多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的碳氢化合物, 是一类持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)。PAHs具有“三致”毒性(致畸、致癌、致突变), 欧盟、美国、中国等都将其列为环境优先控制污染物。因此, 准确评价PAHs的人体暴露水平, 对于环境健康风险评价及毒理学研究具有重要意义[1, 2]。
PAHs通常分布在空气、水体、土壤、食物、烟草烟雾等介质中, 可经呼吸系统、消化系统、皮肤接触等途径进入人体, 经代谢转化为羟基多环芳烃(OH-PAHs), 并以葡萄糖醛酸盐和磺酸盐的形式由尿液排出[3-7]。因此, 国内外常以尿液中的OH-PAHs作为生物标志物来综合评价PAHs的人体暴露水平[8]。常见的OH-PAHs有2-羟基芴(2-FLU)、1-羟基菲(1-OHPe)、3-羟基菲(3-OHPe)和1-羟基芘(1-OHP), 其结构式见图 1。
目前主要采用色谱法分析尿液中的OH-PAHs[1, 8-11], 但是尿液中待测组分的含量较低, 难以检出, 且尿液成分复杂, 杂质干扰严重, 因此在仪器分析前需对样品中的待测物进行富集和净化。尿液中OH-PAHs的前处理方法有液液萃取法(LLE)[12-14]和固相萃取法(SPE)[8]。液液萃取法需要消耗大量的有机溶剂且萃取效率有限; 固相萃取法因具有萃取效率高、有机溶剂消耗少的特点而被广泛应用, 但是目前商品化C18萃取柱往往是一次性的, 使用成本较高。
吸附剂是固相萃取技术的核心, 不仅决定了方法的准确度, 还影响方法的分析时间和成本。聚合物整体柱作为一种应用广泛的吸附分离材料, 通常是通过反应试剂原位聚合而得到的棒状整体, 由于具有结构多孔、比表面积大、生物兼容性好等优点, 已成功用于生物医学、环境科学、食品卫生等领域的样品前处理中[15-17]。本课题组建立了以甲基丙烯酸丁酯为单体的在线净化柱, 结合液相色谱-质谱法, 分析测定了食品中阿维菌素残留[18]。
本实验在注射器空管中构筑甲基丙烯酸丁酯吸附剂, 得到的固相萃取柱用于净化富集尿液中的OH-PAHs, 结合高效液相色谱-荧光检测法(HPLC-FLD), 建立了一种简单、经济的测定尿液中4种OH-PAHs的方法。
Agilent 1200型高效液相色谱-荧光检测器(美国Agilent公司); HSC-12A氮吹仪(天津市恒奥科技发展有限公司); Milli-Q水纯化系统(美国Millipore公司)。
甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate, BMA)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(ethylene dimethacrylate, EDMA)购自上海阿拉丁试剂公司; 正丙醇、聚乙二醇、偶氮二异丁腈购自天津市光复精细化工研究所; β-葡萄糖醛酸酶水溶液(Type HP-2)、甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)(色谱纯)均购自美国Sigma-Aldrich公司。丙酮、乙酸乙酯、磷酸二氢钠、乙酸钠和醋酸均为国产分析纯。
2-FLU(纯度98.0%)购自上海阿拉丁试剂公司; 1-OHPe(纯度98.0%)、3-OHPe(纯度98.0%)购自德国Dr. Ehrenstorfer公司; 1-OHP(纯度98.0%)购自美国Sigma-Aldrich公司。
用MeOH配制待测物的标准储备液, 质量浓度为2 μg/mL, 于4 ℃避光保存; 用水稀释上述标准储备液, 配制成质量浓度为25 ng/mL的标准工作液, 于4 ℃避光保存, 待用。
参照课题组报道的方法在固相萃取模具中合成聚合物整体柱[18]。准确量取单体BMA 160 μL、交联剂EDMA 565 μL、丙醇1 000 μL和聚乙二醇875 μL(均为致孔剂), 加入引发剂偶氮二异丁腈10 mg, 于室温下超声混合、脱气, 取500 μL上述混合液灌入2 mL注射器空柱管中, 将两端密封后于60 ℃水浴反应24 h。反应完成后用甲醇冲洗未反应的单体及致孔剂, 得到聚(甲基丙烯酸丁酯-乙二醇二甲基丙烯酸酯)(poly(BMA-co-EDMA))固相萃取柱。
收集:在8 h工作制下, 对连续工作3天的河北省某地焦炉工人收集晨尿, 于-20 ℃冷冻保存。
将尿液样品解冻, 混匀, 取5.0 mL置于离心管中, 加入10 μL β-葡萄糖醛酸酶、5.0 mL醋酸钠缓冲溶液(pH 5), 于37 ℃避光水解过夜。将水解后的尿液样品以1 500 r/min离心10 min, 取上清液于4 ℃储存待用。
依次用2 mL ACN和水平衡poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱, 然后将3 mL酶解后的尿液样品上样至萃取柱, 用3 mL 25 mmol/L磷酸二氢钠溶液进行淋洗, 最后以2 mL ACN为洗脱液进行洗脱, 收集洗脱液, 于37 ℃氮吹至干, 用甲醇定容至0.25 mL。
色谱柱为Supelcosil LC-PAH柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm, 美国Supelco公司); 流动相为(A)水和(B)ACN; 流速为1 mL/min。梯度洗脱程序:0~6.5 min, 50%B; 6.5~9.0 min, 50%B~55%B; 9.0~20.0 min, 55%B。进样体积为20 μL。
