol/L HP-γ-CD)(45:55, v/v); 泵流速0.04 mL/min; 施加电压为-9.4 kV。在该条件下, 在12 min内实现了3种三唑类手性农药的同时拆分和分离, 相邻两个峰之间的分离度达4.20、12.9、4.41、4.09、1.70, 柱效高达310000 plates/m, 分离谱图见图 8。

图 8

Fig. 8

图 8 3种手性物质的分离色谱图 Fig. 8 Chromatogram of three enantiomers 1.uniconazole 2.diniconazole 3.propiconazole. Column dimension:10 cm (effective length)×100 μm; mobile phase:ACN-20 mmol/L phosphate buffer (pH=6.8) containing 20 mmol/L HP-γ-CD (45/55, v/v); applied voltage:-9.4 kV; UV detection wavelength:220 nm; pump flow rate:0.04 mL/min.

3 结论

本工作通过优化合成条件, 在2 h内制备出了单分散性良好的亚微米二氧化硅微球, 经C18修饰后填充于毛细管中, 制备出粒度均匀的亚微米填充毛细管色谱柱。通过流动相添加剂的手性选择作用在pCEC平台上对手性三唑类农药进行同时拆分和分离研究。该研究实现了在12 min内对烯效唑、烯唑醇和丙环唑的同时拆分和分离, 相邻两个峰之间的分离度达4.20、12.9、4.41、4.09、1.70。该方法以pCEC为平台, 结合亚微米色谱柱的优势, 为多种手性农药的同时分离研究提供了新的思路和方法, 取得了较好的分离效果。

参考文献

[1]	Qu Q, Lu X, Huang X, et al. Electrophoresis, 2006, 27(20): 3981. doi: 10.1002/(ISSN)1522-2683
[2]	Chen C G, Xue Y, Zhu W J, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2015, 43(10): 1505. 陈长功, 薛芸, 祝文君, 等. 分析化学, 2015, 43(10): 1505. doi: 10.11895/j.issn.0253-3820.150455
[3]	Stöber W, Fink A, Bohn E, et al. J Colloid Interf Sci, 1968, 26: 62. doi: 10.1016/0021-9797(68)90272-5
[4]	Wang J X, Zhang Q Y, Miao Z H, et al. Journal of Materials Science and Engineering, 2008, 26(5): 798. 王纪霞, 张秋禹, 苗振华, 等. 材料科学与工程学报, 2008, 26(5): 798.
[5]	Liu W, Gan J, Schlenk D, et al. P Natl Acad Sci USA, 2005, 102(3): 701.
[6]	Zhang Y C, Li Z Y, Li Q L, et al. Agrochemicals, 2009, 48(9): 629. 张艳川, 李朝阳, 李巧玲, 等. 农药, 2009, 48(9): 629.
[7]	Crowell S R, Henderson W M, Kenneke J F, et al. Toxicol Lett, 2011, 205(2): 154. doi: 10.1016/j.toxlet.2011.05.1036
[8]	Goetz A K, Dix D J. Toxicol Sci, 2009, 110(2): 449. doi: 10.1093/toxsci/kfp098
[9]	Zeng C, Li L S, Cheng B P, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(3): 314. 曾春, 李来生, 程彪平, 等. 色谱, 2016, 34(3): 314.
[10]	Wang P, Liu D, Jiang S, et al. Chirality, 2007, 19(2): 114. doi: 10.1002/(ISSN)1520-636X
[11]	Liu C, Wang B, Xu P, et al. J Agric Food Chem, 2014, 62(2): 360. doi: 10.1021/jf403996g
[12]	Zhang Q, Tian M, Wang M, et al. J Agric Food Chem, 2014, 62(13): 2809. doi: 10.1021/jf405689n
[13]	Li Z Y, Zhang Z C, Zhou Q L, et al. J AOAC Int, 2003, 86(3): 521.
[14]	Cao Z G, Li L S, Cheng B P, et al. Journal of Instrumental Analysis, 2016, 35(1): 16. 曹志刚, 李来生, 程彪平, 等. 分析测试学报, 2016, 35(1): 16.
[15]	Hu W, Xie W, Chen S, et al. J Chromatogr Sci, 2015, 53(4): 612. doi: 10.1093/chromsci/bmu094
[16]	Tian Q, Ren L P, Lü C G, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2010, 38(5): 688. 田芹, 任丽萍, 吕春光, 等. 分析化学, 2010, 38(5): 688.
[17]	Wan A W I, Warno S A, Aboul-Enein H Y, et al. Electrophoresis, 2009, 30(11): 1976. doi: 10.1002/elps.v30:11
[18]	Acunha T, Ibanez C, Garcia-Canas V, et al. Electrophoresis, 2016, 37(1): 111. doi: 10.1002/elps.201500291
[19]	Li J, Ren X H, Feng T, et al. Agrochemicals, 2014, 53(3): 189. 李佳, 任晓慧, 冯涛, 等. 农药, 2014, 53(3): 189.
[20]	Zhang X H, Wan Y, Gu X, et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry, 2011, 39(4): 455. 张晓辉, 王彦, 谷雪, 等. 分析化学, 2011, 39(4): 455.
[21]	Zhang T, Zhang Q, Ge J, et al. J Phys Chem C, 2009, 113(8): 3168. doi: 10.1021/jp810360a
[22]	Shi W J, Tian H J, Xue Y, et al. Chinese Journal of Chromatography, 2016, 34(5): 461. 施文君, 田华君, 薛芸, 等. 色谱, 2016, 34(5): 461.
[23]	Zhang W B, Theoretic Bases of Capillary Electrochromatography[M]. Beijing: Science Press, 2006: 2 张维冰. 毛细管电色谱理论基础[M]. 北京: 科学出版社, 2006: 2
[24]	Breadmore M C, Dawod M, Quirino J P. Electrophoresis, 2013, 34(1): 29. doi: 10.1002/elps.v34.1