4种OH-PAHs的激发波长(λx)和发射波长(λm): 2-Flu, 266 nm/366 nm; 3-OHPe, 250 nm/358 nm; 1-OHPe, 284 nm/383 nm; 1-OHP, 242 nm/396 nm。
通常尿液中OH-PAHs的前处理主要采用C18固相萃取柱, 但由于OH-PAHs是一类非极性化合物, 本实验采用的poly(BMA-co-EDMA)固相萃取柱, 其聚合物骨架表面的丁基具有疏水性, 可用于固相萃取尿液中的OH-PAHs。为了获得最佳的萃取效率, 实验考察了上样浓度、淋洗液、洗脱液和洗脱体积对萃取效率的影响。
实验考察了上样浓度对萃取效率的影响(见图 2a)。分别以2、10、20和40 ng/mL的加标尿样为考察对象, 按照1.4节操作进行前处理。结果表明, 当质量浓度为2~40 ng/mL时, 4种OH-PAHs的萃取效率为71.0%~103.9%, 随着OH-PAHs质量浓度的增加(10~40 ng/mL), 萃取效率无显著变化。说明固相萃取柱对OH-PAHs具有令人满意的吸附能力, 且表现出良好的萃取容量。
上样后目标化合物和部分杂质同时保留在固相萃取柱上, 而必要的洗涤步骤可以将干扰化合物去除, 使分析物仍保留在萃取柱上, 因此淋洗液的选择至关重要。对3 mL 25 ng/mL的加标尿液样品进行分析, 固定淋洗液体积为3.0 mL, 分别使用MeOH-水(20:80, v/v)、25 mmol/L乙酸铵和25 mmol/L磷酸二氢钠进行淋洗, 2 mL ACN洗脱。如图 2b所示, 当采用25 mmol/L磷酸二氢钠溶液为淋洗液时, 4种OH-PAHs的整体回收率最高, 故选为实验所用。
洗脱液也是影响萃取效率的重要参数。考虑到分析物的溶解度, 考察了MeOH、ACN、丙酮和乙酸乙酯作为洗脱液时4种OH-PAHs的回收率。对3 mL 25 ng/mL的加标尿样进行分析, 用3 mL 25 mmol/L的磷酸二氢钠溶液淋洗, 固定洗脱液体积为2 mL, 分别使用上述4种不同洗脱液进行洗脱。结果如图 2c所示, ACN的洗脱效果最佳, 选为实验所用。
实验同时考察了洗脱体积(1、2和3 mL)对萃取效果的影响(见图 2d)。结果表明, 洗脱体积从1 mL增加到2 mL时, 洗脱效率增加; 继续增加洗脱体积, 洗脱效率无明显变化, 但是大量的洗脱液容易在氮吹、浓缩步骤中导致分析物的损失和时间的增长。因此最终选择2 mL ACN进行洗脱。
在最优条件下, 结合HPLC-FLD, 分别对0.3 ng/mL的加标尿液样品进行直接进样和固相萃取。结果表明, 与OH-PAHs标准溶液的色谱图(见图 3a)相比, 直接进样时未检出OH-PAHs, 且杂质峰明显(见图 3b); 经固相萃取后, OH-PAHs得到富集, 可以看到明显的色谱峰, 且杂质峰明显降低(见图 3c), 说明该方法能够有效去除尿液中的杂质, 富集OH-PAHs。当上样体积为3 mL时, 固相萃取柱对OH-PAHs的富集倍数为6。
对质量浓度为1.2~200.0 ng/mL的OH-PAHs标准溶液进行分析, 对OH-PAHs的峰面积(y)和质量浓度(x, ng/mL)进行线性回归, 建立标准曲线。结果表明, 4种OH-PAHs均表现出良好的线性关系, 相关系数(r)为0.999 1~0.999 7(见表 1)。
在空白尿液中添加不同质量浓度的待测物, 计算方法的检出限(LODs, S/N=3)和定量限(LOQs, S/N=10), 分别为0.06~0.09 ng/mL和0.20~0.30 ng/mL(见表 1)。对同一尿液样品进行分析, 以日内(n=5)和日间(n=3)重复测定得到的色谱峰面积的相对标准偏差(RSD)计算精密度, 日内RSD和日间RSD分别为1.4%~5.3%和2.6%~7.3%。结果表明本方法具有良好的灵敏度和重现性。
采用同一批次(n=5)和不同批次(n=4)合成的固相萃取柱对加标尿液样品进行固相萃取。结果显示, 使用同一批次和不同批次制备的固相萃取柱对4种OH-PAHs进行萃取，得到的色谱图无明显差异, 峰形良好且响应值稳定, 色谱峰面积的RSD分别为2.3%~5.6%和2.9%~7.9%。同时, 使用3根萃取柱分别进行10次重复萃取, 发现萃取效率没有明显下降(RSD≤3.6%)。
在最优实验条件下, 对4名焦炉工人的尿液样品进行分析, 结果见表 2。在4个样品中均有2-Flu、3-OHPe和1-OHP的检出, 质量浓度为1.0~9.5 ng/mL。
为进一步说明方法的可行性, 对4份实际样品进行加标回收试验, 加标水平为3 ng/mL, 加标回收率为78.2%~117.0%, 方法准确度令人满意。
将实验结果与文献方法进行对比(见表 3), 与液液萃取法或基于商品化的C18固相萃取法相比, 本方法灵敏、准确。
本研究采用基于poly(BMA-co-EDMA)整体柱的固相萃取法, 结合HPLC-FLD分析了尿液中4种OH-PAHs。该方法的灵敏度和精密度良好, 同时萃取柱具有良好的稳定性, 相比于传统的商品化固相萃取柱, 该柱能够反复使用, 节约成本。该方法可用于复杂样品中非极性物质的分析。
2018,
Vol. 36 Issue (4): 370-375
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2018,
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